(2)濃縮稀甲醇提取液：將稀甲醇提取液減壓濃縮得甲醇浸膏266g，在減壓濃縮 過程中回收甲醇；
[0044] (3)萃取：把甲醇浸膏溶于蒸餾水中，再用乙酸乙酯萃取，得稀乙酸乙酯萃取液；
[0045] (4)濃縮稀乙酸乙酯萃取液：將稀乙酸乙酯萃取液減壓濃縮得乙酸乙酯浸膏 (53g)，在減壓濃縮過程中回收乙酸乙酯；
[0046] (5)柱層析分離：將乙酸乙酯浸膏與硅膠拌樣，轉(zhuǎn)入硅膠層析柱，硅膠粒度200~ 300目，用石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑洗脫，石油醚與乙酸乙酯體積比9 :1，將洗脫液進(jìn)行薄 層檢測，濃縮合并類似洗脫流分，靜置，過濾得狹葉鳳尾蕨甲素粗品；
[0047] (6)單體化合物的純化：狹葉鳳尾蕨甲素粗品用甲醇反復(fù)重結(jié)晶得本發(fā)明的狹葉 鳳尾蕨甲素（30mg)。
[0048] 二、結(jié)構(gòu)鑒定
[0049] 狹葉鳳尾蕨甲素的理化性狀如下：白色絮狀固體，易溶于氯仿、乙酸乙酯、丙 酮、甲醇等有機(jī)試劑，熔點(diǎn)為246~248 °C ;光學(xué)活性，[a ] nD-5. 66 ° (c2. 12, MeOH); UV (CH3OH) λ nax204nm ; IR (KBr) v nax 3386cm 1 (-OH);高分辨質(zhì)譜給出分子離子峰 m/z 345. 2405 [M+Na] + (計(jì)算值為345. 2400得出分子式為C2qH34O3)。1H與 13CNMR數(shù)據(jù)見表1，同 時(shí)，通過測定二維H-H相關(guān)譜（1H-1H COSY) JH-13C相關(guān)譜（HMQC) JH-13C遠(yuǎn)程相關(guān)譜（HMBC) 以及旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系NOE譜（ROESY)，確定了所有碳原子和氫原子的信號歸屬及該化合物的化 學(xué)結(jié)構(gòu)（見1-圖6)?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0051 ] 表1.本發(fā)明化合物的1H和13C NMR數(shù)據(jù).
[0052]
[0053] 注：JEOL 500ΜΗΖ; δ化學(xué)位移單位ppm，1H-NMR和13CNMR分別以溶劑中殘存的甲醇 (δ h3. 31ppm)和氘代甲醇為內(nèi)標(biāo)（δ c49. Oppm);核磁共振信號的歸屬是在HMQC、HMBC等二 維譜基礎(chǔ)上完成的。
[0054] 通過分析HMBC圖譜的碳?xì)溥h(yuǎn)程相關(guān)和HSQC碳?xì)溥M(jìn)程相關(guān)以及1H-1H COSY光譜數(shù) 據(jù)（圖7)，3個(gè)連有羥基的碳原子可以被定位。首先，通過已知甲基C-18和C-19氫譜的單 峰信號[ 5"0.93013-18)，0.87013-19)]，和130匪1?中5 ￡51.9(〇相關(guān)推測該碳原子為(：-3， 并通過 H-2 ( δ H3. 87)和 Η2-3 ( δ Hl. 〇7and 1. 72)的1H-1H COSY 相關(guān)確定羥基連于 C-2 上。 HMBC圖譜中的甲基信號C-17( δ Hl. 18)和δ c77. 4以及81. 1相關(guān)推測該碳原子為C-13和 C-16〇
[0055] 在ROESY圖譜中（圖7)，H-2 ( δ η 3. 87)和H2-20相關(guān)推測C-2上的H原子為β 構(gòu)型。Η-5 ( δ η 0· 82)和Η3-18相關(guān)推測Η-5為β構(gòu)型。此外，Η-9 β構(gòu)型的（δ η 0· 96) 是由Η-9和Η-5的相關(guān)信號推測出來的。
[0056] 為了更進(jìn)一步確定化學(xué)結(jié)構(gòu)，將本發(fā)明所述化合物在甲醇中結(jié)晶來得到一個(gè)無色 透明的晶體。通過X-ray衍射儀測試得到其空間結(jié)構(gòu)為PSJJ 1，晶體結(jié)構(gòu)見（圖8).就像 常見的香茶菜屬植物，鳳尾蕨屬植物中所含的貝殼杉烷型二萜化合物全部都為對映構(gòu)型 [7-13].由于相同的生物衍生途徑，本發(fā)明化合物同樣也是一個(gè)對映-貝殼杉烷型的二萜 化合物。因此本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)被確定為對映 -2 β，13 α，16 α -三羥基-貝殼杉烷，并 因此命名為狹葉鳳尾蕨甲素。
[0057] 三、生物活性測定
[0058] 本發(fā)明所述化合物的細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)是通過人的腫瘤細(xì)胞包括KB(表 皮），HCT116 (結(jié)腸），Α549 (肺）和MCF-7 (乳腺）細(xì)胞測試的.然而在20mg/mL并未檢測 到對這些癌細(xì)胞的具有抑制作用。由于非常低的細(xì)胞毒活性，本發(fā)明所述化合物進(jìn)一步測 試了其抗真菌活性。
[0059] 牙菌和足癬的活性實(shí)驗(yàn)（表2)表明本發(fā)明所述化合物在20mg/mL沒有對于 Streptococcus mutans和S. sobrinus兩種真菌的抗微生物活性。
[0060] 表2.化合物對兩種牙菌和足癬的抗微生物活性
[0062] a化合物濃度20mg/mL.
[0063] b化合物濃度10mg/mL.
[0064] ?；衔餄舛?2mg/mL.
[0065] 本發(fā)明所述化合物接著測試了其抗HIV活性：
[0066] IgIC50= Ig最大劑量-Ig(最大劑量/相臨劑量）*(陽性反應(yīng)率之和-(3-最大 陽性反應(yīng)率-最小陽性反應(yīng)率）+4)
[0067] 所用細(xì)胞株為：293T人胚胎腎細(xì)胞和A549人肺上皮細(xì)胞。
[0068] 實(shí)驗(yàn)方法："一石二鳥"法：HIV/VSV_G通過轉(zhuǎn)染3克VSV-G包膜細(xì)胞來進(jìn)行培養(yǎng)。 轉(zhuǎn)染8小時(shí)之后，更換培養(yǎng)媒介為DMEM。48小時(shí)后，收集上清液，通過0. 45 μ M-孔隙尺寸 的過濾器過濾。過濾后的病毒準(zhǔn)備用于感染。將Α549細(xì)胞（人肺上皮細(xì)胞）接種在96孔 板，通過加入20、10、5、2. 5、I. 25、0. 625和0. 3125 μ g/mL的溶液的化合物和190 μ L的病毒 與靶細(xì)胞一起培養(yǎng)。感染48小時(shí)后，裂解細(xì)胞并且使用熒光素酶（Promega)進(jìn)行檢測。其 IC5。值為9. ImM且選擇系數(shù)為12. L詳見表3和圖9.
[0069] 表3狹葉鳳尾蕨甲素對S18。細(xì)胞和H 22細(xì)胞增值的抑制作用
[0071] 總結(jié)：狹葉鳳尾蕨甲素對HIV病毒有抑制作用，可用于研制治療艾滋病的藥物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種對映-貝殼杉烷型二萜化合物，其特征在于：所述化合物化學(xué)名為對 映-2P，13a，16a-三羥基-貝殼杉燒，分子式為C2()H3(j03，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：2. -種如權(quán)利要求1所述的對映-貝殼杉烷型二萜化合物的制備方法，其特征在于： (1) 甲醇冷浸提?。喝￡幐傻莫M葉鳳尾蕨葉，經(jīng)粉碎后用甲醇冷浸提取，減壓濃縮，得 稀甲醇提取液； (2) 濃縮稀甲醇提取液：將稀甲醇提取液減壓濃縮得甲醇浸膏； (3) 萃取：甲醇浸膏用蒸餾水溶解，再用乙酸乙酯萃取，保留乙酸乙酯萃取相，得稀乙 酸乙酯萃取液； (4) 濃縮稀乙酸乙酯萃取液：將稀乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得乙酸乙酯浸膏； (5) 柱層析分離：將乙酸乙酯浸膏與硅膠拌樣，轉(zhuǎn)入層析柱，硅膠粒度200~300目，用 石油醚-乙酸乙酯洗脫液洗脫，將洗脫液進(jìn)行薄層檢測，濃縮合并類似洗脫流分，靜置，過 濾，得粗品。 (6) 單體化合物的純化：粗品用甲醇反復(fù)重結(jié)晶，即得。3. 如權(quán)利要求2所述的對映-貝殼杉烷型二萜化合物的制備方法，其特征在于：所述 步驟（1)中，甲醇濃度為85%~95%，提取次數(shù)為2-4次，每次2-4日。4. 如權(quán)利要求3所述的對映-貝殼杉烷型二萜化合物的制備方法，其特征在于：所述 步驟⑴中，甲醇濃度為95%，提取次數(shù)為3次，每次3日。5. 如權(quán)利要求2所述的對映-貝殼杉烷型二萜化合物的制備方法，其特征在于：所述 步驟⑶中，乙酸乙酯萃取3~4次。6. 如權(quán)利要求2所述的對映-貝殼杉烷型二萜化合物的制備方法，其特征在于：所述 步驟（5)中洗脫劑石油醚-乙酸乙酯的體積比為1 :0、9 :1、7 :1或5 :1。7. 如權(quán)利要求6所述的對映-貝殼杉烷型二萜化合物的制備方法，其特征在于：所述 步驟（5)中洗脫劑石油醚-乙酸乙酯的體積比為9 :1。8. 權(quán)利要求1所述對映-貝殼杉烷型二萜化合物在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求1所述對映-貝殼杉烷型二萜化合物在制備抗HIV藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種對映-貝殼杉烷型二萜化合物及其制備方法和應(yīng)用，具體是從鳳尾蕨科鳳尾蕨屬植物狹葉鳳尾蕨(Pteris？henryi？Chirst)中提取分離得到，稱為狹葉鳳尾蕨甲素。研究證實(shí)，狹葉鳳尾蕨甲素有明顯的抗病毒、抑制HIV病毒的活性。狹葉鳳尾蕨甲素經(jīng)超導(dǎo)核磁共振波譜，高分辨質(zhì)譜，傅立葉變換紅外光譜等多種手段檢測，確定其分子式為C20H34O3，分子量為345.2405，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：。
【IPC分類】C07C35/44, A61P31/18, C07C29/76, A61P31/12
【公開號】CN105218320
【申請?zhí)枴緾N201510631170
【發(fā)明人】潘爐臺, 張宏杰, 張敬杰, 王娟, 李宛霏
【申請人】貴陽中醫(yī)學(xué)院
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年9月29日