樟芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明有關(guān)于一種棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物，同時(shí)還關(guān)于該棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌 絲體的萃取物在制備抗肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤的生成會(huì)經(jīng)由個(gè)人的行為、年齡、飲食、生活習(xí)慣、遺傳W及環(huán)境所造成，根據(jù) 衛(wèi)生署的數(shù)據(jù)顯示，惡性腫瘤依然為十大死亡原因之首，而通常導(dǎo)致癌癥病人致死的原因， 都是因?yàn)槟[瘤的轉(zhuǎn)移，所W，如何能有效地控制腫瘤細(xì)胞并且抑制其轉(zhuǎn)移，對(duì)治療癌癥是非 常重要的策略之一。
[0003] 棒芝(Antrodiacinnamomea；Syn.AntrodiacamphorataandTaiwanofungus cam地orata)是非常珍貴的藥用真菌。在許多科學(xué)研究中已證實(shí)，棒芝菌絲體的甲醇抽出物 與熱水萃取物、子實(shí)體的甲醇萃取物、己醇萃取物與己酸己醋萃取物具有優(yōu)異的抗發(fā)炎活 性，而也有部分研究指出棒芝的菌絲體與子實(shí)體含有一些環(huán)焼類的化合物，該些化合物具 有抗癌的能力，然而關(guān)于棒芝及其所含的環(huán)焼類化合物參與抗癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制與生理活 性，仍有待更進(jìn)一步的了解。故，一般無(wú)法符合使用者于實(shí)際使用時(shí)所需。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的主要目的在于，克服已知技術(shù)所遭遇的上述問(wèn)題并提供一種棒芝固態(tài)培 養(yǎng)菌絲體的萃取物及其應(yīng)用，該萃取物可抑制肺癌腫瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生，而展現(xiàn)優(yōu)異的抗癌轉(zhuǎn) 移。
[0005]為達(dá)W上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物， 該萃取物按W下列步驟獲?。?br>[0006] (Al)提供一干燥的棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體；
[0007] 度1)將該干燥的棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體于25-4(TC下W10倍體積的95%體積濃度 的己醇萃取。
[0008]本發(fā)明采用的另一種技術(shù)方案是；一種棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物，該萃取物 按下列步驟獲?。?br>[0009] (A2)提供一干燥的棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體；
[0010] 度2)將該干燥的棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體于25-4(TC下W10倍體積的95%體積濃度 的己醇萃取W獲得一己醇萃取物；
[0011] (C2)真空濃縮該己醇萃取物W獲得一濃縮產(chǎn)物；
[0012] 值2)利用100%體積濃度的己酸己醋與水將該濃縮產(chǎn)物分層化W獲得一己酸己 醋萃取物。
[0013] 上述干燥棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的干燥方式為冷風(fēng)干燥。
[0014] 本發(fā)明同時(shí)提供上述提及的萃取物在制備抗肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。所述萃 取物通過(guò)抑制肺癌細(xì)胞移行作用或侵襲作用W抗肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
[0015] 所述萃取物通過(guò)降低磯酸化絲氨酸激酶、基質(zhì)金屬蛋白酶中的明膠分解酶、及增 加巧黏附分子E、金屬蛋白酶抑制劑的表現(xiàn)W抑制該肺癌細(xì)胞的移行作用與侵襲作用。
[0016] 本發(fā)明提及的上述萃取物的分子為2, 3, 6-Trimetho巧-4-methylphenol，其結(jié)構(gòu) 式如下：
[0017]
[0018] 本發(fā)明還提供一種抗肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法，是使受測(cè)對(duì)象與上述的萃取物或 2, 3,G-Trimethoxy-A-meth}^地enol接觸。
[0019] 綜上述，本發(fā)明的棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物具有抗肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功效，更 明確地，本發(fā)明掲露棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物于抗肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的生理活性與作用機(jī) 制，可制備成抗肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移藥物。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1是本發(fā)明棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物L(fēng)eaderl示意圖。
[0021] 圖2是本發(fā)明棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物L(fēng)eaderl影響肺癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率 示意圖。
[0022] 圖3是本發(fā)明棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物L(fēng)eaderl影響肺癌細(xì)胞的細(xì)胞傷口愈 合能力的表現(xiàn)量W意圖。
[0023] 圖4A及圖4是本發(fā)明棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物L(fēng)eaderl影響肺癌細(xì)胞的細(xì) 胞移行能力的表現(xiàn)量示意圖。
[0024] 圖5是本發(fā)明棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物L(fēng)eaderl影響肺癌細(xì)胞的細(xì)胞侵襲能 力的表現(xiàn)量示意圖。
[0025] 圖6A及圖6B是本發(fā)明棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物L(fēng)eaderl影響肺癌細(xì)胞的基 質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2、MMP-9)的表現(xiàn)量示意圖。
[0026] 圖7是本發(fā)明棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物L(fēng)eaderl影響肺癌細(xì)胞中纖溶酶原激 活物的能力的表現(xiàn)量示意圖。
[0027] 圖8A及圖8B是本發(fā)明棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物L(fēng)eaderl影響肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移 的相關(guān)蛋白酶及蛋白表現(xiàn)能力的表現(xiàn)量示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 本發(fā)明是關(guān)于一種棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物及其應(yīng)用，該萃取物抑制肺 癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生，而展現(xiàn)優(yōu)異的抗癌轉(zhuǎn)移功能。該棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物為 2, 3, 6-T;rimetho:xy-4-methylphenol，又稱利得I號(hào)（Xeaderl)。
[0029] 癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過(guò)程，包括了細(xì)胞的黏附（a化esion)、侵入（invasion)W及遷移 (migration)。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移需要基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetallop;roteinases,MMP) 來(lái)分解細(xì)胞外基質(zhì)巧xtracelIutarMatrix,ECM)，并且產(chǎn)生上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換 巧pithelial-MesenchymalTransition,EMT);同時(shí)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白會(huì)大量地表現(xiàn)， 促使癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
[0030] 腫瘤壞死基因（Tumornecrosis化Ctor,TNF)是由巨瞻細(xì)胞分泌的一種小分子蛋 白（C^okine)D其中腫瘤壞死基因-a(TNF-Q)主要由單核-巨瞻細(xì)胞分泌。許多先前的 研究中指出TNF-Q會(huì)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。據(jù)此，當(dāng)運(yùn)用時(shí)，本發(fā)明是WTNF-Q誘 導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞W做為本發(fā)明于棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體參與抗肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的角色探討的 模型。
[0031] W下實(shí)施例僅舉例W供了解本發(fā)明的細(xì)節(jié)與內(nèi)涵，但不用于限制本發(fā)明的申請(qǐng)專 利范圍。
[003引實(shí)施例1 ;實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0033] [材料]
[0034] 本發(fā)明所用的棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體是由中國(guó)臺(tái)灣利得生物科技公司自行培養(yǎng) 的菌絲體。胎牛血清（FetalBovineSerum,FB巧購(gòu)自GibcoBI^LQnvitrogen,Grand Island,NY)。二甲基亞諷值imethylsulfoxide,DMSO)、盤尼西林（penicillin)、喔哇藍(lán) 漠化四哇（3-(4, 5-dimeth}dthiaz〇]_-2-;yl)-2, 5-di地en}dtetrazoliumbromide,MTT)、 吉姆薩（Gimsa)、及酪蛋白（Casein)皆購(gòu)自Sigma-Al化ich(StLouis,MO)。本發(fā)明 所用的所有化學(xué)藥品及溶劑皆為試劑或高效能液相層析化i曲PerhrmanceLiquid Qiromatogra地y,HPLC)等級(jí)。
[00對(duì)[細(xì)胞培養(yǎng)]
[0036] 本發(fā)明選用人類肺癌腫瘤A549細(xì)胞W進(jìn)行腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)探討。關(guān)于A549細(xì) 胞的培養(yǎng)，是首先將生長(zhǎng)于培養(yǎng)瓶（75TFlask)的A549細(xì)胞，W2X105cells/cm2的接種密 度改種于IOcm2培養(yǎng)盤（dish)中，并培養(yǎng)于37°C，5% 0)2培養(yǎng)箱（incubator)中。所使用的 培養(yǎng)液是依據(jù)生物資源保存中必炬ioresourcesCollectionandResearchCenter,BCRC) 與美國(guó)菌種中必（AmericanTypeQiltureCollection,ATCC)的建議選用Ham'sF12 培養(yǎng) 液，并外加10%的胎牛血清。
[0037] 實(shí)施例2 ;本發(fā)明的棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體的萃取物L(fēng)eaderl的制備
[0038] 首先將棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體W冷風(fēng)干燥方式干燥，接著在25C下將2000克前述 經(jīng)冷風(fēng)干燥的棒芝固態(tài)培養(yǎng)菌絲體W10倍體積的95%體積百分比（v/v)的己醇萃取，W得 本發(fā)明的己醇萃取物（ACME)。前述干燥方式可選用所屬領(lǐng)域已知的任何干燥方式，而無(wú)須 加W限定，如冷風(fēng)干燥。
[0039] 接著將該己醇萃取物于真空下（invac州m)濃縮W獲得323. 6公克的濃縮產(chǎn)物。 所得濃縮產(chǎn)物接著W100% (v/v)的己酸己醋與水分層為己酸己醋分離部與水溶性層，其 中該水溶性層系標(biāo)記為水溶性分離部（ACME-water)，而該己酸己醋分離部即為本發(fā)明的己 酸己醋萃取物（ACME-EA)。
[0040] 實(shí)施例3 ;Leade;rl的分離
[0041] 將上述實(shí)施例2中所得的己酸己醋萃取物（ACME-EA)W管柱層析法（COIumn C虹omatography)經(jīng)流動(dòng)相的濃度梯度中劃分為9個(gè)次分離部。其中，該管柱層析法所使 用的固定相為硅膠（230~400mesh)，流動(dòng)相為正己焼/己酸己醋混合液；該濃度梯度是指 依序W正