）中，對(duì)于多重方式的連接， T7DNA連接酶可以比其它連接酶更高效。也可以使用熱穩(wěn)定的連接酶，如Tth DNA連接酶、 Pfu DNA連接酶、Taq連接酶、任意其它合適的熱穩(wěn)定的連接酶或其任意組合中的一個(gè)或多 個(gè)。
[0138] 在一些實(shí)施方式中，可以在不同核酸片段間設(shè)計(jì)或選擇兩對(duì)或更多對(duì)互補(bǔ)粘性 末端使其具有相同或相似的序列來(lái)促進(jìn)產(chǎn)物的組裝，所述產(chǎn)物含有相對(duì)隨機(jī)排列（和/或 數(shù)量）的具有相似或相同粘性末端的片段。這可以用于產(chǎn)生具有某些內(nèi)部序列區(qū)域的不同 序列排列和/或不同拷貝數(shù)量的核酸產(chǎn)物的庫(kù)。
[0139] 應(yīng)注意為了確保連接特異性，突出端可以被選擇或設(shè)計(jì)為對(duì)每個(gè)連接位點(diǎn)唯一， 即被設(shè)計(jì)為在組裝產(chǎn)物中相鄰的兩個(gè)片段的每對(duì)互補(bǔ)突出端應(yīng)該是唯一的并且與任何其 它對(duì)互補(bǔ)突出端的差異至少1個(gè)核苷酸。
[0140] 也可以使用其它用于產(chǎn)生粘性末端的方法。例如，可以使用基于聚合酶的方法 (例如，T4DNA聚合酶）來(lái)合成需要的粘性末端。無(wú)論用何種方法產(chǎn)生特異性突出端（例 如，用于設(shè)計(jì)在組裝核酸產(chǎn)物中相鄰的核酸的互補(bǔ)突出端），可以設(shè)計(jì)和/或產(chǎn)生不同長(zhǎng)度 的突出端。在一些實(shí)施方式中，可以使用長(zhǎng)單鏈突出端（3'或5'）來(lái)促進(jìn)特異性和/或高效 組裝。例如，3'或5'單鏈突出端可以長(zhǎng)于8個(gè)堿基長(zhǎng)，例如長(zhǎng)8-14、14-20、20-25、25-50、 50-100、100-500個(gè)或更多堿基。
[0141] 高保真組裝
[0142] 按照本發(fā)明的方面，可以在單個(gè)過(guò)程中組裝多個(gè)核酸片段，其中在促進(jìn)片段的共 價(jià)組裝的條件下將多個(gè)片段混合在一起來(lái)產(chǎn)生特異性的較長(zhǎng)核酸。按照本發(fā)明的方面，可 以使用連接酶在體外共價(jià)組裝多個(gè)核酸片段。在一些實(shí)施方式中，可以組裝5個(gè)或更多（例 如，10 個(gè)或更多、15 個(gè)或更多、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50個(gè)或更 多等）不同的核酸片段。然而，應(yīng)理解可以使用合適的組裝技術(shù)組裝任意數(shù)量的核酸（例 如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個(gè)等）。組裝的每個(gè)核酸片段 可以是約100個(gè)核苷酸-約1000個(gè)核苷酸長(zhǎng)（例如，約200、約300、約400、約500、約600、 約700、約800、約900)。然而，可以使用組裝技術(shù)（例如，鳥(niǎo)槍組裝進(jìn)入質(zhì)粒載體）組裝更 長(zhǎng)（例如，約2500個(gè)或更多核苷酸長(zhǎng)、約5000個(gè)或更多核苷酸長(zhǎng)、約7500個(gè)或更多核苷酸 長(zhǎng)、約10000個(gè)或更多核苷酸長(zhǎng)等）或更短的核酸片段。應(yīng)理解每個(gè)核酸片段的大小獨(dú)立 于加入組裝的其它核酸片段的大小。然而，在一些實(shí)施方式中，每個(gè)核酸片段可以是大約相 同的大小或長(zhǎng)度（例如，約100個(gè)核苷酸長(zhǎng)-約400個(gè)核苷酸長(zhǎng)）。例如，寡核苷酸的長(zhǎng)度 可以是中值長(zhǎng)度在約100個(gè)核苷酸長(zhǎng)和約400個(gè)核苷酸長(zhǎng)之間，并且變化范圍為約+/-1個(gè) 核苷酸、+/-4個(gè)核苷酸、+/-10個(gè)核苷酸。應(yīng)理解雙鏈核酸片段的長(zhǎng)度可以由堿基對(duì)的數(shù)量 來(lái)表示。如本文所用，當(dāng)稱為"X"個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核酸片段用于雙鏈核酸片段的內(nèi)容中時(shí)對(duì) 應(yīng)于"X"個(gè)堿基對(duì)的長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方式中，在一個(gè)反應(yīng)中組裝的一個(gè)或多個(gè)核酸（例 如，1-5、5-10、10-15、15-20個(gè)等）可以是密碼子優(yōu)化的和/或非天然存在的。在一些實(shí)施 方式中，在一個(gè)反應(yīng)中組裝的所有核酸都是密碼子優(yōu)化的和/或非天然存在的。
[0143] 在本發(fā)明的一些方面中，組裝的核酸片段被設(shè)計(jì)為具有重疊互補(bǔ)序列。在一些實(shí) 施方式中，核酸片段是具有3'和/或5'單鏈突出端的雙鏈核酸片段。這些突出端可以是 能與不同核酸片段上的互補(bǔ)粘性末端退火結(jié)合的粘性末端。按照本發(fā)明的方面，在兩個(gè)核 酸片段上的互補(bǔ)序列（和特定互補(bǔ)粘性末端）的存在促進(jìn)了它們的共價(jià)組裝。在一些實(shí)施 方式中，組裝了具有不同重疊互補(bǔ)單鏈粘性末端的多個(gè)核酸片段并且通過(guò)在每個(gè)片段上的 粘性末端的特性確定它們?cè)诮M裝的核酸產(chǎn)物中的順序。例如，可以設(shè)計(jì)核酸片段使得第一 核酸具有與第二核酸的第一個(gè)粘性末端互補(bǔ)的第一粘性末端以及與第三核酸的第一個(gè)粘 性末端互補(bǔ)的第二粘性末端。第二核酸的第二個(gè)粘性末端可以與第四核酸的第一個(gè)粘性末 端互補(bǔ)。第三核酸的第二個(gè)粘性末端可以與第五核酸的第一個(gè)粘性末端互補(bǔ)。以此類推至 最后的核酸。按照本發(fā)明的一些方面，可以使用該技術(shù)來(lái)產(chǎn)生含有以預(yù)定線性順序（例如， 第一、第二、第三、第四，最后）組裝的核酸片段的線性排列。
[0144] 在某些實(shí)施方式中，相鄰核酸片段之間的重疊互補(bǔ)區(qū)域設(shè)計(jì)（或選擇）為有足夠 的差異以促進(jìn)（例如，熱力學(xué)上有利）核酸片段的獨(dú)特排列（例如，選定或設(shè)計(jì)的片段排 列）。令人驚訝地，在合適的連接條件下，少至一個(gè)核苷酸的差異在完美匹配（100%互補(bǔ)粘 性末端）和錯(cuò)配（低于100%的互補(bǔ)粘性末端）之間產(chǎn)生足夠的區(qū)分力。如此，4-堿基突 出端允許高至（4~4+1) = 257個(gè)不同片段的高特異性和高保真連接。
[0145] 應(yīng)理解可以使用不同長(zhǎng)度的重疊區(qū)域。
[0146] 在一些實(shí)施方式中，當(dāng)組裝較大數(shù)量的核酸片段時(shí)，可以使用較長(zhǎng)的粘性末端。較 長(zhǎng)的粘性末端可以提供更多的靈活性來(lái)設(shè)計(jì)或選擇充分區(qū)別的序列來(lái)區(qū)分正確粘性末端 退火（例如，涉及設(shè)計(jì)互相退火結(jié)合的粘性末端）和錯(cuò)誤粘性末端退火（例如，在非互補(bǔ)粘 性末端之間）。
[0147] 為了實(shí)現(xiàn)這樣的高保真組裝，可以使用一個(gè)或多個(gè)合適的連接酶。
[0148] 連接酶可以獲自重組或天然來(lái)源。在一些實(shí)施方式中，可以使用T3DNA連接酶、 T4DNA連接酶、T7DNA連接酶和/或大腸桿菌DNA連接酶。這些連接酶可以在相對(duì)低的溫 度下（例如，室溫）使用并且特別用于相對(duì)短的突出端（例如，約3、約4、約5或約6個(gè)堿 基的突出端）。在某些連接反應(yīng)（例如，室溫下30分鐘的孵育）中，對(duì)于多重方式的連接， T7DNA連接酶可以比其它連接酶更高效。也可以使用熱穩(wěn)定的連接酶，如Tth DNA連接酶、 Pfu DNA連接酶、Taq連接酶、任意其它合適的熱穩(wěn)定的連接酶或其任意組合中的一個(gè)或多 個(gè)。
[0149] 在一些實(shí)施方式中，可以在不同核酸片段間設(shè)計(jì)或選擇兩對(duì)或更多對(duì)互補(bǔ)粘性末 端使其具有相同或相似的序列來(lái)促進(jìn)含有相對(duì)隨機(jī)排列（和/或數(shù)量）的具有相似或相同 粘性末端的片段的產(chǎn)物的組裝。這可以用于產(chǎn)生具有某些內(nèi)部序列區(qū)域的不同序列排列和 /或不同拷貝數(shù)量的核酸產(chǎn)物的庫(kù)。
[0150] 在一些實(shí)施方式中，混合核酸片段并且用連接酶孵育。應(yīng)理解在促進(jìn)粘性末端的 特異性退火的條件下的孵育可以增加組裝（例如，正確組裝）頻率。在一些實(shí)施方式中，設(shè) 計(jì)具有相似熔解溫度（例如，互相差5°C以內(nèi)）的不同粘性末端，使得在相同的條件下促進(jìn) 所有片段的正確退火。不同溫度可以促進(jìn)正確退火，所述溫度取決于所用粘性末端長(zhǎng)度。 在一些實(shí)施方式中，可以使用約4-約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的粘性末端（例如，約5、約10、約 15、約20、約25或約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度）。孵育溫度可以為約20°C -約50°C (包含，例如室 溫）。然而，可以使用更高或更低的溫度。孵育的長(zhǎng)度可以基于混合在一起的不同核酸的數(shù) 量（和因此不同突出端的數(shù)量）、突出端的長(zhǎng)度、突出端的復(fù)雜度來(lái)優(yōu)化。孵育時(shí)間也可以 取決于退火溫度和混合物中是否存在其它試劑。例如，可以加入核酸結(jié)合蛋白和/或重組 酶（例如，RecA，例如熱穩(wěn)定的RecA蛋白）。
[0151] 所得的核酸復(fù)合物可以在一對(duì)靶序列特異性引物的存在下經(jīng)過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)，來(lái) 擴(kuò)增并且選擇正確的連接產(chǎn)物（例如，靶核酸）。或者，所得的核酸復(fù)合物可以被連接入合 適的載體中并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中用于進(jìn)一步菌落篩選。
[0152] 錯(cuò)誤減少
[0153] 設(shè)計(jì)為具有特定序列的寡核苷酸的制品可包含具有所設(shè)計(jì)序列的寡核苷酸分子 以及含有錯(cuò)誤的寡核苷酸分子（例如，在至少一個(gè)位點(diǎn)上不同于所設(shè)計(jì)序列）。序列錯(cuò)誤可 能包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失、插入、取代（例如，顛換或轉(zhuǎn)換）、倒位、重復(fù)或其兩種或更 多種的任意組合。錯(cuò)誤可能在寡核苷酸合成期間產(chǎn)生。模板寡核苷酸可具有固有錯(cuò)誤，因 其通常為化學(xué)合成（例如以1/100堿基的比例缺失和約1/400堿基的比例錯(cuò)配和插入）。 假定平均錯(cuò)誤率為1/300堿基且平均模板寡核苷酸大小為70堿基，相比參考序列（例如， 感興趣的基因的野生型序列）每4各模板寡核苷酸中有一個(gè)將含錯(cuò)誤。例如，模板寡核苷 酸所含錯(cuò)誤可為錯(cuò)配、缺失或插入。在PCR合成中，錯(cuò)誤保留在合成的寡核苷酸中。其他錯(cuò) 誤可能通過(guò)PCR反應(yīng)引入。
[0154] 應(yīng)理解不同合成技術(shù)可傾向于不同錯(cuò)誤概況和頻率。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)使 用的合成方案，錯(cuò)誤率可能在每個(gè)堿基1/10-1/200個(gè)錯(cuò)誤之間變化。然而，在一些實(shí)施方 式中，可以實(shí)現(xiàn)較低的錯(cuò)誤率。另外，錯(cuò)誤的類型可能取決于使用的合成技術(shù)。例如，在一些 實(shí)施方式中，基于芯片的寡核苷酸合成相比基于柱的合成技術(shù)可能產(chǎn)生相對(duì)更多的缺失。
[0155] 因此，需要錯(cuò)誤矯正的方法進(jìn)行高保真的寡核苷酸合成。在一些實(shí)施方式中，一個(gè) 或多個(gè)寡核苷酸制品可以經(jīng)過(guò)錯(cuò)誤降低或錯(cuò)誤過(guò)濾過(guò)程來(lái)去除含有錯(cuò)誤的寡核苷酸（或 降低其數(shù)量或頻率）?？梢允褂迷撨^(guò)程來(lái)增加寡核苷酸制品中無(wú)錯(cuò)誤寡核苷酸的數(shù)量。進(jìn) 行錯(cuò)誤降低或錯(cuò)誤過(guò)濾的方法可以包含，例如與選擇寡核苷酸雜交、與錯(cuò)配結(jié)合試劑或錯(cuò) 配結(jié)合蛋白結(jié)合或其組合。
[0156] 在一些實(shí)施方式中，錯(cuò)誤校正可以納入合成過(guò)程末期，從而增加未偏離所需序列 的合成寡核苷酸的相對(duì)群。在一些實(shí)施方式中，錯(cuò)誤矯正包括在寡核苷酸擴(kuò)增之后。在其 他實(shí)施方式中，可合成正鏈和負(fù)鏈并且錯(cuò)誤矯正包括在正鏈和負(fù)鏈退火之后。
[0157] 這種錯(cuò)誤校正可包含直接測(cè)序和/或基于校正酶（correcting enzyme)的錯(cuò)誤校 正的應(yīng)用，所述校正酶例如錯(cuò)誤校正核酸酶（如CEL I、CELII)、基于MutS或MutS同源物 結(jié)合或其他錯(cuò)配結(jié)合蛋白（參見(jiàn)，例如國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2010/057405)的錯(cuò)誤校正、本領(lǐng) 域已知的其他錯(cuò)誤校正方式，或其任何組合。在示例性實(shí)施方式中，CEL I和/或CELII可 加入到液體培養(yǎng)基中的寡核苷酸雙鏈體中。CEL I是切割所有錯(cuò)配類型的錯(cuò)配特異性內(nèi)切 核酸酶，例如單核苷酸多態(tài)性、小插入或刪除。內(nèi)切核酸酶的加入引起錯(cuò)配位點(diǎn)或區(qū)域處雙 鏈寡核苷酸的切割。
[0158] 應(yīng)理解合成的寡核苷酸常具有序列錯(cuò)誤。因此，可選擇或篩選寡核苷酸制品以移 除含錯(cuò)誤的分子，如下詳述。含有錯(cuò)誤的寡核苷酸可以是在兩條鏈上都具有錯(cuò)誤的同源雙 鏈體（即在兩條鏈上都有不正確的互補(bǔ)核苷酸、缺失或添加）。
[0159] 在一些實(shí)施方式中，錯(cuò)配識(shí)別可用于控制寡核苷酸合成、基因組裝和長(zhǎng)多核苷酸 構(gòu)建期間生成的錯(cuò)誤。在擴(kuò)增結(jié)合支持物的核酸后，核酸雙鏈體可先經(jīng)過(guò)一輪或多輪熔解 和退火（本文還稱為改組）。在一些實(shí)施方式中，可使用涉及變性和再退火雙鏈核酸的技 術(shù)來(lái)移除序列錯(cuò)誤。在一些實(shí)施方式中，若含各單獨(dú)錯(cuò)誤的核酸以低于相同位置處的序列 正確的核酸的頻率存在于核酸群中，所述含互補(bǔ)錯(cuò)誤的單鏈核酸不太可能再一起退火。而 是，含錯(cuò)誤的單鏈可與不含錯(cuò)誤或含一種或多種不同錯(cuò)誤的互補(bǔ)鏈再退火。因此，含錯(cuò)誤的 鏈可能最終以異源雙鏈體分子的形式存在于再退火的反應(yīng)產(chǎn)物中。無(wú)錯(cuò)誤的核酸鏈可與含 錯(cuò)誤的鏈或其他無(wú)錯(cuò)誤的鏈再退火。再退火的無(wú)錯(cuò)誤鏈在所述再退火樣品中形成同源雙鏈 體。因此，通過(guò)從再退火的寡核苷酸制備物中去除異源雙鏈體分子，可減少含有錯(cuò)誤的核酸 的量或頻率?？墒褂贸ギ愒措p鏈分子的任何適當(dāng)方法，包括色譜、電泳、異源雙鏈分子的 選擇性結(jié)合等。在一些實(shí)施方式中，可使用選擇性（例如特異性）結(jié)合異源雙鏈體核酸分 子的錯(cuò)配結(jié)合蛋白。在一些實(shí)施方式中，該錯(cuò)配結(jié)合蛋白可用于溶液中或者固定在支持物 上的雙鏈寡核苷酸或多核苷酸上。
[0160] 例如，在使用引物（如通用擴(kuò)增引物）的鏈延伸反應(yīng)（如PCR)中，化學(xué)合成的寡 核苷酸可用作模板鏈來(lái)生產(chǎn)互補(bǔ)鏈。所得產(chǎn)物可包括無(wú)錯(cuò)誤的互補(bǔ)鏈（與無(wú)錯(cuò)模板鏈11 互補(bǔ)）和易錯(cuò)擴(kuò)增的互補(bǔ)鏈（與易錯(cuò)模板鏈12互補(bǔ)）。在熔解條件下（如固體支持物或 芯片表面上的溫度增加），互補(bǔ)鏈從模板鏈分離。改組后，可在易錯(cuò)模板鏈和無(wú)錯(cuò)互補(bǔ)鏈之 間可形成異源雙鏈體。然后異源雙鏈體可被組分（例如Surveyor?內(nèi)切核酸酶）識(shí)別并切 害J。后續(xù)將切割的易錯(cuò)雙鏈體移除可得到無(wú)錯(cuò)芯片表面。
[0161] 在一些實(shí)施方式中，使用MutS過(guò)濾方法（例如使用MutS、MutS同源物或其組合） 除去含有錯(cuò)誤的寡核苷酸。應(yīng)理解可利用固相MutS移除錯(cuò)誤。在大腸桿菌中，似乎以二聚 體形式起作用的MutS蛋白作為錯(cuò)配識(shí)別因子發(fā)揮作用。在真核細(xì)胞中，已鑒定到至少三種 MutS同源（MSH)蛋白，即MSH2、MSH3和MSH6,且其形成異源二聚體。例如在釀酒酵母中， MSH2-MSH6復(fù)合物（也稱作MutS α )識(shí)別堿基錯(cuò)配和單核苷酸插入/缺失環(huán)，而MSH2-MSH3 復(fù)合物（也稱作MutS β )識(shí)別最多12-16個(gè)核苷酸的插入/缺失，但其起基本冗余的作用。 錯(cuò)配結(jié)合蛋白可以獲自重組或天然來(lái)源。錯(cuò)配結(jié)合蛋白可為熱穩(wěn)定型。在一些實(shí)施方式中， 可以使用來(lái)自嗜熱微生物的熱穩(wěn)定錯(cuò)配結(jié)合蛋白。熱穩(wěn)定DNA錯(cuò)配結(jié)合蛋白的示例包括但 不限于：Tth MutS(來(lái)自嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus))、Taq MutS(來(lái)自水生棲熱菌 (Thermus aquaticus))、Apy MutS(來(lái)自嗜火液菌（Aquifex pyrophiIus))、Tma MutS(來(lái) 自海棲熱袍菌（Thermotoga maritima))、其同源物、任何其他合適的MutS或其中兩種或多 種的任意組合。
[0162] 已證明獲自不同物種的MutS可對(duì)特定的錯(cuò)配或?qū)Σ煌腻e(cuò)配具有不同的親和 性。在一些實(shí)施方式中，可使用對(duì)不同錯(cuò)配具有不同親和性的不同MutS的組合。
[0163] 在一些實(shí)施方式中，可使用使用一種或多種修復(fù)蛋白的酶復(fù)合物。修復(fù)蛋白的示 例包括但不限于：用于錯(cuò)配識(shí)別的MutS、用于在目標(biāo)鏈上導(dǎo)入缺口的MutH和用于介導(dǎo)MutH 和MutS之間相互作用的MutU其同源物或其任意組合。在一些實(shí)施方式中，錯(cuò)配結(jié)合蛋白 復(fù)合物是MutHLS酶復(fù)合物。
[0164] 在一些實(shí)施方式中，滑動(dòng)夾（sliding clamp)技術(shù)可用于富集無(wú)錯(cuò)誤的雙鏈寡核 苷酸。在一些實(shí)施方式中，MutS或其同源物可與DNA夾蛋白（DNA clamp protein)相互作 用。DNA夾蛋白的示例包括但不限于由dnaN基因編碼的細(xì)菌滑動(dòng)夾蛋白DnaN，其以同源二 聚體的形式發(fā)揮作用。在一些實(shí)施方式中，MutS蛋白（或其同源物）與夾蛋白之間的相互 作用可提高M(jìn)utS在結(jié)合錯(cuò)配中的有效性。
[0165] 在一些實(shí)施方式中，可使用來(lái)自Sl蛋白家族的酶（例如CELI，CELII或其同源物， 如RESI，或其組合）去除含有錯(cuò)誤的寡核苷酸。來(lái)自Sl蛋白家族的酶可識(shí)別堿基錯(cuò)配、插 入和缺失環(huán)。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)僅有的一條或兩條DNA鏈，這類酶可優(yōu)先結(jié)合霍利迪 連結(jié)體，之后切除識(shí)別位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，可以使用Sl蛋白的熱穩(wěn)定等價(jià)物。。
[0166] 在一些實(shí)施方式中，含錯(cuò)誤的寡核苷酸用結(jié)合錯(cuò)配堿基對(duì)的小分子、化學(xué)或無(wú)機(jī) 材料移除。在錯(cuò)配位置，核苷酸堿基對(duì)是超螺旋的并可對(duì)化學(xué)修飾反應(yīng)敏感。可在化學(xué)切 割方法中使用諸如高錳酸、羥胺、賴氨酸和/或五胺釕的材料來(lái)分別修飾錯(cuò)配的胸腺嘧啶 和胞嘧啶。隨后使用哌啶處理所得修飾的DNA以在脫堿基位點(diǎn)處引起切割。在一些實(shí)施方 式中，切割特異性可用二價(jià)鹽監(jiān)控。
[0167] 應(yīng)用
[0168] 本發(fā)明各方面可以用于涉及合成核酸的生成和/或使用的多種應(yīng)用。如本文所 述，本發(fā)明提供了具有提高的效率的組裝合成核酸的方法。所得組裝核酸可以體外擴(kuò)增 (如使用PC