多重核酸合成的組合物和方法
【專利說明】多重核酸合成的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年3月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/792, 245號(hào)的權(quán)益 和優(yōu)先權(quán)，其通過引用全文納入本文。
[0003] 關(guān)于序列表
[0004] 本說明書包括所附序列表，其包括創(chuàng)建于2014年3月13日，名為 〃127662-014001_ST25. txt〃、大小為2. 628字節(jié)的文件，其內(nèi)容通過引用全文納入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明的方法和組合物涉及核酸組裝，并且具體地涉及高保真、多重核酸組裝反 應(yīng)。
[0006] 背景
[0007] 重組和合成核酸在研究、工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)中有許多應(yīng)用?？梢允褂弥亟M和合成核 酸來表達(dá)和獲得大量的多肽，包含酶、抗體、生長(zhǎng)因子、受體和其它可用于多種醫(yī)學(xué)、工業(yè)或 農(nóng)業(yè)目的的多肽。也可以使用重組和合成核酸來產(chǎn)生遺傳修飾的生物體，包含修飾的細(xì)菌、 酵母、哺乳動(dòng)物、植物和其它生物體。遺傳修飾的生物體可以用于研究（例如，疾病的動(dòng)物 模型、理解生物過程的工具等）、工業(yè)（例如，作為蛋白表達(dá)的宿主生物體、用于產(chǎn)生工業(yè)產(chǎn) 物的生物反應(yīng)器、環(huán)境補(bǔ)救的工具、分離或修飾具有工業(yè)應(yīng)用的天然化合物等）、農(nóng)業(yè)（例 如，具有增加的產(chǎn)率或增加的對(duì)疾病或環(huán)境壓力的抗性的經(jīng)修飾作物）和用于其它應(yīng)用。 重組和合成核酸也可以用作治療組合物（例如，用于修飾基因表達(dá)、用于基因治療等）或用 作診斷工具（例如，病癥的探針等）。
[0008] 已經(jīng)開發(fā)了多種技術(shù)用于修飾存在的核酸（例如，天然存在的核酸）來產(chǎn)生重組 核酸。例如，可以使用核酸擴(kuò)增、誘變、核酸酶消化、連接、克隆和其它技術(shù)的多種組合來產(chǎn) 生許多不同的重組核酸。經(jīng)常使用化學(xué)合成的多核苷酸作為用于核酸擴(kuò)增、誘變和克隆的 引物或銜接子。
[0009] 也發(fā)展了用于從頭核酸組裝的技術(shù)，其中制備（例如，化學(xué)合成）和組裝核酸來 產(chǎn)生較長(zhǎng)的感興趣的靶核酸。例如，已經(jīng)開發(fā)了不同的多重組裝技術(shù)用于將寡核苷酸組裝 成能用于研究、工業(yè)、農(nóng)業(yè)和/或醫(yī)學(xué)的較大的合成核酸。因此，需要高保真、低成本的合成 多核苷酸的方法。
[0010] 具體地，當(dāng)前大量申請(qǐng)重點(diǎn)關(guān)注在化學(xué)合成多核苷酸，包括來自直接基因組序列 數(shù)據(jù)的合成克隆合成法、大基因庫(kù)合成法和全合成基因組合成法。多核苷酸合成領(lǐng)域的主 要目的是快速廉價(jià)地合成大量多核苷酸。多核苷酸合成成本的主要部分是進(jìn)行多核苷酸合 成反應(yīng)的試劑成本。為了降低該成本，反應(yīng)可以小體積進(jìn)行，例如在微流體中進(jìn)行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的方面涉及產(chǎn)生至少一種靶核酸的方法。在本發(fā)明的一些方面，所述方法 允許在單一反應(yīng)體積中合成多種不同靶分子。
[0012] 在一個(gè)方面，提供生成具有預(yù)定序列的至少一種靶核酸的方法。所述方法包括（a) 提供具有第一多個(gè)突出端的多個(gè)雙鏈錨定寡核苷酸；(b)提供具有第二多個(gè)突出端的多個(gè) 雙鏈構(gòu)建寡核苷酸，其中所述第二多個(gè)突出端設(shè)計(jì)為與所述第一多個(gè)突出端互補(bǔ)；（c)雜 交并連接所述錨定寡核苷酸和所述構(gòu)建寡核苷酸；和d)任選重復(fù)步驟（a)-(c)，從而產(chǎn)生 所述至少一種靶核酸。在一些實(shí)施方式中，所述第一多個(gè)突出端設(shè)計(jì)為彼此之間相對(duì)相互 正交。所述第二多個(gè)突出端也可設(shè)計(jì)為彼此之間相對(duì)相互正交。在某些實(shí)施方式中，所述 錨定寡核苷酸或至少多種錨定寡核苷酸連接至支持物。所述支持物可為固體，例如珠。莖 環(huán)多核苷酸可替代支持物。所述錨定寡核苷酸可固定于相同支持物或各所述錨定寡核苷酸 固定于不同支持物。在一些實(shí)施方式中，步驟（a)-(d)在單一反應(yīng)體積中進(jìn)行。
[0013] 在另一方面，生成具有預(yù)定序列的至少一種靶核酸的方法可包括：(a)連接具有 第一多個(gè)突出端的第一多個(gè)雙鏈寡核苷酸和具有第二多個(gè)突出端的第二多個(gè)雙鏈寡核苷 酸，其中所述第一多個(gè)突出端設(shè)計(jì)為與所述第二多個(gè)突出端互補(bǔ)，從而生成第一組多核酸； b)連接具有第三多個(gè)突出端的第三多個(gè)雙鏈寡核苷酸和具有第四多個(gè)突出端的第四多個(gè) 雙鏈寡核苷酸，其中所述第三多個(gè)突出端設(shè)計(jì)為與所述第四多個(gè)突出端互補(bǔ)，從而生成第 二組多核酸；和（c)連接所述第一組多核酸和所述第二組多核酸，其中所述第一組多核酸 和第二組多核酸設(shè)計(jì)為具有互補(bǔ)突出端，從而形成至少一種靶核酸。在一些實(shí)施方式中，所 述第一、二、三、四多個(gè)突出端各設(shè)計(jì)為彼此之間相對(duì)相互正交。所述方法還可包括任選重 復(fù)步驟（a) - (c)。
[0014] 在其他方面，生成具有預(yù)定序列的至少一種靶核酸的方法包括：將第一多個(gè)雙鏈 寡核苷酸和第二多個(gè)雙鏈寡核苷酸連接于所述第二多個(gè)雙鏈寡核苷酸的5'末端，并將第 二多個(gè)雙鏈寡核苷酸和第三多個(gè)雙鏈寡核苷酸連接于所述第二多個(gè)雙鏈寡核苷酸的3'末 端，其中所述第一多個(gè)雙鏈寡核苷酸具有第一多個(gè)3'突出端，所述第二多個(gè)雙鏈寡核苷酸 具有第一多個(gè)5'突出端和第二多個(gè)3'突出端，且所述第三多個(gè)雙鏈寡核苷酸具有第二多 個(gè)5'突出端，其中所述第一多個(gè)3'突出端設(shè)計(jì)為與所述第一多個(gè)5'突出端互補(bǔ)，并且所 述第二多個(gè)3'突出端設(shè)計(jì)為與第二多個(gè)5'突出端互補(bǔ)；從而形成至少一種靶核酸。在一 些實(shí)施方式中，所述第一和第二多個(gè)5'和3'突出端各設(shè)計(jì)為彼此之間相對(duì)相互正交。所 述方法還可包括任選重復(fù)連接步驟。
[0015] 在另一方面，提供生產(chǎn)具有多個(gè)突出端的多個(gè)雙鏈寡核苷酸的方法。所述方法可 包括：(a)熔解第一多個(gè)鈍末端雙鏈寡核苷酸和第二多個(gè)鈍末端雙鏈寡核苷酸，形成多個(gè) 單鏈寡核苷酸；和（b)使所述多個(gè)單鏈寡核苷酸重新退火，形成具有多個(gè)突出端的多個(gè)雙 鏈寡核苷酸，其中所述多個(gè)突出端設(shè)計(jì)為彼此基本相互正交。在某些實(shí)施方式中，所述第一 和第二多個(gè)鈍末端雙鏈寡核苷酸在熔解前進(jìn)行錯(cuò)誤校正或錯(cuò)誤減少。
[0016] 在一些方面，所述方法包括提供包含單鏈5'突出端的至少多個(gè)結(jié)合支持物的雙 鏈寡核苷酸。所述多個(gè)寡核苷酸可具有預(yù)定序列。在一些實(shí)施方式中，所述單鏈突出端在其 3'末端包含與第一多個(gè)雙鏈構(gòu)建寡核苷酸的3'末端序列區(qū)域互補(bǔ)的序列區(qū)域。在一些實(shí) 施方式中，所述方法包括提供包含單鏈5'突出端的至少多個(gè)結(jié)合支持物的雙鏈寡核苷酸， 其中所述多個(gè)寡核苷酸具有預(yù)定序列，其中所述單鏈突出端在其3'末端包含與第一多個(gè)雙 鏈構(gòu)建寡核苷酸的3'末端序列區(qū)域互補(bǔ)的序列區(qū)域。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括生 成含單鏈3'突出端的至少第一多個(gè)雙鏈構(gòu)建寡核苷酸，所述單鏈3'突出端與多個(gè)結(jié)合支 持物的寡核苷酸互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括使所述至少第一多個(gè)構(gòu)建寡核苷 酸雜交至所述多個(gè)結(jié)合支持物的寡核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述方法連接所述第一多 個(gè)構(gòu)建寡核苷酸，并任選重復(fù)步驟b-d，從而生成至少靶核酸。在一些實(shí)施方式中，所述連接 步驟在連接酶存在下進(jìn)行。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，在提供步驟中，所述至少多個(gè)結(jié)合支持物的雙鏈寡核苷酸包 含多個(gè)不同單鏈5'突出端，各5'突出端與多個(gè)不同靶核酸互補(bǔ)。所述突出端可為3-20 核苷酸長(zhǎng)。
[0018] 在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)結(jié)合支持物的雙鏈寡核苷酸固定于單一支持物，例 如珠。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)靶核酸可在單一支持物上合成。在其他實(shí)施方式中，各 多個(gè)結(jié)合支持物的雙鏈寡核苷酸固定于不同支持物，從而可合成多個(gè)靶核酸，其中各靶核 酸固定于不同支持物，例如珠。在各種實(shí)施方式中，合成步驟在單一反應(yīng)體積中進(jìn)行。
[0019] 在一些實(shí)施方式中，包含單鏈突出端的多個(gè)雙鏈構(gòu)建寡核苷酸通過擴(kuò)增結(jié)合支持 物的模板寡核苷酸來生成，各結(jié)合支持物的模板寡核苷酸具有3'側(cè)接序列和5'側(cè)接序列， 各側(cè)接序列具有引物結(jié)合位點(diǎn)和限制性酶識(shí)別位點(diǎn)。所述側(cè)接序列可用IIS型限制性酶切 下。在一些實(shí)施方式中，包含單鏈突出端的多個(gè)雙鏈構(gòu)建寡核苷酸通過雜交部分互補(bǔ)的寡 核苷酸來生成。在一些實(shí)施方式中，所述雙鏈構(gòu)建寡核苷酸可進(jìn)行改組，并用例如錯(cuò)配結(jié)合 蛋白來減少錯(cuò)誤。
[0020] 在一些實(shí)施方式中，所述雙鏈構(gòu)建寡核苷酸包含N多種構(gòu)建寡核苷酸，其中所述N 多種構(gòu)建寡核苷酸跨越靶核酸的整個(gè)序列且不含缺口。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，所述方法涉及生產(chǎn)具有預(yù)定序列的至少一種靶核酸，包 括以下步驟：提供含3'突出端的N種多個(gè)雙鏈寡核苷酸，其中所述第一多個(gè)寡核苷酸在其 3'末端包含與第二寡核苷酸3'末端序列區(qū)域互補(bǔ)的序列區(qū)域，其中多個(gè)寡核苷酸N在其 3'末端包含與多個(gè)寡核苷酸（N-I)的序列區(qū)域互補(bǔ)的序列區(qū)域。所述多個(gè)構(gòu)建寡核苷酸可 通過其獨(dú)特突出端成對(duì)雜交并組裝。所述構(gòu)建寡核苷酸的組裝對(duì)可用例如連接酶連接。所 述步驟可重復(fù)以分級(jí)組裝所述至少一種靶核酸。在一些實(shí)施方式中，所述靶核酸的合成在 單一反應(yīng)體積中進(jìn)行。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明一些方面，生產(chǎn)具有預(yù)定序列的至少一種靶核酸的方法包括提供含3' 單鏈突出端的至少多個(gè)莖環(huán)寡核苷酸，其中所述單鏈3'突出端與第一多個(gè)雙鏈構(gòu)建寡核 苷酸的3'末端的序列區(qū)域互補(bǔ)?？商峁┖瑔捂?'突出端的第一多個(gè)雙鏈構(gòu)建寡核苷酸， 所述單鏈3'突出端與莖環(huán)寡核苷酸互補(bǔ)。所述至少第一多個(gè)構(gòu)建寡核苷酸可雜交至莖環(huán) 寡核苷酸并連接。合成步驟可重復(fù)，從而生成所述至少一種靶核酸。在一些實(shí)施方式中，所 有步驟在單一反應(yīng)體積中進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，所述突出端為3-20核苷酸長(zhǎng)。在一些 實(shí)施方式中，所述莖環(huán)寡核苷酸至少IOObp長(zhǎng)。
[0023] 在各種實(shí)施方式中，提供在單一合成反應(yīng)體積中合成多種多核苷酸的方法和組合 物。該方法有時(shí)稱為多重多核苷酸合成（MPS)。詳細(xì)描述三類MPS:I)系列MPS，II)分級(jí) MPS 和 III)平行 MPS。
【附圖說明】
[0024] 圖1A-1C顯示系列多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示具有突出端的寡 核苷酸雙鏈體的系列添加。圖IA顯示含具有獨(dú)特3'突出端的結(jié)合支持物或錨定寡核苷酸 雙鏈體的珠支持物。圖IB顯示通過添加補(bǔ)償寡核苷酸雙鏈體合成較長(zhǎng)構(gòu)建體。圖IC顯示 通過連續(xù)添加補(bǔ)償雙鏈體或二聚體（i，ii，iii，iv)合成子組件或全長(zhǎng)構(gòu)建體。
[0025] 圖2A-2C顯示含突出端的補(bǔ)償雙鏈寡核苷酸制備的非限制性示例方法。圖2A顯 示第一、第二、第三等補(bǔ)償二聚體（offset dimer)的各核酸（如基因）的上方鏈（單撇號(hào) [']標(biāo)記）的生成。圖2B顯示生成所述補(bǔ)償二聚體的下方鏈（雙撇號(hào)["]標(biāo)記）的相似 反應(yīng)組。圖2C顯示來自反應(yīng)孔的上方鏈和下方鏈的配對(duì)組合，對(duì)應(yīng)于各基因第一、第二、第 三等補(bǔ)償二聚體（所述第一補(bǔ)償二聚體的上方鏈和下方鏈孔混合入第一補(bǔ)償二聚體孔，所 述第二補(bǔ)償二聚體的上方鏈和下方鏈孔混合入第二補(bǔ)償二聚體孔，等）。
[0026] 圖3顯示系列多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示支持物（珠）上的具 突出端的寡核苷酸雙鏈體的第一系列添加，每個(gè)支持物具有多種錨定類型。
[0027] 圖4顯示系列多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示支持物（珠）上的具 突出端的寡核苷酸雙鏈體的第二系列添加，每個(gè)支持物具有多種錨定類型。
[0028] 圖5顯示系列多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示使用通用錨的支持物 (珠）上的具突出端的寡核苷酸雙鏈體的第一系列添加。
[0029] 圖6顯示系列多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示使用通用錨的支持物 (珠）上的具突出端的寡核苷酸雙鏈體的第二系列添加。
[0030] 圖7A-7C顯示使用莖環(huán)多核苷酸替代珠支持物的系列多重多核苷酸合成的非限 制性方法。圖7A顯示具有獨(dú)特3'突出端的莖環(huán)多核苷酸。圖7B顯示通過向所述莖環(huán)多 核苷酸添加補(bǔ)償寡核苷酸雙鏈體來合成較長(zhǎng)構(gòu)建體。圖7C顯示通過連續(xù)添加補(bǔ)償雙鏈體 或二聚體（i, ii, iii, iv)合成子組件或全長(zhǎng)構(gòu)建體。
[0031] 圖8顯示系列多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示具突出端的寡核苷酸 雙鏈體的第一添加，每珠具有一種多核苷酸錨定方式。
[0032] 圖9顯示分級(jí)多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示具突出端的寡核苷酸 雙鏈體的第二添加，每珠具有一種多核苷酸錨定方式。
[0033] 圖IOA顯示就多重多核苷酸合成而言形成補(bǔ)償二聚體的非限制性示例方法。
[0034] 圖IOB顯示就多重多核苷酸合成而言補(bǔ)償二聚體的非限制性示例序列。
[0035] 圖11顯示分級(jí)多重多核苷酸合成的非限制性示例方法。
[0036] 圖12顯示平行多重多核苷酸合成的非限制性示例方法。
[0037] 圖13A-13B顯示平行多重多核苷酸合成內(nèi)終止反應(yīng)的非限制性示例方法。圖13A 是3個(gè)補(bǔ)償二聚體A、B和C的示意圖，具有豐富的補(bǔ)償二聚體B，其設(shè)計(jì)為雜交并連接至最 終產(chǎn)物ABC。圖13B是3個(gè)補(bǔ)償二聚體A、B和C的示意圖，若補(bǔ)償二聚體B豐富，終止反應(yīng) 產(chǎn)生AB和BC。
[0038] 圖14顯示平行多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，使用具有突出端的寡核 苷酸雙鏈體的成形濃度概況以減少反應(yīng)終止。
[0039] 圖15顯示平行多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，使用系連接酶（tethered ligase)以減少反應(yīng)的終止。
[0040] 圖16顯示平行多重多核苷酸合成的非限制性示例方法，顯示對(duì)具有突出端的寡 核苷酸雙鏈體的基于珠的滴定的應(yīng)用，從而減少反應(yīng)的終止。
[0041] 發(fā)明詳述
[0042] 本發(fā)明的方面可用來高效組裝大量的核酸片段，和/或減少產(chǎn)生大核酸產(chǎn)物所需 步驟的數(shù)量，同時(shí)降低組裝錯(cuò)誤率。本發(fā)明的方面可納入核酸組裝過程來提高組裝保真度、 通量和/或效率，降低成本，和/或縮短組裝時(shí)間。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方面可以 自動(dòng)化和/或在高通量組裝環(huán)境下進(jìn)行來促進(jìn)平行產(chǎn)生許多不同的靶核酸產(chǎn)物。
[0043] 本文提供的技術(shù)方面對(duì)增加核酸合成和組裝反應(yīng)的精確性、產(chǎn)率、通量、和/或成 本效益有用。本文使用的術(shù)語"核酸"、"多核苷酸"、"寡核苷酸"可互換使用，并且指核苷酸 的天然產(chǎn)生或合成的聚合物形式。本發(fā)明所述寡核苷酸和核酸分子可以從天然產(chǎn)生的核苷 酸形成，例如形成脫氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸（RNA)分子。或者，該天然產(chǎn)生的寡核苷 酸可以包含改變其性質(zhì)的結(jié)構(gòu)修飾，例如肽核酸（PNA)或鎖核酸（LNA)。有天然產(chǎn)生堿基 或人工堿基的寡核苷酸和核酸分子的固相合成為本領(lǐng)域熟知。應(yīng)理解這些術(shù)語包含從核苷 酸類似物中生成的RNA或DNA的等同物、類似物和應(yīng)用于要描述的實(shí)施方式時(shí)的單鏈或雙 鏈多核苷酸。本發(fā)明中可用的核苷酸包含例如天然產(chǎn)生的核苷酸（例如核糖核苷酸或脫氧 核糖核苷酸），或者核苷酸的天然或合成修飾、或者人工堿基。本文使用的術(shù)語單體指小分 子組成員，其是并且能結(jié)合在一起以形成低聚物、聚合物或由兩個(gè)或更多成員構(gòu)成的化合 物。聚合物中所述單體的特定順序在本文中稱為聚合物的"序列"。所述單體組包含但不限 于例如常見L-氨基酸組、D-氨基酸組、合成和/或天然氨基酸組、核苷酸組及戊糖和己糖 組。本發(fā)明所述方面主要涉及制備寡核苷酸，也可容易地用于制備其他聚合物例如肽或多 肽、多糖、磷脂、異聚物、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亞胺、聚芳撐硫、聚硅氧烷、聚 酰亞胺、聚乙酸酯或任何其他聚合物。
[0044] 本文使用的術(shù)語"預(yù)測(cè)定序列"或"預(yù)定序列"可互換使用，指在所述聚合物合成 或組裝前已知并選擇的聚合物的序列。具體地，本文所述本發(fā)明的各方面主要涉及核酸分 子的制備，在核酸分子合成或組裝前已知且已選擇核酸的序列。在本文所提供技術(shù)的一些 實(shí)施方式中，固定的寡核苷酸或多核苷酸被用作材料來源。在各種實(shí)施方式中，本文所述方 法使用寡核苷酸，其序列基于待合成的最終多核苷酸構(gòu)建體的序列確定。在一個(gè)實(shí)施方式 中，寡核苷酸是短核酸分子。例如，寡核苷酸的長(zhǎng)度可以是10至約300個(gè)核苷酸、20至約