一、用單克隆抗體lF2anti及化ISA雙抗體夾屯、法檢測不同濃度的口蹄疫0型（0/ Mya98/BY/2010)病毒
[0125] 有文獻(xiàn)（NumberandmolecularweightsofFood-and-MouthDiseaseVirus CapsidProteinsandtheEffectsofMaleylation,JournalofVirology, 1971,Vol7,No .2，P250-259)記載，口蹄疫病毒的膜蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4)具有多個(gè)拷貝，因此本發(fā)明 W單克隆抗體lF2anti既為包被抗體又為標(biāo)記抗體來特異性的檢測口蹄疫0型（0/Mya98/ BY/2010)病毒。
[0126] 用單克隆抗體巧2曰11^及化154雙抗體夾屯、法檢測口蹄疫0型（0/%^98/ BY/2010)病毒，檢測方法包括W下步驟：
[0127] 1)包被微孔板：將單克隆抗體lF2anti用抑7. 0-7. 410mMPBS緩沖溶液稀釋成 4yg/mU在酶標(biāo)板的每孔加110yL4°C下包被過夜；傾去包被液，拍干，然后在每孔中加 入300yL1%BSA(在抑7. 0-7. 410mMPBS緩沖溶液中），放入4°C封閉過夜后，拍干，干 燥，真空包裝后備用。
[0128] 2)酶標(biāo)記抗體：采用過艦酸鋼法用辣根過氧化物酶（HR巧標(biāo)記單克隆抗體 lF2anti，具體方法為：稱取3mgHRP溶解于ImL蒸饋水中。于上液中加入0. 12mL新配的 0.IM化1〇4溶液，室溫下避光攬拌20分鐘。將上述溶液裝入透析袋中，對ImMpH4. 4的醋酸 鋼緩沖液透析，4°C過夜。加30y1 0. 2MpH9. 5碳酸鹽緩沖液，使透析后的HRP的pH升高到 9. 0-9. 5,然后立即加入溶解在1血0.OlM碳酸鹽緩沖液中的4mgIgG,室溫避光輕輕攬拌2 小時(shí)。加0. 12血新配的5mg/mLNaBH4溶液，混勻，再置4°C2小時(shí)。將上述溶液裝入透析袋 中，對0.OlM抑7. 2PBS透析，4°C過夜。取出后加入等體積優(yōu)質(zhì)甘油，分裝，-20°C保存，即為 1F2-HRP。用酶標(biāo)記抗體稀釋液按照一定比例稀釋即為酶標(biāo)記抗體工作液。酶標(biāo)記抗體稀釋 液的配方為：化2冊〇4.12&0,2. 9g;胞&口〇4.2&0,0. 296g;化Cl，8. 5g;Proclin300,0. 6血； BSA，IOg;胎牛血清，150血；酶穩(wěn)定劑，5g;Tween-200. 25mL;雙蒸水，定溶至1000 mL;調(diào)整 抑至 7. 6-7. 8。
[0129] 3)與待檢樣品反應(yīng)：向酶標(biāo)板中分別加入口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒梯 度稀釋液100yL/孔，病毒濃度見表3,37°C溫育1小時(shí)。
[0130] 4)洗板并加入酶標(biāo)記抗體：用PBST洗液（配方：胞2冊〇4 ? 12&0 58g，胞&?〇4.2&0 5. 92g，化Cl170g，Tween-205.O血，Proclin3000. 6血，用雙蒸水定溶至1000血，調(diào)整抑值 至7. 2-7. 4 ;使用前用雙蒸水稀釋20倍）洗板5次后，再加入1F2-HRPQ: 1000-1:8000稀 釋）100yL/孔，37°C溫育0. 5小時(shí)。
[013。 5)洗板與顯色：用PBST洗板5次后加入顯色液A(配方為：無水乙酸鋼4. 5g，冰 醋酸1. 2血，過氧化脈0. 8g，用雙蒸水定溶至1000血。）、顯色液B(配方為：巧樣酸1. 62邑， 邸TA-2化0. 372g，甘油100血，四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽0. 50g，用雙蒸水定溶至1000血。）各 50yL/孔進(jìn)行顯色，37°C溫育15min。
[0132] 6)終止反應(yīng)與測量：加入終止液（配方為：1000血雙蒸水中含有98 %硫酸 27. 8血。），50yL/孔，讀數(shù) 0〇4加。
[0133] 檢測結(jié)果如表4所示，可W看出該試劑盒能夠檢測15. 6-500ng/mL范圍的抗原，在 該區(qū)間內(nèi)線性滿足需要，表明該試劑盒具有良好的線性。
[0134] 表4用單克隆抗體lF2anti及化ISA雙抗體夾屯、法檢測口蹄疫0型（0/Mya98/ BY/2010)病毒的結(jié)果
[0136] 二、用單克隆抗體lF2anti及化ISA雙抗體夾屯、法檢測口蹄疫0型（0/Mya98/ BY/2010)病毒的靈敏度檢測
[0137] 用單克隆抗體lF2anti及化ISA雙抗體夾屯、法檢測不同濃度的口蹄疫0型（0/ Mya98/BY/2010)病毒，W確定檢測方法的靈敏度，檢測方法與步驟一相同。
[0138] 不同濃度口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的檢測結(jié)果如表4所示，靈敏度的 擬合曲線如圖4(橫坐標(biāo)表示W(wǎng)10為底的濃度的對數(shù)，縱坐標(biāo)表示W(wǎng)10為底的OD值的對 數(shù)）所示，可W看出能夠?qū)?5. 6ng/mL的抗原與陰性對照區(qū)分開伽值是陰性對照的2倍 W上），而7.Sng/血的OD值與陰性對照區(qū)分不大，因此判斷該試劑盒的檢測靈敏度可達(dá) 15. 6ng/mU表明該試劑盒具有較高的靈敏度。
[0139] S、用單克隆抗體lF2anti及化ISA雙抗體夾屯、法檢測口蹄疫0型（0/Mya98/ BY/2010)病毒的特異性檢測
[0140] 用單克隆抗體巧2曰11^及化154雙抗體夾屯、法檢測口蹄疫0型（0/%曰98/ BY/2010)病毒、口蹄疫 0 型（0/GX/09-7)、亞洲 1 型（J化/06)和A型（Re-A/WH/09)病 毒（病毒均用樣品稀釋液稀釋成4000ng/mL(樣品稀釋液配方：胞2冊〇4? 12&0, 2. 9g; 胞&口〇4.2&0,0. 296g;化Cl，8. 5g;Proclin300,0. 6mL;BSA，IOg;胎牛血清，150mL;硫酸慶 大霉素，2支（8萬單位/支）；雙蒸水，定溶至1000血；調(diào)整抑至7. 6-7. 8。過濾除菌，2-8°C 保存），W確定檢測方法的特異性，檢測方法與步驟一相同。
[014。 口蹄疫0型（0/GX/09-7)、亞洲1型（J化/06)和A型巧e-A/WH/09)病毒檢測結(jié) 果呈陰性，無交叉反應(yīng)，口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒檢測結(jié)果呈陽性，說明W單克 隆抗體lF2anti同時(shí)為包被抗體和標(biāo)記抗體，采用化ISA雙抗體夾屯、法能夠特異性地識別 口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒，與口蹄疫0型（0/GX/09-7)、亞洲1型（J化/06)和A 型巧e-A/WH/09)病毒等其它病毒無任何反應(yīng)。
[0142] 四、制備用ELISA雙抗體夾屯、法檢測口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的試劑 盒
[0143] W單克隆抗體lF2anti作為包被抗體和標(biāo)記抗體，用化ISA雙抗體夾屯、法檢測口 蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒的試劑盒包括W下試劑：
[0144] 1)預(yù)包被微孔板：預(yù)先用單克隆抗體lF2anti按照4yg/mL的濃度預(yù)先包被、封 閉，并密封保存在真空侶錐袋中，每個(gè)試劑盒一塊96孔的微孔板；
[0145] 2)酶標(biāo)記抗體工作液：預(yù)先用辣根過氧化物酶（HR巧或堿性憐酸醋酶（AL巧標(biāo)記 的lF2anti抗體，并用酶標(biāo)記抗體稀釋液稀釋成合適濃度作為工作液，通常為0. 1-1. 0yg/ mL，每個(gè)試劑盒10.OmL。
[0146] 酶標(biāo)記抗體稀釋液配方為：胞2冊〇4 ? 12&0,2. 9g;胞&口〇4 ? 2&0,0. 296g;化Cl， 8. 5g;Proclin300,0. 6血巧SA，IOg;胎牛血清，150血；酶穩(wěn)定劑（購自上海西寶生物科技 有限公司），5g;Tween-200. 25血；雙蒸水，定溶至1000血；調(diào)整抑至7. 6-7. 8。
[0147] 3)稀釋液：用于標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的稀釋，其配方為胞2冊〇4?12&0, 2. 9g; 胞&口〇4.2&0,0. 296g;化Cl，8. 5g;Proclin300,0. 6mL;BSA，IOg;胎牛血清，150mL;硫酸慶 大霉素，2支（8萬單位/支）；雙蒸水，定溶至1000血；調(diào)整抑至7. 6-7. 8。過濾除菌，2-8°C 保存。每個(gè)試劑盒1瓶，25mL/瓶。
[014引 4)洗涂液：為20倍的濃縮洗液，用前稀釋。其配方為：胞2冊04 ? 12&0 58g， NaHzPO* ? 2&0 5. 92g，化Cl170g，Tween-205. 0血，Proclin3000. 6血，用雙蒸水定溶至 1000血，調(diào)整抑值至7. 2-7. 4。每個(gè)試劑盒1瓶，25血/瓶。
[014引 W顯色液A:每個(gè)試劑盒1瓶，7血/瓶。配方為：無水乙酸鋼4. 5g，冰醋酸1. 2血， 過氧化脈0. 8g，用雙蒸水定溶至lOOOmL。
[0150] 6)顯色液B:每個(gè)試劑盒1瓶，7血/瓶。顯色液B配方為：巧樣酸1. 62g， 邸TA-2化0. 372g，甘油100血，四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽0. 50g，用雙蒸水定溶至1000血。
[0151] 8)終止液：每個(gè)試劑盒1瓶，7血/瓶。配方為：1000血雙蒸水中含有98 %硫酸 27.anL。
[0152] 9)標(biāo)準(zhǔn)口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒陽性血清：每個(gè)試劑盒1瓶，1血/瓶。 [015引10)標(biāo)準(zhǔn)口蹄疫0型（0/Mya98/BY/2010)病毒陰性血清：樣品稀釋液可作為陰性 血清使用。
[0154] 實(shí)施例4、用單克隆抗體lF2anti制備的金標(biāo)紙層析測試卡檢測口蹄疫0型（0/ Mya98/BY/2010)病毒
[0155] 1、制備金標(biāo)紙層析試紙
[0156] 如圖5、6所示（圖中5為金標(biāo)紙正面結(jié)構(gòu)圖，圖中6為金標(biāo)紙層析試紙的縱截面 結(jié)構(gòu)圖），用于檢測口蹄疫0型（〇/Mya98/BY/2010)病毒的金標(biāo)紙層析試紙由吸水墊1、硝 酸纖維素膜（NC膜）2、玻璃纖維膜樣品墊3、玻璃纖維素膜結(jié)合物釋放墊4組成，硝酸纖維 素膜2上設(shè)有檢測線燈線）6和質(zhì)控線（C線）5。<