一種兩核苷酸不同步合成測(cè)序分析pcr產(chǎn)物單體型方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種PCR產(chǎn)物單體型分析方法，具體涉及一種兩核 苷酸不同步合成測(cè)序分析PCR產(chǎn)物單體型方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類基因組單體型圖計(jì)劃本身說(shuō)明了單體型研宄的重要性，也為個(gè)體樣本的單體 型分析提供了重要的數(shù)據(jù)庫(kù)。位于一條染色體特定區(qū)域的一組相互關(guān)聯(lián)并傾向于以整體遺 傳給后代的SNP的組合叫作單體型（haplotype)。早期的研宄工作就表明，單體型的分析 可以極大地減少疾病關(guān)聯(lián)研宄的工作量，且提供比SNP基因型分析更大的信息量，有利于 發(fā)現(xiàn)更多的信息。理論上說(shuō)，一個(gè)包含N個(gè)獨(dú)立雙等位基因的SNP區(qū)域中可能存在2n種單 體型，但實(shí)際上，由于缺乏重組和（或）反復(fù)突變，SNP之間常常存在連鎖不平衡的關(guān)系，因 此，單體型的種類不會(huì)超過(guò)（N+1)。對(duì)于二倍體個(gè)體（如單個(gè)人）的DNA樣本分析，一般情 況下就是要從大樣本所包含的可能單體型中找出具體屬于哪一種或者二種單體型。如果 兩個(gè)相鄰SNP位點(diǎn)間有一個(gè)SNP位點(diǎn)為純合型，那么其單體型就很容易判斷。因此，單體型 分析就聚焦在兩個(gè)相鄰雜合型SNP間二種單體型的確定。目前對(duì)于單體型的分析，普遍采 用間接方法是利用多個(gè)SNP分型結(jié)果，以統(tǒng)計(jì)方法推斷，這種方法得到廣泛的應(yīng)用，且用于 構(gòu)建單體型的相關(guān)軟件也非常之多。然而，軟件分析的結(jié)果對(duì)于臨床樣本而言，如果得不 到直接的實(shí)驗(yàn)證實(shí)終宄是不踏實(shí)的，臨床檢測(cè)也很難接受這樣的分析結(jié)果。通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法 得到自然狀態(tài)下真實(shí)的單體型情況需要進(jìn)行單分子測(cè)序（如克隆測(cè)序、高通量測(cè)序等），這 些方法由于成本高，不適于大規(guī)模的個(gè)體樣本分析。對(duì)于常規(guī)PCR產(chǎn)物中包含多個(gè)SNP位 點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)分析單體型方法，均采用一種等位基因特異引物-PCR (AS-PCR)的方法，以第一個(gè) SNP位點(diǎn)為擴(kuò)增起始點(diǎn)，用兩種特異引物將起始為兩種的不同DNA模板分別進(jìn)行擴(kuò)增，然后 分別進(jìn)行測(cè)序，以確定其它SNP位點(diǎn)的堿基信息。然而，這種方法既無(wú)法知道單體型的含量 (需要另外設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定），也不一定適合所有SNP位點(diǎn)的擴(kuò)增，且操作繁瑣、效率不高。 我們知道利用測(cè)序引物在不同模板上發(fā)生不同步合成反應(yīng)，焦測(cè)序技術(shù)不僅能夠分型SNP 位點(diǎn)，同時(shí)也能夠?qū)ζ淠０搴窟M(jìn)行定量分析。沿著這一思路，如果在一個(gè)包含N個(gè)SNP位 點(diǎn)的PCR產(chǎn)物中，這種不同步合成測(cè)序繼續(xù)對(duì)各個(gè)SNP位點(diǎn)的堿基信息進(jìn)行讀取，則除了在 SNP位置提供不同DNA模板的信息外，其它位置由于SNP堿基的錯(cuò)位測(cè)序，也可以提供不同 DNA模板的加和信息，并從這些加和信息中構(gòu)建方程組實(shí)現(xiàn)對(duì)不同DNA模板的含量分析。
[0003] 最近，我們實(shí)驗(yàn)室提出一種基于兩核苷酸實(shí)時(shí)合成測(cè)序的方法，該方法通過(guò)每次 反應(yīng)同時(shí)加入未標(biāo)記的兩種dNTPs實(shí)時(shí)測(cè)序，得到兩組編碼，解碼這兩組編碼便能確定測(cè) 序片段的具體堿基信息（肖鵬峰等，中國(guó)發(fā)明專利：ZL 201210128597. 6)。該方法具有大幅 提高測(cè)序長(zhǎng)度，且測(cè)序得到的測(cè)序信號(hào)強(qiáng)度比傳單核苷酸合成測(cè)序的信號(hào)強(qiáng)等特點(diǎn)。然而， 該發(fā)明專利對(duì)一個(gè)DNA模板樣本需要兩次測(cè)序既增加了操作的瑣碎程度，也增加了分析的 成本，且同步測(cè)序反應(yīng)的信息不能滿足對(duì)單體型的分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種兩核苷酸不同步合 成測(cè)序分析PCR產(chǎn)物單體型的方法，為PCR產(chǎn)物單體型方法提供一種快速、高效、靈敏的分 析方法。
[0005] 技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] -種兩核苷酸不同步合成測(cè)序分析PCR產(chǎn)物單體型方法，步驟包括：1)DNA提?。?2) PCR擴(kuò)增；3)測(cè)序；4)關(guān)聯(lián)分析；
[0007] 所述步驟3)的測(cè)序方法為：同時(shí)加入兩個(gè)不同的核苷酸，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中不同DNA 模板的合成測(cè)序不同步，得到相鄰兩個(gè)SNP位點(diǎn)上不同的測(cè)序信息。
[0008] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟3)的具體方法包括以下步驟：
[0009] 3-1)制備單鏈DNA模板：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與親和素修飾的磁珠反應(yīng)，修飾生物素 的DNA鏈固定到所述磁珠上，在0. 2MNaOH溶液下變性；將未固定的另一條DNA鏈清除；然 后用洗液洗滌，得到固定的單鏈DNA模板；
[0010] 3-2)測(cè)序引物雜交：將測(cè)序引物與所述單鏈DNA模板，在雜交反應(yīng)體系中，80°C下 放置5min，自然冷卻至室溫，完成雜交；
[0011] 3-3)焦測(cè)序：配備焦測(cè)序反應(yīng)體系，與所述步驟3-2)得到的雜交產(chǎn)物混合，按照 循環(huán)加入兩核苷酸方式對(duì)DNA模板進(jìn)行循環(huán)焦測(cè)序反應(yīng)，得到由按照先后順序排列的單個(gè) 測(cè)序反應(yīng)的堿基片段編碼信息。
[0012] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，步驟3-2)中，所述測(cè)序引物是一段與單鏈DNA模板完全互 補(bǔ)的一段序列；所述測(cè)序引物為5' -SEQ ID N0:l-3'所示：5' -ctaaaacgag gaagtattac atc-3'；
[0013]所述雜交反應(yīng)體系的條件為：10mM Tris-HC1，2M NaCl，lmM EDTA，0. 1% Tween20? pH7. 6〇
[0014] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，步驟3-3)中，焦測(cè)序反應(yīng)體系包括pH 7. 7的0.1M Tris-Ac,2mM EDTA,10mM Mg(Ac)2,0.2 %BSA,10mM DTT,10mM APS,0. 4mg/mL PVP,4mM D-luciferin,2U/mL ATP sulfurylase,0. 4mM luciferase，2U/mL apyrase VII，2U/mL DNA 聚合酶I。
[0015] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述循環(huán)加入兩核苷酸方式包括（A+GV(C+T)，（A+C/ (G+T)，（A+TV(C+G)三組中的一組或一組以上的循環(huán)測(cè)序方式；兩核苷酸加入的順序按照 循環(huán)的方式；或按照以四種不同的兩核苷酸為原料，每次加入一種兩核苷酸來(lái)實(shí)施。
[0016] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟3)中，每個(gè)測(cè)序反應(yīng)獲得的測(cè)序信息包括兩核 苷酸種類信息和測(cè)序信號(hào)強(qiáng)度信息，所述測(cè)序信號(hào)強(qiáng)度與合成核苷酸數(shù)目成正比；
[0017] 所述步驟4)中，根據(jù)不同步合成測(cè)序反應(yīng)所得到的兩個(gè)不同SNP位點(diǎn)上的測(cè)序信 息進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，構(gòu)建關(guān)聯(lián)方程式，確定PCR產(chǎn)物單體型及含量；
[0018] 所述關(guān)聯(lián)方程式為：對(duì)于包含任意相鄰兩個(gè)SNP位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，不超過(guò)四種不 同的DNA模板；設(shè)定這四種單體型1、…、i的含量分別為Xl、…、Xi，其中2彡i彡4,且 x:+……+Xi= 1 ;則PCR產(chǎn)物中混合DNA模板單個(gè)測(cè)序反應(yīng)測(cè)序信號(hào)強(qiáng)度f(wàn)n、fn'與Xl、…、 Xi存在下列關(guān)系：（f n_fn'）= …+a:n xi;其中n表示第n次測(cè)序反應(yīng)；fn、fn'分別表 示第n次測(cè)序反應(yīng)的測(cè)序信號(hào)強(qiáng)度與背景值；、…、at分別表示100%單體型DNA序列 1、…、i在第n次測(cè)序反應(yīng)中合成的核苷酸數(shù)目。
[0019] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述SNP位點(diǎn)上的測(cè)序信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析是指兩個(gè)相鄰 SNP位點(diǎn)均是雜合型的單個(gè)樣本的關(guān)聯(lián)分析；
[0020] 若PCR產(chǎn)物中包含若干個(gè)SNP位點(diǎn)的分析，將其分解成相鄰兩個(gè)SNP位點(diǎn)的單體 型關(guān)聯(lián)分析。
[0021] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟2)中，
[0022] 擴(kuò)增條件為：94°C起始變性5min ;35個(gè)熱循環(huán)為：94°C變性30s、61°C退火45s、 72°C延伸45s ;最后72°C延伸7min ;
[0023] PCR擴(kuò)增所用的PCR-條引物為5'端被生物素、氨基，或者丙烯酰胺等基團(tuán)修飾， 能夠與表面修飾親合素、羧基的固相載體反應(yīng)，或者與丙烯酰胺單體聚合反應(yīng)制備單鏈DNA 模板，包括：
[0024] 5' -SEQ ID NO :2_3' 所不：5' -agtctacaga actttgaaag tatgtg-3' ；
[0025] 5' -biotin-SEQ ID NO :3_3' 所不：5' -biotin-ctatgagagc agtcatttga ctttg_3,〇
[0026] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述核苷酸dNTPs合成實(shí)時(shí)合成釋放的檢測(cè)分子是相同 的，所述檢測(cè)分子為化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的焦磷酸鹽、電化學(xué)檢測(cè)的氫離子或者光學(xué)檢測(cè)的熒光 信號(hào)。
[0027] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析指包括單個(gè)樣本PCR產(chǎn)物和混合 樣本PCR產(chǎn)物的分析。
[0028] 有益效果：本發(fā)明提供的兩核苷酸不同步合成測(cè)序分析PCR產(chǎn)物單體型的方法， 應(yīng)用兩核苷酸同時(shí)加入到反應(yīng)中的一次循環(huán)測(cè)序信息，根據(jù)PCR產(chǎn)物中不同DNA模板的合 成測(cè)序不同步，使得相鄰兩個(gè)SNP位點(diǎn)上不同堿基的信息是由不同測(cè)序反應(yīng)所提供。根據(jù) 這些不同步合成測(cè)序反應(yīng)所得到的不同SNP位點(diǎn)上的測(cè)序信息進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，確定PCR產(chǎn) 物單體型。該發(fā)明與傳統(tǒng)AS-PCR相比，具有如下有益效果：
[0029] 1)本發(fā)明在測(cè)序長(zhǎng)度能夠保障的前提下，適合所有包括兩個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物 的單體型分析。相對(duì)于對(duì)傳統(tǒng)AS-PCR對(duì)PCR引物設(shè)計(jì)的限制，本發(fā)明對(duì)PCR引物沒(méi)有限制， 任何包括相鄰兩位點(diǎn)序列的PCR產(chǎn)物均適合分析，拓廣了分析范圍。
[0030] 2)本發(fā)明只需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行一次循環(huán)測(cè)序，相對(duì)于對(duì)傳統(tǒng)AS-PCR方法需要兩次 擴(kuò)增、兩次測(cè)序，本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、可以降低分析成本。
[0031] 3)本發(fā)明能夠?qū)Ψ治龅母鞣N單體型進(jìn)行定量分析，相對(duì)于對(duì)傳統(tǒng)AS-PCR對(duì)PCR產(chǎn) 物進(jìn)行的定性分析，本發(fā)明不但可以進(jìn)行定性、同時(shí)可以進(jìn)行定量分析，為樣本的分析提供 更多的參數(shù)。
[0032] 4)本發(fā)明適合多個(gè)混合樣本的單體型分析，可以直接測(cè)定混合樣本中各個(gè)單體型 的比例，可以用于從大規(guī)模樣本中尋找、篩選核酸標(biāo)志物。
[0033] 5)本發(fā)明直接采用商品化、非標(biāo)記的天然核苷酸進(jìn)行合成測(cè)序，它可以在任何基 于實(shí)時(shí)合成測(cè)序的測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行。
【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1為本發(fā)明方法分析一個(gè)樣本中包含MMP7(U25346)基因A/G(rsll568818)和 C/T(rsll568819)核酸片段的PCR產(chǎn)物的單體型分析測(cè)序結(jié)果；圖中縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度 (au)，橫坐標(biāo)為加入兩核苷酸試劑的順序，其中A= (A+T)，T= (C+G)。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 本發(fā)明利用兩核苷酸不同步合成測(cè)序其測(cè)序長(zhǎng)度的特點(diǎn)，"跟蹤"不同步合成在不 同DNA模板上的測(cè)序位置，并獲取這些不同SNP位點(diǎn)的不同步測(cè)序信息就變得可能。同時(shí) 利用這些不同測(cè)序信息提供不同DNA模板的加和信息，并從這些加和信息中構(gòu)建方程組、 并求解出不同DNA模板的含量，即實(shí)現(xiàn)不同單體型的實(shí)驗(yàn)分析。從而為單體型與疾病的相 關(guān)性研宄，以及實(shí)際樣本的單體型臨床檢測(cè)提供一種新的分析方法。
[0036] 下