專利名稱：增強(qiáng)核酸分子合成的組合物和方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明為分子和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明廣泛地涉及用于增強(qiáng)合成核酸分子，尤其是從富含GC的核酸模板來進(jìn)行合成的化合物、組合物和方法。具體來說，本發(fā)明提供了包含一或多種分子式選自通式Ⅰ和通式Ⅱ的化合物的組合物。優(yōu)選用于本發(fā)明的是4-甲基嗎啉N-氧化物、甜菜堿(羧甲基三甲基銨)、任何氨基酸(或其衍生物)，和/或N-烷基咪唑化合物，比如1-甲基咪唑或4-甲基咪唑。在一個優(yōu)選的方式中，將兩或多種、三或多種、四或多種本發(fā)明所述化合物結(jié)合起來用于促進(jìn)核酸合成。
本發(fā)明還涉及包含一或多種本發(fā)明所述化合物以及一或多種附加成分的組合物，所述附加成分選自(ⅰ)一或多種核酸分子(包括核酸模板)，(ⅱ)一或多種核苷酸，(ⅲ)一或多種聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶以及(ⅳ)一或多種緩沖鹽。
本發(fā)明的化合物和組合物可以用于增強(qiáng)高忠實(shí)度合成核酸分子的方法中，包括經(jīng)由擴(kuò)增(尤其是PCR)、反轉(zhuǎn)錄和測序進(jìn)行合成的方法。本發(fā)明還涉及由這些方法制備的核酸分子、其片段或衍生物，涉及包含這樣的核酸分子、片段或衍生物的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及利用這些核酸分子來制備所需多肽。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明所述組合物或化合物的試劑盒。
相關(guān)技術(shù)基因組DNA在考察一個生物、組織或細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生理時，經(jīng)常希望確定其遺傳學(xué)組成。在脫氧核糖核酸(DNA，它包含在生物的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中)的雙鏈核苷酸堿基序列中編碼著該生物的基因結(jié)構(gòu)(即基因組)。一個特定DNA片段，或基因的遺傳學(xué)內(nèi)容僅在產(chǎn)生由該基因最終編碼的蛋白質(zhì)時才顯現(xiàn)。為了產(chǎn)生蛋白質(zhì)，由聚合酶產(chǎn)生DNA雙螺旋的一個鏈(有義鏈)的互補(bǔ)拷貝，從而得到信使核糖核酸(mRNA)的特異序列。然后由細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成機(jī)制對該mRNA進(jìn)行翻譯產(chǎn)生由該基因編碼的特定蛋白質(zhì)。在基因組中有一些不編碼蛋白質(zhì)的附加序列(即非編碼區(qū))，它們發(fā)揮結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)或未知的一些功能。因此，一個生物或細(xì)胞的基因組是編碼蛋白質(zhì)的基因以及間插的非編碼DNA序列的總和。重要的是，多細(xì)胞生物的每一個體細(xì)胞都含有該生物的全部基因組DNA，除了在病灶性感染或癌癥的情況中可能在特定細(xì)胞的基因組DNA中插入了1或多個異種DNA序列，而在該生物其他未感染細(xì)胞中未插入。但是正如以下提及的，構(gòu)成基因組DNA的基因的表達(dá)在各個細(xì)胞間可以不同。
cDNA和cDNA文庫在一個給定細(xì)胞、組織或生物中，存在著多種mRNA，每一個編碼一個獨(dú)立和特異的蛋白質(zhì)。這個事實(shí)給希望研究組織或細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的研究人員提供了一種有力的工具一可以分離mRNA分子并進(jìn)一步通過各種分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行操作，從而能弄清一個細(xì)胞、組織或生物的全部功能性遺傳學(xué)組成。
研究基因表達(dá)的一個常見方法是制備互補(bǔ)DNA(cDNA)克隆。在這項(xiàng)技術(shù)中，從生物的細(xì)胞或組織提取物中分離該生物的mRNA分子。分離經(jīng)常采用固相層析介質(zhì)，比如已復(fù)合了脫氧胸苷(dT)寡聚物的纖維素或羥磷灰石。因?yàn)樗姓婧薽RNA分子3’末端都含有一段脫氧腺苷(dA)堿基，并且dA能結(jié)合dT，就可以迅速地從組織或細(xì)胞提取物中的其他分子和物質(zhì)中純化出mRNA分子。由這些純化的mRNA分子，可以利用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA拷貝，就產(chǎn)生單鏈cDNA分子。然后可以通過DNA聚合酶的作用將該單鏈cDNA分子轉(zhuǎn)化為原來的mRNA的完整雙鏈DNA拷貝(也就是原來包含在生物的基因組中，編碼所述mRNA的雙鏈DNA序列)。然后可以將蛋白質(zhì)特異性雙鏈cDNA插入質(zhì)粒，再將后者導(dǎo)入宿主細(xì)菌細(xì)胞。使該細(xì)菌細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長，產(chǎn)生一群含有(或者在許多情況中是表達(dá))目的基因的細(xì)菌細(xì)胞。
這個完整的過程，從分離mRNA到將cDNA插入質(zhì)粒再到含有分離基因的細(xì)菌群落的生長稱為“cDNA克隆”。如果cDNA是從許多不同的mRNA制備的，產(chǎn)生的一組cDNA稱為“cDNA文庫”，代表來源細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)存在的不同功能性(即表達(dá)的)基因。這些cDNA文庫的基因型分析能得到它們所來源的生物的許多有關(guān)結(jié)構(gòu)和功能的信息。
DNA擴(kuò)增為了使樣品中的特異DNA序列增加拷貝數(shù)或“擴(kuò)增”，研究人員采用了許多擴(kuò)增技術(shù)。一個常用的擴(kuò)增技術(shù)是Mullis和同事(美國專利4683195；4683202和4800159)描述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“PCR”)。該方法使用了與待擴(kuò)增DNA序列相應(yīng)區(qū)域互補(bǔ)的“引物”序列。將這些引物與過量的核苷酸堿基以及DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)一起加入DNA靶樣品中，引物就通過堿基特異性結(jié)合作用(即腺苷結(jié)合胸腺苷，胞苷結(jié)合鳥苷)結(jié)合到靶序列上。反復(fù)使反應(yīng)體系經(jīng)過升高和降低溫度的循環(huán)(使靶序列上的DNA雙鏈解離，由聚合酶合成每個鏈的互補(bǔ)拷貝以及新互補(bǔ)鏈重新退火)，可以迅速增加特定DNA序列的拷貝數(shù)。
也已經(jīng)建立了用于擴(kuò)增靶核酸序列的其他技術(shù)。例如，Walker等(美國專利5455166；EP0684315)描述了一種叫作鏈取代擴(kuò)增(SDA)的方法，它與PCR的不同之處在于它采用單一溫度，聯(lián)合使用聚合酶/內(nèi)切核酸酶來制備靶DNA序列的單鏈片段，后者然后作為生產(chǎn)互補(bǔ)DNA(cDNA)鏈的模板。Davey等(美國專利5409818；EP0329822)公開了一種替代的擴(kuò)增步驟，稱為基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。與SDA類似，NASBA采用了恒溫反應(yīng)，但它基于利用RNA引物，而非PCR或SDA中的DNA引物來進(jìn)行擴(kuò)增。另一種已知的擴(kuò)增步驟包括Berninger等(美國專利5194370)描述的啟動子連接激活的轉(zhuǎn)錄酶(LAT)。
基于PCR的DNA指紋作圖盡管已有多種擴(kuò)增技術(shù)可供使用，多數(shù)DNA指紋作圖方法利用PCR技術(shù)已確定的方案和自動操作，依賴該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。這種基于PCR的指紋圖譜技術(shù)包括隨機(jī)擴(kuò)增的DNA多態(tài)性(RAPD)分析(Williams,J.G.K等，核酸研究18(22)6531-6535(1990))，任意引物PCR(AP-PCR；Welsh,J.和McClelland,M.,核酸研究18(24)7213-7218(1990))，DNA擴(kuò)增指紋圖譜(DAF；Caetano-Anolles等，生物/技術(shù)9553-557(1991))以及微衛(wèi)星PCR或小衛(wèi)星區(qū)域DNA的定向擴(kuò)增(DAMD；Heath,D.D.等，核酸研究21(24)5782-5785(1993))。所有這些方法都是基于利用任意選擇的引物，通過PCR來擴(kuò)增隨機(jī)DNA片段。
DNA測序通常，有兩種技術(shù)用于核酸測序。在以其兩個創(chuàng)立者命名為“Maxam和Gilbert測序法”的第一種方法(Maxam,A.M.和Gilbert,W.美國科學(xué)院學(xué)報(bào)74560-564,1977)中，將DNA放射性標(biāo)記，分成4份樣品并用選擇性破壞DNA中的特定核苷酸的化學(xué)物質(zhì)處理，在損傷位點(diǎn)裂解分子。通過凝膠電泳將所得片段分成獨(dú)立條帶，并將凝膠對X光膠片曝光就可以從膠片上讀出原始DNA分子的序列。該技術(shù)可用來確定某些復(fù)雜DNA分子的序列，包括靈長動物病毒SV40(Fiers,W.,等，自然273113-120,1978；Reddy,V.B.等，科學(xué)200494-502,1978)和細(xì)菌質(zhì)粒pBR322(Sutcliffe,G.,冷泉港研討會，定量生物學(xué)43444-448,1975)。
更常用的是另外一種根據(jù)創(chuàng)立者命名為“Sanger測序法”(Sanger,F.,和Coulson,A.R.,分子生物學(xué)雜志94444-448,1975)的測序技術(shù)。這種方法利用DNA聚合酶的DNA合成活性，即與含有終止反應(yīng)的雙脫氧核苷三磷酸及一個短引物(其中之一可被可檢測地標(biāo)記)的體系結(jié)合時，能產(chǎn)生一系列特異終止于四種雙脫氧堿基之一的新合成的DNA片段。然后通過凝膠電泳分辨這些片段，并按照上述Maxam和Gilbert測序法確定序列。通過進(jìn)行四個獨(dú)立的反應(yīng)(每次用一種ddNTP)，即使相當(dāng)復(fù)雜的DNA分子也能迅速地確定其序列(Sanger,F.,等，自然265678-695,1977；Barnes,W.,酶學(xué)方法152538-556,1987)。Sanger測序法通常使用大腸桿菌或T7 DNA聚合酶(美國專利4795699)，而近來該技術(shù)改用T7聚合酶的突變體使得在含有不同濃度的四種鏈終止ddNTP的體系中一次反應(yīng)即可完成測序(美國專利4962020和5173411)。對這項(xiàng)技術(shù)的其他改進(jìn)，即減少或消除反應(yīng)體系中影響反應(yīng)的焦磷酸的積累，也已有描述(美國專利5498523)。測定核酸分子序列的其他方法也有描述(見Murray,核酸研究178889,1989；和Craxton,方法酶學(xué)方法的比較，320-25,1991)。
局限性正如以上提到的，忠實(shí)和高保真地拷貝模板核酸分子是擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄和測序中合成核酸分子的關(guān)鍵步驟。然而，采用常規(guī)組合物和方案來進(jìn)行合成經(jīng)常效率很低，因?yàn)檫@些方法傾向于在核酸模板中的某些二級結(jié)構(gòu)(Gerard,G.F.,等，F(xiàn)OCUS11(4)60(1989)；Myers,T.W.,和Gelfand,D.H.,生物化學(xué)307661(1991))和序列(Messer,L.I.等，病毒學(xué)146146(1985)；Abbotts,J.,等，生物化學(xué)雜志16810312-10323(1993))障礙處過早地終止核酸分子的合成。對于那些鳥苷/胞苷含量高(即“富含GC”的模板)以及較大(即長度超過3-5kb的模板)的模板序列更是如此。模板核酸分子中的這些二級結(jié)構(gòu)和序列障礙經(jīng)常出現(xiàn)在均聚體片段中(Messer,L.I.等，病毒學(xué)146146(1985)；Huber,H.E.,等，生物化學(xué)雜志2644669-4678(1989)；Myers,T.W.,和Gelfand,D.H.,生物化學(xué)307661(1991))，且更經(jīng)常是序列而非二級結(jié)構(gòu)障礙(Abbotts,J.,等，生物化學(xué)雜志16810312-10323(1993))。如果能克服這些障礙，合成反應(yīng)中的總核酸產(chǎn)量和全長核酸產(chǎn)物的產(chǎn)量就能提高。
有些報(bào)道已表明調(diào)節(jié)反應(yīng)體系中的離子強(qiáng)度或摩爾滲透壓濃度，尤其是Na+和K+離子濃度，可能象在體內(nèi)的情況那樣影響核酸的體外二級結(jié)構(gòu)和縮合(Le Rudulier,D.等，科學(xué)2241064(1984)；Buche,A.等，生物分子結(jié)構(gòu)動力學(xué)雜志8(3)601(1990)；Marquet,R.和Houssier,C.,生物分子結(jié)構(gòu)動力學(xué)雜志9(1)159(1991)；Buche,A.等，生物分子結(jié)構(gòu)動力學(xué)雜志11(1)95(1993)；Woodford,K.等，核酸研究23(3)539(1995)；Flock,S.等，生物物理雜志701456(1996)；Flock,S.等，生物物理雜志711519(1996)；EP0821059A2)。在某些這類研究中，發(fā)現(xiàn)在含有任何一種天然和合成的滲透壓保持(osmoprotectant)化合物的緩沖溶液中，體外的核酸構(gòu)象和穩(wěn)定性提高，所述化合物包括多糖，比如海藻糖(Carninci,P.等，美國科學(xué)院學(xué)報(bào)95520-524(1998))，某些助溶劑，比如甘油和二甲基亞砜(Varadaraj,K.和Skinner,D.M.,基因1401(1994))；甘氨酸及其衍生物(Buche,A.等，F(xiàn)EBS快報(bào)247(2)367(1989)；Flock,S.等，生物分子結(jié)構(gòu)動力學(xué)雜志13(1)87(1995)；Houssier,C.等，Comp.Biochem.Physiol.117A(3)313(1997))；低分子量胺比如β-丙氨酸、天冬酰胺和胱胺(Kondakova,N.V.等，分子生物學(xué)(Moscow)9(5)742(1975)；Aslanian,V.M.等，Biofizika29(4)564(1984))；以及其他含氮化合物和氨基酸比如脯氨酸、甜菜堿和ectoine(Rees,W.A.等，生物化學(xué)32137-144(1993)；WO95/20682；DE4411588C1；DE4411594C1；Mytelka,D.S.等，核酸研究24(14)2774(1996)；Baskaran,N.等，基因組研究6633(1996)；Weissensteiner,T.和Lanchbury,J.S.,生物技術(shù)21(6)1102(1996)；Rajendrakumar,C.S.V.,等，F(xiàn)EBS快報(bào)410201-205(1997)；Henke,W.,等，核酸研究25(19)3957(1997)；Hengen,P.N.TIBS22225(1997))。甜菜堿和ectoine是許多細(xì)菌和動物細(xì)胞中的天然滲透壓保持物(Chambers,S.T.,等，細(xì)菌學(xué)雜志169(10)4845(1987)；Randall,K.,等，生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)1291(3)189(1996)；Randall,K.,等，生物化學(xué)細(xì)胞生物學(xué)74(2)283(1996)；Malin,G.,和Lapidot,A.,細(xì)菌學(xué)雜志178(2)385(1996)；Gouesbet,G.,等，細(xì)菌學(xué)雜志178(2)447(1996)；Canovas,D.等，細(xì)菌學(xué)雜志178(24)7221(1996)；Canovas,D.等，生物化學(xué)雜志272(41)25794-25801(1997)。
但是本領(lǐng)域仍需要可用于增強(qiáng)核酸分子(尤其是那些富含GC和/或較大的核酸分子)合成的化合物、組合物以及方法。
發(fā)明簡述概括地說，本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)特別是從富含GC的核酸模板合成核酸分子的化合物、組合物及方法。在一個方面，本發(fā)明涉及用于合成核酸分子的化合物和組合物，特別是用于模板介導(dǎo)的合成，諸如擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄和測序反應(yīng)。本發(fā)明的化合物和組合物包含一個或多個具有選自式Ⅰ或式Ⅱ的化學(xué)式的化合物，及其鹽和衍生物。在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明中所用的化合物包括任何一種氨基酸、任何一種糖(單糖或多糖)、任何一種多元醇，或其鹽或衍生物。本發(fā)明的化合物或組合物包括具有式Ⅰ或式Ⅱ中所示化學(xué)式的化合物，或其鹽或衍生物，其中的芳基選自苯基、萘基、菲基、蒽基、茚基、薁基、聯(lián)苯、亞聯(lián)苯基和芴基；其中的鹵基選自氟、氯、溴和碘；其中的烷基選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基，也可能是支鏈烷基；其中的鏈烯基選自乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基和癸烯基，也可能是支鏈烯基；其中的炔基選自乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基和癸炔基，也可能是支鏈炔基；其中的低級烷氧(醚)基是被上述某一個烷基取代的氧。本發(fā)明也涉及這些化合物的鹽及衍生物。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的方面，化合物選自4-甲基嗎啉N-氧化物、甜菜堿、肉堿、ectoine、脯氨酸、甘氨酸、2-哌啶酸、三甲胺N-氧化物、N-烷基咪唑化合物諸如1-甲基咪唑或4-甲基咪唑、平均分子量為約50,000-500,000道爾頓的聚(2-乙基-2-噁唑啉)、平均分子量為約100,000-200,000道爾頓的聚(氯化二烯丙基二甲基銨)，或其鹽或衍生物。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明化合物和一種或多種其他組分的組合物，所述其他組分選自(ⅰ)一種或多種具有核酸聚合酶活性的酶，它們可以是熱穩(wěn)定酶，(ⅱ)一種或多種核苷酸，(ⅲ)一種或多種緩沖鹽，以及(ⅳ)一種或多種核酸分子。按照本發(fā)明的這個方面優(yōu)選的酶可包括DNA聚合酶(諸如Taq,Tne,Tma,Pfu,VENTTM,DEEPVENTTM和TthDNA聚合酶，及其突變型、變體和衍生物)、RNA聚合酶(諸如SP6、T7或T3 RNA聚合酶，及其突變型、變體和衍生物)和逆轉(zhuǎn)錄酶(諸如M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RSV逆轉(zhuǎn)錄酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RAV逆轉(zhuǎn)錄酶、MAV逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶，及其突變型、變體和衍生物)。優(yōu)選這些逆轉(zhuǎn)錄酶的RN ase H活性降低或?qū)嵸|(zhì)降低。
本發(fā)明還涉及合成核酸分子的方法，包括(a)將核酸模板(可能是DNA分子比如cDNA分子，或RNA分子比如mRNA分子)與1或多個(優(yōu)選2個或更多個，3個或更多個，4個或更多個，5個或更多個等)本發(fā)明所述化合物或組合物混合成反應(yīng)體系；和(b)足以產(chǎn)生與全部或部分模板互補(bǔ)的第一核酸分子的條件下溫育反應(yīng)體系。任選本發(fā)明的這類方法包含1或多個附加步驟，比如在足以產(chǎn)生與全部或部分模板充分互補(bǔ)的第二個核酸分子的條件下溫育上面描述的第一核酸分子。本發(fā)明還涉及由這些方法制備的核酸分子，涉及包含這些核酸分子的載體(可以是表達(dá)載體)，涉及包含這些核酸分子或載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及制備多肽的方法，包括在有利于宿主細(xì)胞產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)以上描述的宿主細(xì)胞，以及分離多肽。本發(fā)明還涉及由這些方法制備的多肽。
本發(fā)明還涉及擴(kuò)增核酸分子的方法，包括(a)將核酸模板與1或多個本發(fā)明所述化合物或組合物混合為反應(yīng)體系；和( )在足以擴(kuò)增與全部或部分模板互補(bǔ)的核酸分子的條件下溫育反應(yīng)體系。更具體地說，本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增DNA分子的方法，包括(a)提供第一和第二引物，其中該第一引物與所述DNA分子第一鏈的3’末端或附近的序列互補(bǔ)，第二引物與所述DNA分子第二鏈的3’末端或附近的序列互補(bǔ)；(b)在有一或多種本發(fā)明所述化合物或組合物的情況下，使所述第一引物與第一鏈以及所述第二引物與第二鏈發(fā)生雜交，反應(yīng)條件是保證合成與第一鏈互補(bǔ)的第三DNA分子以及與第二鏈互補(bǔ)的第四DNA分子；(c)使所述第一和第三鏈，以及第二和第四鏈變性；以及(d)重復(fù)步驟(a)到(c)1或多次。
這類條件可包括在有一或多種聚合酶，一或多種核苷酸和/或一或多種緩沖鹽的情況下溫育。本發(fā)明還涉及由這些方法擴(kuò)增的核酸分子。
本發(fā)明還涉及核酸分子的測序方法，包括(a)將待測序的核酸分子與1或多個引物，一或多種本發(fā)明所述化合物或組合物，一或多種核苷酸以及一或多種終止劑混合為反應(yīng)體系；(b)在能有效合成一組與全部或部分待測序分子互補(bǔ)的分子的條件下溫育反應(yīng)體系；以及(c)分離分子群從而確定待測序分子全部或部分的核苷酸序列。本發(fā)明更具體涉及一種DNA分子的測序方法，包括(a)使引物與第一DNA分子雜交；(b)使步驟(a)所述分子與脫氧核苷三磷酸，一或多種本發(fā)明所述化合物或組合物，一或多種終止核苷酸接觸；(c)在能有效合成隨機(jī)一組與所述第一DNA分子互補(bǔ)的DNA分子的條件下溫育步驟(b)所述的反應(yīng)體系，其中所述合成的DNA分子比第一DNA分子短，并且所述合成的DNA分子在其3’端含有一個終止核苷酸；以及(d)按照大小分離所述合成的DNA分子從而能確定所述第一DNA分子的至少部分核苷酸序列。
所述終止核苷酸包括ddNTP、ddATP、ddGTP、ddITP或ddCTP。這類條件可包括在有一或多種DNA聚合酶和/或緩沖鹽的條件下溫育。
本發(fā)明還涉及用于合成核酸分子的試劑盒，該試劑盒包含1或多個含有一或多種本發(fā)明所述化合物或組合物的容器。任選本發(fā)明的這些試劑盒包含一或多種附加成分，其選自一或多種核苷酸、一或多種聚合酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶、合適的緩沖液、一或多種引物以及一或多種終止劑(比如一或多種雙脫氧核苷酸)。
參考以下附圖和說明書，以及權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施方案對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
附圖簡述

圖1是溴化乙錠染色的PCR反應(yīng)體系樣品瓊脂糖凝膠的照片，該樣品是在有所示濃度的脯氨酸、1-甲基咪唑、4-甲基咪唑、甜菜堿或沒有這些助溶劑的情況下擴(kuò)增的。MDNA分子量標(biāo)記。
圖2是溴化乙錠染色的PCR反應(yīng)體系樣品瓊脂糖凝膠的照片，該樣品是在有所示濃度的甜菜堿或MMNO的情況下擴(kuò)增的。MDNA分子量標(biāo)記。
圖3是溴化乙錠染色的各樣品瓊脂糖凝膠的照片，諸樣品是在有或沒有不同組合方式的化合物的情況下擴(kuò)增的3個不同銅綠假單胞擴(kuò)增子(AprD、AprE和AprF)。第1欄1M甜菜堿；第2欄1M TMANO；第3-7欄2M(第3欄)、1M(第4欄)、0.5M(第5欄)、0.4M(第6欄)或0.2M(第7欄)的MMNO；第8欄沒有化合物的對照。MDNA分子量標(biāo)記。
圖4是溴化乙錠染色的各樣品瓊脂糖凝膠的照片，諸樣品是在有或沒有所示濃度的甜菜堿、MMNO、或脯氨酸，于不同反應(yīng)緩沖液條件下PCR擴(kuò)增的p53外顯子10。
圖5是溴化乙錠染色的各樣品瓊脂糖凝膠的照片，諸樣品是在有或沒有所示濃度的甜菜堿、MMNO、或脯氨酸，于不同反應(yīng)緩沖液條件下PCR擴(kuò)增的Dra DNA聚合酶Ⅰ。
圖6是溴化乙錠染色的各樣品瓊脂糖凝膠的照片，諸樣品是在有或沒有以不同比率混合的MMNO和脯氨酸，或者在只有MMNO、脯氨酸或甜菜堿，于不同反應(yīng)緩沖液條件(Mg++濃度)下PCR擴(kuò)增的p53外顯子10。
圖7是溴化乙錠染色的各樣品瓊脂糖凝膠的照片，諸樣品是在有或沒有以不同比率混合的MMNO和脯氨酸，或者在只有MMNO、脯氨酸或甜菜堿，于不同反應(yīng)緩沖液條件(Mg++濃度)下PCR擴(kuò)增的Dra DNA聚合酶Ⅰ。
圖8是溴化乙錠染色的各樣品瓊脂糖凝膠的照片，諸樣品是PCR擴(kuò)增的富含GC的P32D9模板，照片顯示了MMNO和脯氨酸的混合物，或者甜菜堿對最佳退火溫度的影響。
圖9是在有各種濃度甜菜堿或者M(jìn)MNO和脯氨酸的1∶1混合物的情況下，從K562細(xì)胞系基因組經(jīng)PCR擴(kuò)增脆性X位點(diǎn)的樣品的溴化乙錠染色瓊脂糖凝膠照片。第1泳道無助溶劑；第2泳道0.25M；第3泳道0.5M；第4泳道0.75M；第5泳道1M；第6泳道1.25M；第7泳道1.5M；第8泳道1.75M；第9泳道2M。MDNA分子量標(biāo)記。
圖10是在有或無各種濃度的MMNO與脯氨酸的1∶1混合物情況下，經(jīng)PCR擴(kuò)增兩個不同的富含GC的長腺病毒DNA片段樣品的溴化乙錠染色瓊脂糖凝膠電泳照片。第1泳道無助溶劑；第2泳道0.25M；第3泳道0.5M；第4泳道1.0M。MDNA分子量標(biāo)記。
圖11是在有或無各種濃度的MMNO與脯氨酸(A泳道)、甜菜堿(B泳道)、L-肉堿(C泳道)或DL-2-哌啶酸(D泳道)1∶1混合物的情況下，經(jīng)PCR擴(kuò)增K562基因組DNA中富含GC片段的樣品的溴化乙錠瓊脂糖凝膠電泳照片。第1泳道無助溶劑；第2泳道0.25M；第3泳道0.5M；第4泳道1.0M。MDNA分子量標(biāo)記。
圖12是在有或無各種濃度的甜菜堿(A泳道)或ectoine(B泳道)的情況下，經(jīng)PCR擴(kuò)增K562基因組DNA中富含GC片段的樣品的溴化乙錠瓊脂糖凝膠電泳照片。第1泳道無助溶劑；第2泳道0.25M；第3泳道0.5M；第4泳道1.0M。MDNA分子量標(biāo)記。
圖13顯示了可以用于本發(fā)明的許多化合物實(shí)例的結(jié)構(gòu)。
發(fā)明詳述定義在以下的說明書中，廣泛地使用了大量用于重組DNA技術(shù)的術(shù)語。為了清楚和一致地理解說明書和權(quán)利要求書(包括這些術(shù)語適用的范圍)，給出如下定義。
文庫。術(shù)語“文庫”或“核酸文庫”用在此處是指一組代表一種生物的全部或相當(dāng)一部分DNA成分的核酸分子(環(huán)形或線形)(基因組文庫)，或者一組代表細(xì)胞、組織、器官或生物中表達(dá)基因的全部或相當(dāng)一部分的核酸分子(cDNA文庫)。這些文庫可以包含或不包含于1或多個載體中。
載體。在此處“載體”是質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒或噬菌體DNA，或者其他能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，并且其特征在于有1或少量限制性內(nèi)切核酸酶識別位點(diǎn)的DNA分子，在這些位點(diǎn)可以以不損害載體的基本生物學(xué)功能的確定方式將所述DNA序列切割，并插入DNA以便進(jìn)行其復(fù)制和克隆。所述載體還可以包含適用于鑒定轉(zhuǎn)化了載體的細(xì)胞的標(biāo)記物。標(biāo)記物，例如，包括但不限于四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性。
引物。在此處“引物”指在DNA分子的擴(kuò)增或聚合過程中，通過核苷酸單體共價結(jié)合延伸的單鏈寡核苷酸。
模板。此處所用術(shù)語“模板”指待擴(kuò)增、合成或測序的雙鏈或單鏈核酸分子。對于雙鏈分子，優(yōu)選在所述分子擴(kuò)增、合成或測序前將其鏈變性以形成第一和第二鏈，或者可以直接用作模板。對于單鏈模板，在適當(dāng)?shù)臈l件下引物與其所互補(bǔ)的部分模板雜交，然后一或多種聚合酶可以合成與所述模板全部或部分互補(bǔ)的核酸分子?？蛇x擇地，對于雙鏈模板，可以將1或多個啟動子(例如，SP6、T7或T3啟動子)與1或多個聚合酶聯(lián)合使用來制備與全部或部分模板互補(bǔ)的核酸分子。新合成的分子，依照本發(fā)明，可以與原始模板在長度上相同或更短。
摻入。此處所用術(shù)語“摻入”意指成為DNA和/或RNA分子或引物的一部分。
擴(kuò)增?！皵U(kuò)增”用在此處指任何利用聚合酶來提高核苷酸序列拷貝數(shù)的體外方法。核酸擴(kuò)增導(dǎo)致核苷酸摻入DNA和/或RNA分子或引物中從而形成與模板互補(bǔ)的新分子。所形成的核酸分子及其模板可以作為合成另外的核酸分子的模板。在此處，一個擴(kuò)增反應(yīng)可以包括多輪復(fù)制。DNA擴(kuò)增反應(yīng)包括，例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。一次PCR反應(yīng)可以包括5到100輪DNA分子的變性和合成。
寡核苷酸?！肮押塑账帷敝赴矁r連接的核苷酸序列的合成或天然分子，它是在一個核苷酸中脫氧核糖或核糖的3’位點(diǎn)和相鄰核苷酸中脫氧核糖或核糖的5’位點(diǎn)之間通過磷酸二酯鍵結(jié)合。
核苷酸。此處所用“核苷酸”指一種堿基-糖-磷酸結(jié)合體。核苷酸是核酸序列(DNA和RNA)的單體單元。術(shù)語核苷酸包括核糖核苷三磷酸ATP、UTP、CTP、GTP以及脫氧核糖核苷三磷酸比如dATP、dUTP、dITP、dCTP、dGTP、dTTP或者它們的衍生物。這類衍生物包括，例如，[αS]dATP、7-脫氮-dGTP和7-脫氮-dATP，以及能賦予含有它們的核酸分子核酶抗性的核苷酸衍生物。術(shù)語核苷酸用在此處還指雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。雙脫氧核糖核苷三磷酸的例子包括，但不限于，ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。根據(jù)本發(fā)明，核苷酸可以是未標(biāo)記或通過公知技術(shù)可檢測性地標(biāo)記了的?？蓹z測的標(biāo)記包括，例如，放射性同位素、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記和酶標(biāo)。
雜交。術(shù)語“雜交”指兩個互補(bǔ)的單鏈核酸分子(RNA和/或DNA)經(jīng)堿基配對形成雙鏈分子。在這里，兩個核酸分子的堿基配對即使不完全互補(bǔ)，也可以雜交。相應(yīng)地，只要使用本領(lǐng)域公知的合適條件，錯配堿基不防礙兩個核酸分子的雜交。
單位。術(shù)語“單位”用在此處指酶的活性。例如指熱穩(wěn)定的DNA聚合酶時，1個酶活單位是能在標(biāo)準(zhǔn)的DNA引導(dǎo)合成條件下，于30分鐘內(nèi)將10納摩爾dNTP摻入酸不溶物質(zhì)(即DNA或RNA)所需的酶量。
文中使用的重組DNA技術(shù)和分子及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的其他術(shù)語本領(lǐng)域技術(shù)人員一般能理解。
概述總的來講，本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)核酸分子、尤其是富含GC的核酸模板的合成的化合物、組合物及方法。具體地說，本發(fā)明提供了包含一種或多種具有選自式Ⅰ和式Ⅱ的結(jié)構(gòu)式的化合物或其鹽或衍生物的化合物和組合物。按照本發(fā)明，優(yōu)選使用至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個……等等這樣的化合物或組合物。首選使用2-6、2-5、2-4或2-3個這樣的化合物或組合物。本發(fā)明的化合物或組合物可以是鹽的形式。
式Ⅰ 其中A是 其中X是 其中Z可以與Y相同或不同，其中Y和Z各自獨(dú)立地選自-OH、-NH2、-SH、-PO3H、-CO2H、-SO3H和氫；f為0-2的整數(shù)，m為0-20的整數(shù)，e為0-2的整數(shù)；其中R4、R5和R6可以相同或不同，各自獨(dú)立地選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、氨基、巰基、硫醇、鹵、硝基、次氮基、羥基、羥基烷基、羥基芳基、磷酸基(phosphato)、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、羰基、磺?；?、磺基和酰氨基，d為0-2的整數(shù)；其中a、b和c各自獨(dú)立地為0-1的整數(shù)，條件是a、b和c中最多有兩個為0；其中R1、R2和R3可以相同或不同，各自獨(dú)立地選自a)=0；b)
其中R7和W可以相同或不同，各自獨(dú)立地選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、氨基、巰基、硫醇、鹵、硝基、次氮基、羥基、羥基烷基、羥基芳基、磷酸基、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、羰基、磺酰基、磺基和酰氨基；g為0-2的整數(shù)，n為0-20的整數(shù)；其中q可以為1-100,000。
在式Ⅰ化合物中，當(dāng)q=1時，式Ⅰ化合物可以認(rèn)為是一個單體，而當(dāng)q=2-100,000時，式Ⅰ化合物可以認(rèn)為是一個由2-100,000個單體組成的多聚體或聚合物，它們可以具有相同或不同的結(jié)構(gòu)，并且它們可以經(jīng)過一個或多個基團(tuán)由一個或多個鍵相連，形成一個式Ⅰ化合物的多聚體(例如一個聚合物)。
在一個優(yōu)選方面，當(dāng)a、b或c為0時，相應(yīng)的R基團(tuán)是一對電子。
在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)q=1且(R1)a、(R2)b和(R3)c之一為=0而另兩個R基團(tuán)相同或不同、各自獨(dú)立地選自氫、甲基、乙基和丙基時，A不是甲基、乙基或丙基。
式Ⅱ 其中式Ⅱ是飽和或不飽和的；其中q可以為1-100,000；其中X選自N、C、O、P和S；其中Y選自O(shè)、N、S、P、C、-O-NH-、-O-CH2-O-、-O-S-、-O-CH2-S-、-O-CH2-NH-、-NH-S-、-NH-CH2-NH-、-O-CH(CH3)-NH-、-NH-CH(CH3)-NH-、-O-CH(CH3)-O-、-NH-C(CH3)2-NH-、-NH-CH2-S-，以及其他硫醇、磷酸基、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、磺?；?、磺基和酰氨基；其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8可以相同或不同，各自獨(dú)立地選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、氨基、巰基、硫醇、鹵、硝基、次氮基、羥基、羥基烷基、羥基芳基、磷酸基、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、磺酰基、磺基和酰氨基；其中a、b、c、d、e、m、n和o是相同或不同的整數(shù)，a、b、c、d和e各自獨(dú)立地選自0-2，m、n和o各自獨(dú)立地選自0-5。
在式Ⅱ化合物中，當(dāng)q=1時，式Ⅱ化合物可以認(rèn)為是一個單體，而當(dāng)q=2-100,000時，式Ⅱ化合物可以認(rèn)為是一個由2-100,000個單體組成的多聚體或聚合物，它們可以具有相同或不同的結(jié)構(gòu)，并且它們可以經(jīng)過一個或多個基團(tuán)由一個或多個鍵相連，形成一個式Ⅱ化合物的多聚體(例如一個聚合物)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，Y和/或X為N，m、n和o為1。在另一個優(yōu)選方面，Y和/或X為N和/或O，m和n為1，o為2。優(yōu)選地，當(dāng)a、b、c、d和/或e為零時，相應(yīng)的R基團(tuán)是一對電子或者與不飽和結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)。
對于式Ⅰ和式Ⅱ化合物來說典型的C6-14芳基包括但不限于苯基、芐基、甲基吲哚基、萘基、菲基、蒽基、茚基、薁基、聯(lián)苯、亞聯(lián)苯基和芴基；典型的鹵基包括但不限于氟、氯、溴和碘；典型的C1-15烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基以及支鏈烷基；典型的C2-15鏈烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等，以及支鏈烯基；典型的C2-15炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等等，以及支鏈炔基；典型的低級烷氧(醚)基包括被上述某一個C1-4烷基取代的氧；典型的C2-6烷酰氧基包括乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、戊酰氧基、己酰氧基及其支鏈異構(gòu)體。
按照本發(fā)明可以使用的化合物包括糖、氨基酸和多元醇，及其衍生物。糖的實(shí)例包括但不限于低聚糖和單糖，諸如海藻糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、木二糖、瓊脂二糖、纖維二糖、果聚二糖(levanbiose)、quitobiose、2-β-葡糖醛酸糖基葡糖醛酸(2-β-glucuronosylglucuronic acid)、阿洛糖、阿卓糖、半乳糖、古洛糖、艾杜糖、甘露糖、塔羅糖、山梨糖醇、果糖、木糖醇和阿糖醇。
這類氨基酸可包括但不限于丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天門冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸和組氨酸，及其衍生物。按照本發(fā)明可以使用D型和L型氨基酸以及非蛋白氨基酸。實(shí)例包括N-(3’-酮-5’-甲基)-己基丙氨酸、亮氨酸甜菜堿、N-甲基異亮氨酸和γ-谷氨?；涟彼?。
多元醇的實(shí)例包括但不限于甘油、乙二醇、聚乙二醇，等等。
本發(fā)明的優(yōu)選化合物可包括但不限于4-甲基嗎啉-N-氧化物(MMNO)和N-烷基咪唑化合物，諸如1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑，甜菜堿(羧甲基三甲銨)，牛磺酸，ectoine，2-哌啶酸，2-哌啶酸，2-嗎啉代乙磺酸，吡啶-N-氧化物，N,N-二甲基辛胺-N-氧化物，3-甲基異噁唑-5(4H)-酮嗎啉鹽，甘氨酸，肌氨酸，N,N-二甲基甘氨酸，N-甲基-脯氨酸，4-羥基-脯氨酸，1-甲基-2-吡咯羧酸，1-甲基吲哚-2-羧酸，2-吡嗪羧酸，5-甲基-2-吡嗪羧酸，4-甲基-5-咪唑-甲醛，1-甲基吡咯-2-羧酸，1-乙基-3-甲基咪唑鎓硝酸鹽，乙基-氮雜環(huán)丁烷-1-丙酸鹽，N,N-二甲基-苯丙氨酸，S-羧甲基-半胱氨酸，2-咪唑甲醛，4-咪唑乙酸，4-咪唑羧酸，4,5-咪唑二羧酸，肉堿-Ne-乙酰-b-賴氨酸，γ-氨基丁酸，反式-4-羥基水蘇堿，Nα-氨基甲酰基-L-谷氨酰胺-1-酰胺，膽堿，二甲基噻亭，(磺基甜菜堿和二甲基乙酰噻亭，及其衍生物)，N-乙酰基谷氨酰胺?；劝滨０钒被?，二甲基锍基丙酸鹽，ectoine(1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶(pirymidine)羧酸)，hydroxy ectoine，谷氨酸鹽，β-谷氨酰胺，真蛸堿，肌氨酸，三甲胺-N-氧化物(TMAO)，平均分子量為約50,000-500,000道爾頓的聚(2-乙基-2-噁唑啉)，平均分子量為約100,000-200,000道爾頓的聚(二烯丙基二甲基銨氯化物)，以及所有其他氨基酸及其衍生物。
其他優(yōu)選的化合物包括式Ⅰ和式Ⅱ化合物的衍生物和鹽。例如，當(dāng)式Ⅰ或式Ⅱ化合物含有羧基(C=O)時，本發(fā)明化合物包括該羧基的酯和酰胺，它們可以用常規(guī)化學(xué)合成方法制備，例如通過將含有羧基的化合物與醇或氨基化合物縮合。在本發(fā)明的這個方面有用的醇的實(shí)例包括C1-6醇和C7-12芳烷醇化合物，包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇，及其支鏈異構(gòu)體。在本發(fā)明的這個方面有用的氨基化合物的實(shí)例包括C1-6氨基化合物和C7-12芳烷氨基化合物，包括但不限于甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺，及其支鏈異構(gòu)體。當(dāng)式Ⅰ或式Ⅱ化合物含有羥基(-OH)時，本發(fā)明化合物包括這些化合物的酯，它們可以通過將含有羥基的化合物與例如C1-6鏈烷酸、C6-12芳基鏈烷酸、或C2-12二鏈烷酸或其酸酐等進(jìn)行縮合而制備，例如，甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸，及其支鏈異構(gòu)體，以及琥珀酸、琥珀酸酐、富馬酸、馬來酸等等。結(jié)合本文中的教導(dǎo)和本領(lǐng)域中的常識，可以按照本發(fā)明制備和使用的式Ⅰ和式Ⅱ化合物的其他衍生物對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
本發(fā)明的范圍內(nèi)也包括式Ⅰ和式Ⅱ化合物的鹽。利用常規(guī)化學(xué)合成方法可以形成式Ⅰ和式Ⅱ化合物的酸加成鹽，例如通過將特定化合物的溶液與酸的溶液混合，諸如鹽酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、碳酸、磷酸、草酸等等。利用常規(guī)化學(xué)合成方法也可以形成式Ⅰ和式Ⅱ化合物的堿性鹽，例如通過將特定化合物的溶液與堿的溶液混合，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化膽堿、碳酸鈉、Tris等等。結(jié)合本文中的教導(dǎo)和本領(lǐng)域中的常識，可以按照本發(fā)明制備和使用的式Ⅰ和式Ⅱ化合物的其他鹽對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
上述化合物和組合物可以單獨(dú)使用或以其任意組合使用。按照本發(fā)明，優(yōu)選使用至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個……等等的組合。在一個優(yōu)選方面，使用2-10個、2-9個、2-8個、2-7個、2-6個、2-5個、2-4個和2-3個這類化合物。在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明涉及通過將上述化合物任意組合后混合得到的組合物。在將這些化合物混合在一起時可能會發(fā)生某些相互作用，這種作用可能改變所混合的一種或多種化合物的結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)致新的或不同的化合物形成。
這些組合物可以在用于增強(qiáng)核酸分子的高保真性合成的方法中使用，包括經(jīng)擴(kuò)增(特別是PCR)、逆轉(zhuǎn)錄和測序方法來增強(qiáng)核酸分子的高保真性合成的方法。本發(fā)明也涉及利用這些方法生產(chǎn)的核酸分子，其片段或衍生物，以及包含這類核酸分子、片段或衍生物的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明也涉及將這類核酸分子用于生產(chǎn)所需的多肽。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明化合物或組合物的試劑盒。
合成方法本發(fā)明的式Ⅰ和式Ⅱ化合物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)化學(xué)合成技術(shù)合成，如下所述。
式Ⅰ化合物的合成可以如下進(jìn)行 例如，當(dāng)R4和Z為H，Y為-CO2H，d、e、f和m為1時，起始化合物為BrCH2CH2CO2H，它可以從商業(yè)上購得。
式Ⅱ化合物的合成可以如下進(jìn)行
例如，當(dāng)R2和R3為H、b和m為1、c-1和n-1為0時，起始化合物為NH2-CH2-COH，它可以從商業(yè)上獲得。
可以從商業(yè)上獲得的還有BrCH2CO2H、CH3CH(Br)CO2H、CH2CH2CH(Br)CO2H、BrCH2CH2CH2CO2H、Cl-CH2-CH2-Cl(CH3)2CHCH(Br)CO2、CH3CH2CH(Br)CO2H、BrCH2CH2CH2CO2H、BrCH2CH2CO2H、HO2CCH2CH(Br)CO2H。這些化合物可以從Aldrich公司(St.Louis,MO)獲得。
本發(fā)明中所用的許多化合物，諸如氨基酸及其衍生物、糖及其衍生物、以及N-烷基咪唑化合物(包括1-甲基咪唑和4-甲基咪唑)都可以從商業(yè)上得到，例如從Sigma公司(St.Louis,MO)獲得。
為了配制本發(fā)明的組合物，可以將上述一種或多種化合物以任何方式混合在一起。這類混合物可以用以下方法得到將這些化合物以粉末形式混合；用水或有機(jī)溶劑制得各種化合物的溶液并將這些溶液混合形成本發(fā)明的組合物；或者制備至少一種化合物的溶液并將其與粉末形式的一種或多種其他化合物混合。
本發(fā)明另一個優(yōu)選的方面，所述組合物還可以包含一或多種具有核酸聚合酶活性的多肽。優(yōu)選的這類具有核酸聚合酶活性的酶可以包括，但不限于，有DNA聚合酶活性的多肽、有RNA聚合酶活性的多肽以及具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽。
更優(yōu)選地，所述組合物制成工作濃度或濃縮液(2X、5X、10X、50X等)。這些組合物最好在不同溫度儲存時穩(wěn)定。術(shù)語“穩(wěn)定的”和“穩(wěn)定性”用在這里表示組合物中的一種成分(比如化合物或酶)在組合物于大約4℃儲存大約一周，或于大約-20℃儲存大約6個月后，保持原始酶和/或化合物活性的至少70％，優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選至少90％。
術(shù)語“工作濃度”用在這里表示一種化學(xué)化合物或酶的濃度，該濃度是或接近在執(zhí)行特定功能(比如合成核酸)的溶液中所用的最佳濃度。
用于制成本發(fā)明所述組合物的水優(yōu)選是蒸餾過、去離子并過濾除菌(流經(jīng)0.1-0.2微米濾膜)的水，并且沒有污染DNase和RNase酶。
這種水市場有售，例如從Sigma Chemical Company(Saint Louis,Missouri)購買，或者依照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法按需制備。
除了化學(xué)(以及任選多肽)成分，優(yōu)選所述組合物包含一或多種緩沖液以及合成核酸分子所必需的輔助因子。尤其優(yōu)選用于制成所述組合物的緩沖液是乙酸鹽、硫酸鹽、鹽酸鹽、磷酸鹽或游離酸形式的Tris-(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)，盡管與Tris離子強(qiáng)度和pKa類似的替代緩沖鹽也能獲得等同的結(jié)果。除了緩沖鹽，組合物中還包括輔助因子鹽比如鉀鹽(優(yōu)選氯化鉀或醋酸鉀)和鎂鹽(優(yōu)選氯化鎂或醋酸鎂)。
一般優(yōu)選首先將緩沖鹽和輔助因子鹽在水里溶至工作濃度，并在加入化學(xué)化合物(以及任選多肽)之前調(diào)節(jié)溶液的pH。這樣，在配制所述組合物的過程中，任何對pH敏感的化學(xué)化合物和多肽就不容易受到酸或堿介導(dǎo)的失活或降解。
為了配制緩沖鹽溶液，將緩沖鹽(優(yōu)選Tris-(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)的鹽，最優(yōu)選其鹽酸鹽)與足夠量的水混合以便制成TRIS濃度為5-150毫摩爾，優(yōu)選10-60毫摩爾，最優(yōu)選大約20-60毫摩爾的溶液。向該溶液加入鎂鹽(優(yōu)選氯化鎂或醋酸鎂)以使工作濃度達(dá)到1-10毫摩爾，優(yōu)選1.5-8.0毫摩爾，最優(yōu)選大約3-7.5毫摩爾。還可以向溶液中加入鉀鹽(最優(yōu)選氯化鉀)，工作濃度為10-100毫摩爾，最優(yōu)選大約75毫摩爾?？梢韵蛉芤褐屑尤脒€原劑(比如二硫蘇糖醇)，優(yōu)選終濃度為大約1-100mM，更優(yōu)選大約5-50mM或大約7.5-20mM，最優(yōu)選大約10mM。還可以加入少量乙二胺四乙酸(EDTA)鹽，比如EDTA二鈉鹽(優(yōu)選大約0.1毫摩爾)，雖然含有EDTA對于本發(fā)明所述組合物的功能或穩(wěn)定性似乎不是必需的。加入所有緩沖液和鹽以后，將緩沖鹽溶液充分混合直至鹽全部溶解，利用本領(lǐng)域已知的方法將pH調(diào)至7.4到9.2，優(yōu)選8.0到9.0，最優(yōu)選大約8.4。
向這些緩沖鹽溶液中加入本發(fā)明所述化合物，以及任選一或多種具有核酸聚合酶活性的多肽，從而形成所述組合物。
在優(yōu)選的組合物中，本發(fā)明的化合物以大約10∶1、大約9∶1、大約8∶1、大約7∶1、大約6∶1、大約5∶1、大約4∶1、大約3∶1、大約2.5∶1、大約2∶1、大約1.75∶1、大約1.5∶1、大約1.25∶1、大約1∶1、大約1∶1.25、大約1∶1.5、大約1∶1.75、大約1∶2、大約1∶2.5、大約1∶3、大約1∶4、大約1∶5、大約1∶6、大約1∶7、大約1∶8、大約1∶9或者大約1∶10的摩爾或化學(xué)計(jì)量比率混合。更優(yōu)選地，所述化合物以大約1∶1的摩爾或化學(xué)計(jì)量比率混合。其他摩爾或化學(xué)計(jì)量比率可以通過常規(guī)的優(yōu)化方法確定。如果使用兩種以上化合物配制發(fā)明所述組合物，通過檢測每種化合物對核酸合成的影響可以很容易地優(yōu)化其用量。然后優(yōu)選將這些化合物配制成工作濃度的組合物，以便用于下文描述的核酸合成方法，所述工作濃度為大約0.01-5M、大約0.05-5M、大約0.1-4M、大約0.25-3M、大約0.3-2.5M、大約0.4-2M、大約0.4-1.5M、大約0.4-1M或者大約0.4-0.8M。根據(jù)所用的化合物，按照預(yù)期結(jié)果可以使用其他摩爾量。本發(fā)明的組合物然后可以于65℃儲存2-4周，室溫到37℃儲存1到兩個月，4℃1到6個月，-20℃3個月到1年或更長時間，直至用于合成核酸分子。
依照本發(fā)明許多具有聚合酶活性的多肽都是有用的。這些多肽包括酶類比如核酸聚合酶(包括DNA聚合酶和RNA聚合酶)。所述聚合酶包括，但不限于，嗜熱棲熱菌(Tth)DNA聚合酶、水生棲熱菌(Taq)DNA聚合酶、那不勒斯棲熱袍菌(The)DNA聚合酶、海棲熱袍菌(Tma)DNA聚合酶、Thermococcus litoralis(Tli或VENTTM)DNA聚合酶、激烈熱球菌(Pfu)DNA聚合酶、DEEPVENTTMDNA聚合酶、沃氏熱球菌(Pwo)DNA聚合酶、熱球菌KDD2(KOD)DNA聚合酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bst)DNA聚合酶、嗜熱芽孢桿菌(Bacillus caldophilus,Bca)DNA聚合酶、嗜酸熱硫化葉菌(Sac)DNA聚合酶、嗜酸熱原體(Tac)DNA聚合酶、黃棲熱菌(Tfl/Tub)DNA聚合酶、紅棲熱菌(Tru)DNA聚合酶、Thermus brockianus(DYNAZYMETM)DNA聚合酶、熱自養(yǎng)甲烷桿菌(Mth)DNA聚合酶、分枝桿菌(Mtb、Mlep)DNA聚合酶，以及它們的突變體、變異體和衍生體。根據(jù)本發(fā)明還可以使用RNA聚合酶比如T3、T5和SP6以及它們的突變體、變異體和衍生體。
用于本發(fā)明的核酸聚合酶可以是嗜溫或嗜熱的，并且優(yōu)選是嗜熱的。優(yōu)選的嗜溫DNA聚合酶包括T7 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、Klenow片段DNA聚合酶、DNA聚合酶Ⅲ等。優(yōu)選可用于本發(fā)明所述方法和組合物的熱穩(wěn)定DNA聚合酶包括Taq、Tne、Tma、Pfu、Tfl、Tth、Stoffel片段、VENTTM和DEEP VENTTMDNA聚合酶，以及它們的突變體、變異體和衍生體(美國專利5436149；美國專利4889818；美國專利4965188；美國專利5079352；美國專利5614365；美國專利5374553；美國專利5270179；美國專利5047342；美國專利5512462；WO9206188；WO9206200；WO9610640；Barnes,W.M.,基因112:29-35(1992)；Lawyer,F.C.,等，PCR方法與應(yīng)用2275-287(1993)；Flaman,J.M.,等，核酸研究22(15)3259-3260(1994))。為了擴(kuò)增長核酸分子(例如，長度超過3-5Kb的核酸分子)，通常至少使用兩種DNA聚合酶(一種基本上缺乏3’核酸外切酶活性，另一種具有3’核酸外切酶活性)。參見美國專利5436149；美國專利5512462；Barnes,W.M.,基因11229-35(1992)；以及1997年2月14日提交的同時待審的美國專利申請08801720，上述文獻(xiàn)此處全文引作參考?；旧先狈?’核酸外切酶活性的DNA聚合酶包括，但不限于，Taq、Tne (exo-)、Tma(exo-)、Pfu(exo-)、Pwo(exo-)、Tth DNA聚合酶，以及它們的突變體、變異體和衍生體。
用于本發(fā)明的具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽包括任何具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽。這類酶包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶、乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、花椰菜花葉病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、細(xì)菌逆轉(zhuǎn)錄酶、Tth DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶(Saiki,R.K.等，科學(xué)239487-491(1988)；美國專利4889818和4965188)、Tne DNA聚合酶(WO96/10640)、Tma DNA聚合酶(美國專利5374553)以及它們的突變體、變異體和衍生體(參見例如A.John Hughes和DebK.Chatterjee的同時待審的美國專利申請08/706702和08/706706，均在1996年9月9日提交，此處全文引作參考文獻(xiàn))。優(yōu)選用于本發(fā)明的酶包括那些RNase H活性降低或基本上降低的酶。一種酶“RNaseH活性基本上降低”意味著該酶的RNase H活性不到相應(yīng)的野生型或RNase H+的酶(比如野生型莫洛尼鼠類白血病病毒(M-MLV)、禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)或勞氏肉瘤病毒(RSV)逆轉(zhuǎn)錄酶)的活性的大約20％、更優(yōu)選不到大約15％、10％或5％，最優(yōu)選不到大約2％。酶的RNaseH活性可以通過多種檢測方法確定，比如在例如美國專利5244797、Kotewicz,M.L.等，核酸研究16265(1988)以及Gerard,G.F.等，F(xiàn)OCUS14(5)91(1992)中所描述的方法(各文獻(xiàn)全文引入本文作為參考)。特別優(yōu)選用于本發(fā)明的多肽包括，但不限于，M-MLV H-逆轉(zhuǎn)錄酶、RSV H-逆轉(zhuǎn)錄酶、AMV H-逆轉(zhuǎn)錄酶、RAV(Rous-相關(guān)病毒)H-逆轉(zhuǎn)錄酶、MAV(成髓細(xì)胞瘤相關(guān)病毒)H-逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV H-逆轉(zhuǎn)錄酶。但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，任何能由核糖核酸分子(即具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性)產(chǎn)生DNA分子，RNase H活性基本上降低的酶可以等同地用于本發(fā)明所述組合物、方法和試劑盒中。
用于本發(fā)明的DNA和RNA聚合酶可以，從例如LifeTechnologies,Inc.(Rockville,Maryland)、Perkin-Elmer(Branchburg,New Jersey)、New England BioLabs(Beverly,Massachusetts)或Boehringer Mannheim Biochemicals(Indianapolis,Indiana)購買。用于本發(fā)明的具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽可以從，例如Life Technologies,Inc.(Rockville,Maryland)、Pharmacia(Piscataway,New Jersey)、Sigma(Saint Louis,Missouri)或Boehringer Mannheim Biochemicals(Indianapolis,Indiana)購買。替代的作法是，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的分離和純化天然蛋白質(zhì)的常規(guī)步驟從天然病毒或細(xì)菌來源中分離具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽(參見例如Houts,G.E.等，病毒學(xué)雜志29517(1979))。另外，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的重組DNA技術(shù)來制備具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽(參見，例如Kotewicz,M.L.等，核酸研究16265(1988)；Soltis,D.A.和Skalka,A.M.,美國科學(xué)院學(xué)報(bào)853372-3376(1988))。
優(yōu)選具有聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽以在溶液中大約0.1-200單位/ml，大約0.1-50單位/ml，大約0.1-40單位/ml，大約0.1-36單位/ml，大約0.1-34單位/ml，大約0.1-32單位/ml，大約0.1-30單位/ml，或者大約0.1-20單位/ml，最優(yōu)選大約20-40單位/ml的終濃度用于本發(fā)明組合物和方法中。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易知道適用于本發(fā)明的這些聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的其他合適濃度。
核酸合成的方法本發(fā)明的化合物和組合物可以用于核酸的合成方法。具體來說，已發(fā)現(xiàn)所述化合物和組合物可以促進(jìn)鳥苷和胞苷含量高的核酸分子(即富含GC的核酸分子)的合成，尤其是經(jīng)擴(kuò)增反應(yīng)(比如聚合酶鏈反應(yīng)PCR)的合成。因此所述化合物和組合物可以用于任何需要合成核酸分子，比如DNA(尤其是cDNA)和RNA(尤其是mRNA)的方法。可以有利地使用本發(fā)明所述化合物和組合物的方法包括，但不限于，核酸合成方法、核酸擴(kuò)增方法、核酸逆轉(zhuǎn)錄方法以及核酸測序方法。
合成與本發(fā)明這一方面對應(yīng)的核酸合成方法可以包括1或多個步驟。例如，本發(fā)明提供了一種合成核酸分子的方法，包括(a)將核酸模板與一或多種上面描述的發(fā)明所述化合物和組合物混合形成反應(yīng)體系；以及(b)在足以產(chǎn)生與模板全部或部分互補(bǔ)的第一核酸分子的條件下溫育所述體系。根據(jù)本發(fā)明這個方面，核酸模板可以是DNA分子比如cDNA分子或文庫，或者是RNA分子比如mRNA分子。
根據(jù)本發(fā)明，可以由得自天然來源(比如各種細(xì)胞、組織、器官或生物)的核酸分子組制備所加入的核酸分子或文庫?？梢杂米骱怂岱肿觼碓吹募?xì)胞可以是原核細(xì)胞(細(xì)菌細(xì)胞，包括埃希氏菌、芽孢桿菌、沙雷氏菌、沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、梭菌、衣原體、奈瑟氏球菌、密螺旋體、枝原體、疏螺旋體、軍團(tuán)菌、假單胞菌、分枝桿菌、螺桿菌、歐文氏菌、農(nóng)桿菌、根瘤菌以及鏈霉菌屬中的種)或者真核細(xì)胞(包括真菌(特別是酵母)、植物、原生動物和其他寄生蟲，以及動物包括昆蟲(尤其是果蠅細(xì)胞)、線蟲(尤其是Caenorhabditiselegans細(xì)胞)和哺乳動物(尤其是人細(xì)胞))。
可以用作核酸分子或核酸分子文庫來源的哺乳動物體細(xì)胞包括血細(xì)胞(網(wǎng)織紅細(xì)胞和白細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞(包括中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng))、肌細(xì)胞(包括來自骨骼肌、平滑肌或心肌的肌細(xì)胞和成肌細(xì)胞)、結(jié)締組織細(xì)胞(包括成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞)和其他基質(zhì)細(xì)胞(例如，巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、施旺細(xì)胞)。哺乳動物生殖細(xì)胞(精母細(xì)胞和卵母細(xì)胞)也可以作為本發(fā)明所述核酸或文庫的來源，而能產(chǎn)生上述體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的祖細(xì)胞、前體細(xì)胞和干細(xì)胞也可以。同樣適用作核酸來源的是哺乳動物組織或器官比如來源于腦、腎、肝、胰、血液、骨髓、肌肉、神經(jīng)、皮膚、泌尿生殖、循環(huán)、淋巴、腸胃和結(jié)締組織的那些，以及來源于哺乳動物(包括人)胚胎或胎兒的。
以上原核細(xì)胞或真核細(xì)胞、組織和器官可以是正常的、病態(tài)的、轉(zhuǎn)化的、建系的、始祖、前體、胎兒或胚胎?；疾〖?xì)胞可以，例如，包括與傳染病(由細(xì)菌、真菌或酵母、病毒(包括HIV)或寄生蟲引發(fā)的)、遺傳病或生化病(例如囊性纖維化、血友病、Alzheimer’s病、肌肉萎縮或多發(fā)性硬化癥)或癌變過程有關(guān)的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化或建系的動物細(xì)胞系可以包括，例如，COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、VERO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、K562細(xì)胞、F9細(xì)胞等。其他適合作為核酸來源用于本發(fā)明所述方法的細(xì)胞、細(xì)胞系、組織、器官和生物對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這些細(xì)胞、組織、器官和生物可以得自它們的天然來源或者從比如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville,Maryland)以及技術(shù)人員知道的其他來源購買。
一待獲得了細(xì)胞、組織、器官或其他原材料樣品，就可以通過本領(lǐng)域熟知的方法分離核酸分子(比如DNA、RNA(例如mRNA或者polyA+RNA)分子)或者制備cDNA分子或文庫(參見，例如，Maniatis,T.等，細(xì)胞15687-701(1978)；Okayama,H.,和Berg,P.,分子細(xì)胞生物學(xué)2161-170(1982)；Gubler U.和Hoffman,B.J.,基因25263-269(1983))。
在實(shí)施本發(fā)明這個方面時，可以通過將如上獲得的核酸模板(優(yōu)選DNA分子，比如cDNA，或者RNA分子，比如mRNA或者polyA+RNA)分子)與一或多種以上描述的本發(fā)明的化合物或組合物混合成反應(yīng)體系，從而合成第一核酸分子。在有利于所加入的核酸分子進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RNA模板的情況)和/或聚合的條件下，合成與核酸模板全部或部分互補(bǔ)的第一核酸分子。這類合成通常在有核苷酸(例如脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)或者它們的衍生物)的情況下實(shí)現(xiàn)。
可選擇地，本發(fā)明所述化合物、組合物和方法可用于單試管合成雙鏈核酸分子。在這個步驟中，在能形成與第一核酸分子全部或部分互補(bǔ)的第二核酸分子的條件下溫育如上所述合成的第一核酸分子。合成第二鏈可以，例如，通過改進(jìn)的Gubler-Hoffman反應(yīng)(D’Alessio,J.M.等，F(xiàn)ocus91(1987))完成。
當(dāng)然，本發(fā)明所述組合物和方法可以有利地應(yīng)用的其他核酸合成技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
擴(kuò)增和測序方法在本發(fā)明的其他方面，發(fā)明所述組合物可以用于核酸分子的擴(kuò)增或測序方法中。對應(yīng)發(fā)明這個方面的核酸擴(kuò)增方法可以另外包括在本領(lǐng)域通常稱為一步(例如，一步RT-PCR)或兩步(例如，兩步RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄-擴(kuò)增反應(yīng)的方法中使用一或多種具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽。擴(kuò)增長核酸分子時(即，長度超過3-5Kb)，本發(fā)明所述組合物可以包含具有DNA聚合酶活性的多肽的組合，詳細(xì)描述見1997年2月14日提交的同時待審的美國申請08/801720，其內(nèi)容此處全文引作參考文獻(xiàn)。
對應(yīng)本發(fā)明這個方面的擴(kuò)增方法可以包括1或多個步驟。例如，本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增核酸分子的方法，包括(a)將核酸模板與一或多種上面描述的發(fā)明所述化合物或組合物混合成反應(yīng)體系；以及(b)在能擴(kuò)增與模板全部或部分形成互補(bǔ)的核酸分子的條件下溫育所述體系。本發(fā)明還提供了由這類方法擴(kuò)增得到的核酸分子。
用于擴(kuò)增和分析核酸分子或片段的普通方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(參見，例如，美國專利4683195；4683202和4800159；Innis,M.A.等編輯，PCR手冊方法和應(yīng)用指南，San Diego,CaliforniaAcademicPress,Inc.(1990)；Griffin,H.G.和Griffin,A.M.編輯，PCR技術(shù)最新改進(jìn)，Boca Raton,FloridaCRC Press(1994))。例如，根據(jù)本發(fā)明可以采用的擴(kuò)增方法包括PCR(美國專利4683195和4683202)，鏈置換擴(kuò)增(SDA；美國專利5455166；EP0684315)以及基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA；美國專利5409818；EP0329822)。
一般來說，這些擴(kuò)增方法包括在有一或多種引物序列的情況下，使核酸樣品與含有一或多種具有核酸聚合酶活性的多肽的化合物或組合物進(jìn)行接觸，優(yōu)選通過PCR或相當(dāng)?shù)淖詣訑U(kuò)增技術(shù)來擴(kuò)增核酸樣品從而形成一組擴(kuò)增的核酸片段，以及任選地借助大小(優(yōu)選經(jīng)凝膠電泳)來分離所擴(kuò)增的核酸片段，以及分析凝膠是否存在所述核酸片段，例如通過用核酸結(jié)合染料(比如溴化乙錠)將凝膠染色。
通過本發(fā)明所述方法進(jìn)行擴(kuò)增后，可以將所擴(kuò)增的核酸片段分離以便進(jìn)一步使用或鑒定。通常是通過任何物理或生物化學(xué)手段包括凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、層析(包括分子篩、親合和免疫層析)、密度梯度離心和免疫吸附來借助大小分離所擴(kuò)增的核酸片段從而完成該步驟。特別優(yōu)選的是經(jīng)凝膠電泳分離核酸片段，因?yàn)樗峁┝艘环N快速和高度重復(fù)性的靈敏分離多種核酸片段的手段，并且能直接、同時地比較幾種核酸樣品中的片段。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以將該步驟延伸到分離和鑒定這些片段或任何由本發(fā)明所述方法擴(kuò)增的核酸片段。因此，本發(fā)明也涉及由本發(fā)明所述擴(kuò)增或合成方法制備的分離的核酸分子。
在該實(shí)施方案中，依照常規(guī)技術(shù)比如電洗脫或物理切割從凝膠上取下1或多個擴(kuò)增好的核酸片段用于鑒定(見上文)。然后將分離的單個核酸片段插入標(biāo)準(zhǔn)核苷酸載體，包括適合轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化多種原核(細(xì)菌)或真核(酵母、植物或動物包括人和其他哺乳動物)細(xì)胞的表達(dá)載體?？蛇x擇地，例如利用以下描述的和本領(lǐng)域常規(guī)的方法(參見，例如涉及DNA測序方法的美國專利4962022和5498523)通過測序(即，確定核酸片段的核苷酸序列)可以進(jìn)一步鑒定采用本發(fā)明所述化合物、組合物和方法擴(kuò)增和分離的核酸分子。
根據(jù)本發(fā)明的核酸測序方法可以包括1或多個步驟。例如，本發(fā)明提供了一種核酸分子的測序方法，包括(a)將待測序核酸分子與一或多種引物、一或多種上面描述的本發(fā)明的化合物或組合物、一或多種核苷酸以及一或多種終止試劑(比如雙脫氧核苷酸)混合成反應(yīng)體系；(b)在能合成與待測序核酸分子全部或部分互補(bǔ)的核酸分子群的條件下溫育所述體系；以及(c)分離所述分子群以便確定待測序分子的全部或部分核苷酸序列。
可以采用本發(fā)明的組合物的核酸測序技術(shù)包括雙脫氧測序技術(shù)，比如美國專利4962022和5498523中公開的。
載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明所述分離的核酸分子的載體，用所述重組載體基因工程化的宿主細(xì)胞，以及利用這些載體和宿主細(xì)胞生產(chǎn)重組多肽的方法。
用于本發(fā)明的載體可以是，例如，噬菌體或質(zhì)粒，優(yōu)選是質(zhì)粒。優(yōu)選為包含編碼目的多肽的核酸的順式作用調(diào)控區(qū)的載體。合適的反式作用因子可以由宿主提供，輔助載體或者由載體自身在導(dǎo)入宿主時提供。
在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，載體保證特異表達(dá)由本發(fā)明的核酸分子編碼的多肽；這類表達(dá)載體可以是誘導(dǎo)型和/或細(xì)胞型特異的。這類載體中尤其優(yōu)選的是可通過容易操作的環(huán)境因素，比如溫度和營養(yǎng)添加物誘導(dǎo)的載體。
可用于本發(fā)明的表達(dá)載體包括來源于染色體、附加體和病毒的載體，例如，來源于細(xì)菌質(zhì)?；蚴删w的載體，以及來源于其組合體的載體，比如粘粒和噬菌粒。
所述DNA插入片段應(yīng)當(dāng)可操縱地連接一個合適的啟動子，比如噬菌體λPL啟動子、大腸桿菌lac、trp和tac啟動子。其他合適的啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所述基因融合構(gòu)建體還可以含有轉(zhuǎn)錄起始、終止位點(diǎn)，以及在發(fā)生轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中含有進(jìn)行翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄物的編碼部分優(yōu)選在待翻譯多核苷酸的開頭包括一個翻譯起始密碼子，在接近末端的位置有一個終止密碼子(UAA、UGA或UAG)。
所述表達(dá)載體優(yōu)選包括至少一個選擇標(biāo)記。這類標(biāo)記包括在培養(yǎng)大腸桿菌和其他細(xì)菌時的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因。
用于本發(fā)明的載體優(yōu)選包括Qiagen有售的pQE70、pQE60和pQE-9；Stratagene有售的pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；Invitrogen有售的pcDNA3；以及Pharmacia有售的pGEX、pTrxfus、pTrc99a、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKk233-3、pDR540、pRIT5。其他合適的載體對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
合適宿主細(xì)胞的代表性例子包括，但不限于，細(xì)菌細(xì)胞比如大腸桿菌、鏈霉菌、歐文氏菌、克雷伯氏菌和鼠傷寒沙門氏菌。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是大腸桿菌，尤其優(yōu)選的是可購買到的大腸桿菌菌株DH10B和Stb12(Life Technologies,Inc.；Rockville,Maryland)。
制備肽正如前面提到的，本發(fā)明的方法適用于通過將以上描述的核酸分子或載體插入宿主細(xì)胞并由宿主細(xì)胞表達(dá)該核苷酸序列所編碼的目的多肽從而制備任何長度的任何多肽。通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子脂類介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其他方法可以將核酸分子或載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這類方法在許多常規(guī)實(shí)驗(yàn)手冊中有描述，比如Davis等，分子生物學(xué)基本方法(1986)。一旦得到轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，就可以在任何生理學(xué)上相容的pH和溫度條件下，在含有可同化的碳源、氮源以及支持宿主細(xì)胞生長所必需的礦物質(zhì)的任何合適的營養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)所述細(xì)胞。產(chǎn)生重組多肽的培養(yǎng)條件根據(jù)用來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的載體類型而變。例如，某些表達(dá)載體含有調(diào)控區(qū)，它使細(xì)胞在特定溫度生長，或者要向細(xì)胞生長培養(yǎng)基中添加特定化學(xué)物質(zhì)或誘導(dǎo)劑以便起始基因表達(dá)從而產(chǎn)生重組多肽。因此，本文所用的術(shù)語“重組多肽的產(chǎn)生條件”并非局限于任何一種培養(yǎng)條件。以上描述的宿主細(xì)胞和載體的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域公知的。在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生了目的多肽后，通過幾種技術(shù)可以將其分離。為了從宿主細(xì)胞中釋放出目的多肽，將細(xì)胞裂解或破碎。通過使細(xì)胞與低滲溶液接觸、用破壞細(xì)胞壁的酶比如溶菌酶處理、超聲處理、高壓處理或者將以上方法結(jié)合使用可以完成所述裂解。其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的破壞和裂解細(xì)菌細(xì)胞的方法也可以使用。
細(xì)胞破碎后，通過任何適合從復(fù)雜體系中分離顆粒的技術(shù)可以從細(xì)胞碎片中分離出所述多肽。然后可以通過公知的分離技術(shù)純化該多肽。合適的純化技術(shù)包括，但不限于，硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、電泳、免疫吸附、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親合層析、免疫親合層析、大小排阻層析、液相層析(LC)、高效LC(HPLC)、快速LC(FPLC)、羥磷灰石層析和凝集素層析。
試劑盒本發(fā)明還提供了用于核酸分子合成、擴(kuò)增或測序的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明這個方面的試劑盒可以包括1或多個容器，比如小瓶、試管、安瓿、瓶子等，這些容器可以含有一或多種本發(fā)明所述組合物。
本發(fā)明的試劑盒可以包括一或多種以下成分(ⅰ)一或多種本發(fā)明所述化合物或組合物，(ⅱ)一或多種聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶，(ⅲ)一或多種合適的緩沖液，(ⅳ)一或多種核苷酸，以及(ⅴ)一或多種引物。
相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解，對本文所描述的方法和應(yīng)用進(jìn)行的其他合適的改進(jìn)和調(diào)整是顯而易見的，可以在不脫離本發(fā)明或任何實(shí)施方案的范圍的情況下完成。至此已詳細(xì)描述了本發(fā)明，參考以下實(shí)施例將更容易理解發(fā)明，這些實(shí)施例在這里只是用于闡述而非限制發(fā)明。
實(shí)施例序言對GC含量高的大量不同PCR擴(kuò)增子(例如，CAG重復(fù)、假單胞菌基因組DNA等)檢驗(yàn)4-甲基嗎啉N-氧化物(以下用“MMNO”表示)。所檢驗(yàn)的擴(kuò)增子用目前的常規(guī)PCR反應(yīng)體系很難擴(kuò)增。為了檢測新的助溶劑對高GC含量擴(kuò)增子的PCR效率的影響，以不同濃度向PCR反應(yīng)體系中添加MMNO和其他助溶劑。
方法以下部分描述了如何制備實(shí)施例中使用的化學(xué)物質(zhì)。
制備2.2X PCR反應(yīng)體系(實(shí)施例1-3)在實(shí)施例1-3中，制備了含有全部以下所列成分(除了模板DNA和引物)的2.2X PCR反應(yīng)體系。下表說明了如何制備該2.2X PCR反應(yīng)體系。
實(shí)施例1-9的材料甜菜堿一水合物([羧甲基]三甲基銨)、L-脯氨酸、4-甲基嗎啉-N-氧化物(MMNO)、ectoine(THP[B]；[S]-2-甲基-1,4,5,6-四氫嘧啶-4-羧酸)、DL-pipecolic acid(DL-2-哌啶羧酸)、以及L-肉堿([-]-b-羥基-g-{三甲基銨}丁酸鹽)購自Sigma(St.Louis,MO),并在無菌蒸餾水中制備成4M儲液，過濾除菌。PCR試劑Platinum Taq DNA聚合酶、Platinum Taq DNA聚合酶HighFidelity、10X Taq緩沖液(1X=20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl)、50mM 氯化鎂、10X Taq High Fidelity 緩沖液(1X=60mMTris-SO4(pH8.9)、18mM(NH4)2SO4、50mM硫酸鎂、10mM dNTP Mix、K562人基因組DNA以及無菌蒸餾水購自Life Technologies,Inc.(Rockville,MD)。寡核苷酸引物以脫鹽制品購自LifeTechnologies,Inc.,無須純化直接使用。
實(shí)施例1滴定脯氨酸、1-甲基咪唑和4-甲基咪唑來增強(qiáng)由富含GC的模板的PCR擴(kuò)增檢測幾種化學(xué)物質(zhì)來確定它們是否能增強(qiáng)使用富含GC的模板時PCR的效率。在第一個例子中，用各種濃度的3種不同化學(xué)物質(zhì)(氨基酸脯氨酸、1-甲基咪唑和4-甲基咪唑)之一在富含GC的模板P55G12上實(shí)驗(yàn)。在0.2ml的試管中混合下列成分13ml 2.2X PCR反應(yīng)體系、0.5ml模板DNA(10pg)、0.5ml引物混合物(各10mM)和13ml 4M化學(xué)物溶液(脯氨酸、1-甲基咪唑或4-甲基咪唑)，將溶液吹吸混勻。PCR方案是95℃，3分鐘；30個循環(huán)的94℃，30秒、55℃，30秒、72℃，1分鐘。PCR之后，向每個試管中加入5ml染料并將12ml反應(yīng)體系加入瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后通過溴化乙錠染色來顯示DNA片段。
如圖1所示，三種化學(xué)物質(zhì)均在某個濃度比其他濃度效果好。對脯氨酸來說，300到600mM時P55G12擴(kuò)增最好，而濃度高于600mM時沒有產(chǎn)物。對于1-甲基咪唑，100和200mM最有效，而更高或低的濃度或者沒有作用或者產(chǎn)物減少。對于4-甲基咪唑，稍低的濃度能增強(qiáng)擴(kuò)增60到100mM。注意PCR反應(yīng)中不加這些化合物則沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，1M甜菜堿能有效地使反應(yīng)發(fā)生。
實(shí)施例2滴定4-甲基嗎啉-N-氧化物(MMNO)來進(jìn)行富含GC的模板的PCR比較MMNO和甜菜堿在實(shí)施例1中，確定MMNO為一種新的可增強(qiáng)富含GC的模板PCR效率的試劑。下一個要解決的問題是MMNO效率與它在PCR體系中濃度的關(guān)系。在有1M甜菜堿或不同濃度MMNO的情況下，如上實(shí)施例1所述擴(kuò)增富含GC的擴(kuò)增子P55G12。
如圖2所示，PCR反應(yīng)體系中含有400到1000mM MMNO產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物在強(qiáng)度上與含有1M甜菜堿時相當(dāng)。MMNO濃度低于400mM時不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例3高GC含量擴(kuò)增子的PCR擴(kuò)增銅綠假單胞菌擴(kuò)增子銅綠假單胞菌的基因組含有高GC含量(70％)，因此難以通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。因此，在本發(fā)明所述PCR方法-PCR反應(yīng)體系中使用甜菜堿、MMNO或三甲基胺N-氧化物(TMANO)中實(shí)驗(yàn)大小在1.3到1.8kb的三種不同銅綠假單胞菌擴(kuò)增子。使用與實(shí)施例1中描述的相同的反應(yīng)制品，但這些反應(yīng)中模板DNA是30ng銅綠假單胞菌基因組DNA。DNA擴(kuò)增使用以下PCR方案95℃，5分鐘；35個循環(huán)的94℃，2分鐘、58℃，30秒和72℃，2分鐘。
如圖3所示，銅綠假單胞菌序列D在有甜菜堿或MMNO的情況下得到擴(kuò)增，而序列E和F在有甜菜堿、MMNO或TMANO的情況下得到擴(kuò)增。這些結(jié)果表明利用本發(fā)明的組合物和方法可以有效地?cái)U(kuò)增長的、富含GC的天然序列，比如來自銅綠假單胞菌基因組的序列。
實(shí)施例4甜菜堿、脯氨酸和MMNO增強(qiáng)PCR擴(kuò)增富含GC的模板的比較檢測各種濃度的甜菜堿、脯氨酸和MMNO增強(qiáng)PCR擴(kuò)增人p53外顯子10(62.2％GC)的1個156-bp片段或耐放射異常球菌DNA聚合酶Ⅰ基因的2782-bp編碼區(qū)(66.7％)的能力。變化反應(yīng)參數(shù)來評測緩沖液組分和鎂濃度的影響。
用薄壁0.2ml試管在50ml反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系含有2.5U Platinum Taq、1X Taq緩沖液(20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mMKCl)或1X Taq High Fidelity緩沖液(60mM Tris-SO4(pH8.9)、18mM(NH4)2SO4)、200mM各種dNTP以及200nM各種引物。鎂，或氯化鎂(Taq緩沖液反應(yīng))或硫酸鎂(Taq High Fidelity緩沖液反應(yīng))濃度，在1.0到2.5mM之間。各種助溶劑(甜菜堿、MMNO或脯氨酸)的量如圖所示變化。用Perkin Elmer9600型或2400型熱循環(huán)儀使反應(yīng)進(jìn)行溫度循環(huán)。擴(kuò)增人p53外顯子10序列時，反應(yīng)含有100ng K562人基因組DNA并于95℃溫育1分鐘，然后作35個循環(huán)95℃變性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸1分鐘。擴(kuò)增DNA polⅠ基因時，反應(yīng)含有20ng耐放射異常球菌基因組DNA并于95℃溫育1分鐘，然后作35個循環(huán)95℃變性30秒；55℃退火30秒；68℃延伸3分鐘。取10ml各種PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析并用溴化乙錠染色來顯示預(yù)期的DNA片段。
如圖4所示，成功擴(kuò)增156bp的人p53序列依賴于鎂濃度和特定的緩沖液條件。在不加助溶劑時，在含有常規(guī)PCR緩沖液的反應(yīng)中檢測不到特異產(chǎn)物，使用硫酸銨緩沖液(Taq High Fidelity緩沖液)的PCR中只在1.0mM MgSO4中可檢測到。加入甜菜堿、MMNO或脯氨酸助溶劑在兩種緩沖液體系中，很寬的鎂濃度范圍內(nèi)都能增強(qiáng)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量。MMNO對最適鎂濃度范圍的影響沒有甜菜堿或脯氨酸明顯。有較寬最適鎂濃度的甜菜堿或脯氨酸的濃度在Taq緩沖液中比在Taq High Fidelity緩沖液中高。
與擴(kuò)增p53外顯子10所得結(jié)果相反，MMNO能在寬的鎂濃度范圍(1.0-2.5mM)內(nèi)很有效地增強(qiáng)對Dra DNA polⅠ的2.8kb長擴(kuò)增子的PCR(圖5)。濃度在0.4到0.8M的MMNO均取得該效果，并與1M甜菜堿時觀察到的結(jié)果類似。加入脯氨酸也能有效地增強(qiáng)對DNA polⅠ片段的擴(kuò)增；但是脯氨酸的有效濃度要窄得多，并且它對鎂濃度范圍的影響沒有甜菜堿或MMNO明顯。通常，在常規(guī)Taq緩沖液中增強(qiáng)PCR所需的各助溶劑的濃度比含有Taq High Fidelity緩沖液的反應(yīng)高。這與擴(kuò)增p53外顯子10所得結(jié)果一致。不含助溶劑的反應(yīng)中沒有觀察到Dra DNA polⅠ的PCR產(chǎn)物。實(shí)施例5MMNO和脯氨酸的混合物增強(qiáng)富含GC的模板的PCR擴(kuò)增由于以上實(shí)施例的結(jié)果表明脯氨酸能有效地增強(qiáng)短的富含GC的模板的最適擴(kuò)增反應(yīng)，而MMNO能有效地增強(qiáng)長的富含GC的模板的擴(kuò)增，因此將這兩種化合物混合在一起以便研究它們能否與片段大小無關(guān)地增強(qiáng)富含GC的模板的擴(kuò)增。為了實(shí)驗(yàn)這種可能性，在有包含脯氨酸、MMNO或者它們兩者的組合物的情況下擴(kuò)增富含GC的模板。
在混合組合物中，分別以3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的比率將4M的MMNO和脯氨酸溶液合并以便形成4M的雜合助溶劑混合物。然后檢測這些混合物對p53外顯子10和Dra DNA polⅠ PCR擴(kuò)增的影響。按照前面的描述在50ml體積中含有Platinum Taq DNA聚合酶的1X Taq高度忠實(shí)緩沖液中進(jìn)行PCR反應(yīng)。對所測助溶劑的每個濃度，硫酸鎂的濃度在1.0到2.5mM之間變化。MMNO、MMNO與脯氨酸的混合物、脯氨酸以及甜菜堿的濃度如各圖中所示。
如圖6所示，MMNO和脯氨酸的混合物能有效地增強(qiáng)p53外顯子10的156bp片段的特異擴(kuò)增的鎂和助溶劑濃度范圍比每種助溶劑單獨(dú)使用時要寬。使用MMNO脯氨酸混合物還能非常有效地促進(jìn)2.8kb的DraDNA polⅠ片段的擴(kuò)增，并將單獨(dú)使用脯氨酸得到的有效鎂和助溶劑濃度顯著地?cái)U(kuò)展(圖7)。正如原來觀察到的，MMNO在全部實(shí)驗(yàn)的鎂和助溶劑濃度范圍內(nèi)能增強(qiáng)PCR擴(kuò)增?？偠灾@些結(jié)果表明使用含有N-烷基羧酸和N-烷基胺氧化物的混合物的組合物產(chǎn)生了某些新的特性，可以利用這些特性來增強(qiáng)對富含GC的模板的PCR擴(kuò)增。尤其是，MMNO和脯氨酸的比率為2∶1到1∶2的混合物可以用來增強(qiáng)大小范圍很寬的富含GC的模板的PCR擴(kuò)增，并且能在更寬的鎂濃度范圍內(nèi)提高PCR的可信度。實(shí)施例6MMNO脯氨酸混合物增強(qiáng)富含GC的模板在很寬的最適退火溫度內(nèi)的PCR
為了評價PCR助溶劑對PCR反應(yīng)中最適退火溫度的影響，利用上面描述的MMNO脯氨酸混合組合物經(jīng)PCR擴(kuò)增富含GC的模板P32D9。用薄壁的0.2ml試管(Stratagene,Inc.)在50ml體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)。50ml反應(yīng)體系含有2.5 U Platinum Taq,IX Taq High Fidelity緩沖液(60mMTris-SO4(pH 8.9)、18mM(NH4)2SO4)、1.5mM MgSO4、200mM各種dNTP、200mM各種引物、100ng K562人基因組DNA，以及加或不加助溶劑、0.5M甜菜堿，或者0.5 M 1∶1的MMNO脯氨酸。通過將等體積的4M MMNO和4M脯氨酸混合在一起來制備濃縮的MMNO脯氨酸混合物。利用帶有加熱的蓋子的梯度區(qū)段Robo-循環(huán)儀(Stratagene)經(jīng)無油操作來研究最適退火溫度。于95℃變性1分鐘后，反應(yīng)循環(huán)35次95℃，45秒；55-66℃，45秒；68℃，1分鐘。通過在0.5X TBE中進(jìn)行瓊脂糖凝膠(1％Agarose1000,Life Technologies,Inc.)電泳和溴化乙錠染色分析10ml的每種PCR反應(yīng)物。
如圖8所示，沒有PCR助溶劑時，僅在66℃得到特異的PCR產(chǎn)物，1個149bp，78.5％GC的片段。隨著退火溫度下降，產(chǎn)物得率迅速降低，導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。相反，甜菜堿和MMNO脯氨酸混合物能擴(kuò)大有效退火溫度范圍。利用MMNO脯氨酸混合物產(chǎn)生了比用甜菜堿所得的更高的產(chǎn)物得率，并且在整個66到55℃的退火溫度梯度內(nèi)都能檢測到特異產(chǎn)物。實(shí)施例7利用MMNO脯氨酸混合物擴(kuò)增脆性X位點(diǎn)CGG重復(fù)序列比較MMNO脯氨酸混合物和甜菜堿促進(jìn)有極高GC含量的DNA序列的PCR擴(kuò)增的能力。所設(shè)計(jì)的引物包括脆性X位點(diǎn)的人FMR-1基因中的CGG重復(fù)序列(GenBank編號No.X61378)。按照以上描述，利用2.5UPlatinum高度忠實(shí)Taq DNA聚合酶，100 ng K562基因組DNA和補(bǔ)充有2mM硫酸鎂(終濃度)的1X Taq高度忠實(shí)緩沖液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將如上所述制備的4M MMNO脯氨酸混合物或4M甜菜堿的樣品以不同用量加入PCR，以便使各種助溶劑終濃度為0.25M到2M。將PCR于95℃溫育1分鐘，然后進(jìn)行35個循環(huán)95℃，30秒；58℃，30秒；68℃，30秒。這些研究結(jié)果的瓊脂糖凝膠分析示于圖9。
這些研究的結(jié)果表明與甜菜堿相比，MMNO脯氨酸混合物具有更優(yōu)良的促進(jìn)極高(＞80％)GC含量的目的序列的PCR擴(kuò)增的能力。沒有PCR助溶劑時，未檢測到特異產(chǎn)物。而在含有1.75M甜菜堿的反應(yīng)中可以看到一個微弱的預(yù)期大小的條帶。相反，在含有1.5到2M MMNO脯氨酸的反應(yīng)體系中顯示出CGG重復(fù)序列的強(qiáng)擴(kuò)增。實(shí)施例8MMNO脯氨酸混合物在長PCR中的應(yīng)用已利用包含Taq DNA聚合酶和一種具有校正活性的古細(xì)菌DNA聚合酶混合物擴(kuò)增了長達(dá)40-kb的DNA片段(Barnes,W.M.,美國科學(xué)院學(xué)報(bào)912216-2220(1994))。利用設(shè)計(jì)來擴(kuò)增腺病毒2型DNA(~60％ GC)中7.77-kb或9.75-kb片段的引物檢驗(yàn)MMNO脯氨酸混合物促進(jìn)擴(kuò)增長的富含GC的序列的能力。用1pg腺病毒2型DNA(Life Technologies,Inc.)、補(bǔ)充了1.5mM硫酸鎂的1x Taq高度忠實(shí)緩沖液，以及不同量(0到1M)的MMNO脯氨酸混合物基本按照上面的描述進(jìn)行PCR，但是用2.5U Platinum高度忠實(shí)Taq DNA聚合酶，即一種來自水生棲熱菌和熱球菌GB-D種之DNA聚合酶的混合酶替代Platinum Taq DNA聚合酶。反應(yīng)體系于95℃溫育1分鐘，然后進(jìn)行35個循環(huán)95℃，30秒；58℃，30秒；68℃，10分鐘。
如圖10所示，成功地?cái)U(kuò)增出預(yù)期的7.77kb和9.75kb DNA片段依賴于含有MMNO脯氨酸助溶劑。在沒有MMNO脯氨酸的反應(yīng)體系中未檢測到特異產(chǎn)物；而加入0.25M MMNO脯氨酸混合物就得到強(qiáng)擴(kuò)增和很高的產(chǎn)物得率。長PCR中的產(chǎn)物得率對MMNO脯氨酸的用量敏感，隨著MMNO脯氨酸濃度增加，7.3和9.7kb的目的產(chǎn)物的得率均下降。實(shí)施例9補(bǔ)償型溶質(zhì)增強(qiáng)富含GC的模板的PCR擴(kuò)增許多氨基化合物都顯示出保護(hù)生物抵抗?jié)B透壓的重要功能。甜菜堿和脯氨酸是大腸桿菌中的主要滲透壓保護(hù)劑，因?yàn)檫@兩種化合物都能破壞DNA螺旋的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)富含GC的模板的擴(kuò)增，我們還考察了其他已知的和市場上銷售的滲透壓調(diào)節(jié)化合物對PCR的影響。
在50ml體積中制備PCR反應(yīng)體系，該體系含有2.5U Platinum TaqDNA聚合酶、60mM Tris-SO4(pH 8.9)、18mM(NH4)2SO4、1.5mM MgSO4、dNTP各200mM、200nM的各種引物、100ng K562人基因組DNA以及不同量的PCR助溶劑。反應(yīng)于95℃溫育1分鐘，然后進(jìn)行35個循環(huán)95℃，30秒；58℃，30秒；68℃，1分鐘。
MMNO脯氨酸混合物、甜菜堿、L-肉堿以及DL-2-哌啶酸的效力比較見圖11，一個比較ectoine和甜菜堿的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖12所示。實(shí)驗(yàn)條件基本上與以上描述的相同，只是最終反應(yīng)體積為25ml。
在這些實(shí)驗(yàn)中檢測的全部滲壓劑都能有效地?cái)U(kuò)增P32D9序列，并且顯示出很多種N-烷基羧酸衍生物都能用于促進(jìn)難于擴(kuò)增的模板(比如GC含量高的模板)的PCR擴(kuò)增。
通過有助理解的闡述和舉例，至此已詳細(xì)地描述了本發(fā)明。顯然，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不影響發(fā)明范圍或任何具體實(shí)施方案的情況下，通過在廣泛而等同的條件、制劑和其他參數(shù)范圍內(nèi)改進(jìn)或變化發(fā)明可以實(shí)施同樣的發(fā)明，并且這類改進(jìn)或變化涵蓋在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請能代表發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)水平，并且全文引作參考文獻(xiàn)，并視作每篇出版物、專利和專利申請是逐一并個別地全文引作參考文獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種用于合成核酸分子的組合物，其中包含一種或多種具有選自式Ⅰ或式Ⅱ的化學(xué)式的化合物，或其鹽或衍生物式Ⅰ 其中A是 其中X是 其中q=1-100,000，其中當(dāng)q=2-100,000時，每個式Ⅰ單體可以與其他式Ⅰ單體相同或不相同；其中Z可以與Y相同或不同；其中Y和Z各自獨(dú)立地選自-OH、-NH2、-SH、-PO3H、-CO2H、-SO3H和氫；其中f為0-2的整數(shù)，m為0-20的整數(shù)，e為0-2的整數(shù)；其中R4、R5和R6可以相同或不同，各自獨(dú)立地選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、氨基、硫醇、巰基、鹵、硝基、次氮基、羥基、羥基烷基、羥基芳基、磷酸基、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、羰基、磺?；?、磺基和酰氨基，d為0-2的整數(shù)；其中a、b和c各自獨(dú)立地為0-1的整數(shù)，條件是a、b和c中最多有兩個為0；其中R1、R2和R3可以相同或不同，各自獨(dú)立地選自a)=0；b) 其中R7和W可以相同或不同，各自獨(dú)立地選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、氨基、巰基、硫醇、鹵、硝基、次氮基、羥基、羥基烷基、羥基芳基、磷酸基、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、羰基、磺?；⒒腔王０被?；g為0-2的整數(shù)，n為0-20的整數(shù)；式Ⅱ 其中式Ⅱ是飽和或不飽和的；其中q=1-100,000，其中當(dāng)q=2-100,000時，每個式Ⅱ單體可以與其他式Ⅱ單體彼此相同或不相同；其中X選自N、C、O、P和S；其中Y選自O(shè)、N、S、P、C、-O-NH-、-O-CH2-NH-、-O-CH2-O-、-NH-CH2-NH-、-O-CH(CH3)-NH-、-NH-CH(CH3)-NH-、-O-CH(CH3)-O-、-NH-C(CH3)2-NH-、-O-S-、-O-CH2-S-、-NH-S-、-NH-CH2-S-，以及其他硫醇、磷酸基、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、磺酰基、磺基和酰氨基；其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8可以相同或不同，各自獨(dú)立地選自氫、烷基、鏈烯基、炔基、芳基、氨基、巰基、硫醇、鹵、硝基、次氮基、羥基、羥基烷基、羥基芳基、磷酸基、烷氧基、氧化物、醚、酯(烷酰氧基)、羧基、磺?；?、磺基和酰氨基；并且其中a、b、c、d、e、m、n和o是相同或不同的整數(shù)，a、b、c、d和e各自獨(dú)立地選自0-2，m、n和o各自獨(dú)立地選自0-5。
2.如權(quán)利要求1的組合物，條件是當(dāng)q=1且(R1)a、(R2)b和(R3)c之一為氧而另兩個R基團(tuán)相同或不同、各自獨(dú)立地選自氫、甲基、乙基和丙基時，A不是甲基、乙基或丙基。
3.如權(quán)利要求1的組合物，其中當(dāng)a、b或c為0時，相應(yīng)的R基團(tuán)是一對電子。
4.如權(quán)利要求1的組合物，其中Y和/或X為N且m、n和o為1。
5.如權(quán)利要求1的組合物，其中Y和/或X為N和/或O，且m和n為1，o為2。
6.如權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物包含至少兩種式Ⅰ或式Ⅱ化合物，或其鹽或衍生物。
7.如權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物包含2-5種式Ⅰ或式Ⅱ化合物，或其鹽或衍生物。
8.如權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物包含脯氨酸或其衍生物。
9.如權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物包含一種N-烷基咪唑化合物。
10.如權(quán)利要求9的組合物，其中所述N-烷基咪唑化合物是1-甲基咪唑或4-甲基咪唑。
11.如權(quán)利要求1的組合物，其中所述化合物選自4-甲基嗎啉-N-氧化物、甜菜堿、肉堿、ectoine、平均分子量為約50,000-500,000道爾頓的聚(2-乙基-2-噁唑啉)和平均分子量為約100,000-200,000道爾頓的聚(二烯丙基二甲基銨氯化物)。
12.如權(quán)利要求6的組合物，其中所述化合物選自4-甲基嗎啉-N-氧化物、甜菜堿、肉堿、ectoine、平均分子量為約50,000-500,000道爾頓的聚(2-乙基-2-噁唑啉)和平均分子量為約100,000-200,000道爾頓的聚(二烯丙基二甲基銨氯化物)。
13.如權(quán)利要求1的組合物，其中還包含一種或多種具有核酸聚合酶活性的酶。
14.如權(quán)利要求6的組合物，其中還包含一種或多種具有核酸聚合酶活性的酶。
15.如權(quán)利要求13的組合物，其中所述具有核酸聚合酶活性的酶選自DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。
16.如權(quán)利要求14的組合物，其中所述具有核酸聚合酶活性的酶選自DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。
17.如權(quán)利要求15的組合物，其中所述DNA聚合酶選自Taq,Tne,Tma,Pfu,VENTTM，DEEPVENTTM和Tth DNA聚合酶，及其突變型、變體和衍生物。
18.如權(quán)利要求15的組合物，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶選自M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RSV逆轉(zhuǎn)錄酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RAV逆轉(zhuǎn)錄酶、MAV逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶，及其突變型、變體和衍生物。
19.如權(quán)利要求15的組合物，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性基本上降低。
20.一種用于合成核酸分子的組合物，它包含一種或多種選自以下成員的組分一種或多種氨基酸，一種或多種糖，一種或多種多元醇，或其衍生物，或其組合。
21.一種通過將兩種或多種權(quán)利要求1或20中任意一項(xiàng)所述的化合物或組分組合在一起而得到的組合物。
22.一種合成核酸分子的方法，它包含(a)將核酸分子模板與一種或多種權(quán)利要求1或20所述的組合物混合形成反應(yīng)體系；以及(b)在足以形成與所述模板所有或一部分互補(bǔ)的第一核酸分子的條件下溫育所述體系。
23.如權(quán)利要求22的方法，它還包含在足以形成與所述第一核酸分子所有或一部分互補(bǔ)的第二核酸分子的條件下溫育所述第一核酸分子。
24.一種按照權(quán)利要求22的方法制得的核酸分子。
25.一種用于擴(kuò)增核酸分子的方法，它包含(a)將核酸模板與一種或多種權(quán)利要求1或20所述的組合物混合形成反應(yīng)體系；以及(b)在足以擴(kuò)增與所述模板所有或一部分互補(bǔ)的核酸分子的條件下溫育所述體系。
26.一種核酸分子的測序方法，它包含(a)將待測序的核酸分子與一種或多種引物、一種或多種權(quán)利要求1或20所述的組合物、一種或多種核苷酸以及一種或多種終止劑混合形成反應(yīng)體系；(b)在足以合成一群與所述待測序分子所有或一部分互補(bǔ)的分子的條件下溫育所述體系；以及(c)分離所述分子群，以確定所述待測序分子所有或一部分的核苷酸序列。
27.一種用于合成核酸分子的試劑盒，所述試劑盒包含一種或多種權(quán)利要求1或20所述的化合物或組分。
28.如權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述試劑盒包含至少兩種所述化合物或組分。
29.如權(quán)利要求27的試劑盒，它還包含一種或多種選自以下成員的組分一種或多種核苷酸、一種或多種DNA聚合酶、一種或多種逆轉(zhuǎn)錄酶、一種或多種適宜的緩沖液、一種或多種引物以及一種或多種終止劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)核酸分子,尤其是富含GC的核酸分子合成的組合物和方法。具體來說,本發(fā)明提供了包含一或多種含氮有機(jī)化合物(或者其鹽或衍生物)的組合物,所述化合物具有選自通式Ⅰ或通式Ⅱ的分子式,優(yōu)選是4－甲基嗎啉－N－氧化物或甜菜堿(羧甲基三甲基銨),該組合物中還包含一或多種選自脯氨酸和N－烷基咪唑化合物的化合物,更優(yōu)選脯氨酸、1－烷基咪唑或4－烷基咪唑。本發(fā)明另外涉及增強(qiáng)高忠實(shí)性合成核酸分子的方法,包括經(jīng)由擴(kuò)增(尤其是PCR)、反轉(zhuǎn)錄以及測序的方法。本發(fā)明還涉及由這些方法合成的核酸分子、其片段或衍生物,涉及包含這樣的核酸分子、片段或衍生物的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于合成、擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄或測序核酸分子的試劑盒,所述試劑盒中包含一或多種本發(fā)明的組合物。
文檔編號C07H21/00GK1299419SQ99805753
公開日2001年6月13日 申請日期1999年3月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月13日
發(fā)明者李武波, J·A·杰西, D·舒斯特, 夏九林, G·吉比尤 申請人:茵維特羅根公司