)還可以用于測(cè)定多個(gè)生物標(biāo)記物的差異表達(dá)。在qRT-PCR 中，RNA模板通常被逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，它隨后通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增。實(shí)時(shí)逐循環(huán)追蹤PCR產(chǎn)物的 量，這允許測(cè)定mRNA初始濃度。為了測(cè)定PCR產(chǎn)物的量，反應(yīng)可以在熒光染料存在下進(jìn)行， 如SYBR綠，它結(jié)合雙鏈DNA。所述反應(yīng)還可以用對(duì)擴(kuò)增的DNA特異性的熒光報(bào)告分子探針 進(jìn)行。
[0066] 熒光報(bào)告分子探針的非限制性實(shí)例是TaqMail?探針（Applied Biosystems， Foster City，CA)。當(dāng)在PCR延伸循環(huán)期間移除淬滅團(tuán)時(shí)熒光報(bào)告分子探針發(fā)熒光。多重 qRT-PCR可以通過使用多個(gè)基因特異性報(bào)告分子探針（每個(gè)含有不同的熒光團(tuán)）進(jìn)行。在 每個(gè)循環(huán)期間記錄熒光值并且熒光值代表擴(kuò)增反應(yīng)中至那個(gè)點(diǎn)的擴(kuò)增的產(chǎn)物的量。為了使 誤差最小化并且減少任何兩個(gè)樣本之間的差異，可以使用參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行qRT-PCR。理想的參 考標(biāo)準(zhǔn)在不同組織之間以恒定水平表達(dá)，并且不受實(shí)驗(yàn)處理影響。合適的參考標(biāo)準(zhǔn)包括但 不限于管家基因甘油醛-3-磷酸-脫氫酶（GAPDH)及(6-肌動(dòng)蛋白的mRNA。在原始樣本中 的mRNA水平或每種生物標(biāo)記物的表達(dá)的倍數(shù)變化可以使用本領(lǐng)域熟知的計(jì)算確定。
[0067] 還可以使用免疫組織化學(xué)染色來測(cè)定多個(gè)生物標(biāo)記物的差異表達(dá)。這種方法能夠 通過蛋白質(zhì)與特異性抗體的相互作用實(shí)現(xiàn)組織切片的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的定位。為此，可以 將組織固定在甲醛或另一種合適的固定劑中，包埋在蠟或塑料中，并且使用切片機(jī)切割成 薄切片（約〇. Imm至幾_厚）。另外，可以將組織冷凍并且使用恒冷切片機(jī)切割成薄切片。 可以將組織切片排列并且固定在固體表面上（即，組織微陣列）。將組織切片與針對(duì)目標(biāo)抗 原的一抗孵育，隨后沖洗以除去未結(jié)合的抗體。所述一抗可以與檢測(cè)系統(tǒng)偶合，或者可以用 與檢測(cè)系統(tǒng)偶合的二抗檢測(cè)所述一抗。檢測(cè)系統(tǒng)可以是熒光團(tuán)或者它可以是酶（如辣根過 氧化酶或堿性磷酸酶），它可以將底物轉(zhuǎn)化成比色、熒光或化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物。通常在顯微鏡下 掃描染色的組織切片。因?yàn)閬碜园┌Y受試者的組織樣本可能是異質(zhì)的，即，一些細(xì)胞可能是 正常的而其他細(xì)胞可能是癌性的，所以可以測(cè)定組織中的陽性染色細(xì)胞的百分比。這個(gè)測(cè) 量結(jié)果以及染色強(qiáng)度的定量可以用于產(chǎn)生生物標(biāo)記物的表達(dá)值。
[0068] 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定或ELISA可以用于測(cè)定多個(gè)生物標(biāo)記物的差異表達(dá)。有許多 ELISA測(cè)定的變型。所有都是基于在固體表面（通常為微量滴定板）上固定抗原或抗體。最 初的ELISA方法包括制備含有目標(biāo)生物標(biāo)記物蛋白的樣本，用樣本涂覆微量滴定板的孔， 將每個(gè)孔與識(shí)別特異性抗原的一抗孵育，沖洗未結(jié)合的抗體，并且隨后檢測(cè)抗體_抗原復(fù) 合物?？贵w-抗體復(fù)合物可以直接檢測(cè)。為此，將一抗與檢測(cè)系統(tǒng)（如產(chǎn)生可檢測(cè)產(chǎn)物的 酶）綴合?？贵w-抗體復(fù)合物可以間接檢測(cè)。為此，如上所述，通過與檢測(cè)系統(tǒng)綴合的二抗 檢測(cè)一抗。隨后掃描微量滴定板并且可以使用本領(lǐng)域已知的方法將原始強(qiáng)度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成表 達(dá)值。
[0069] 還可以使用抗體微陣列來測(cè)定多個(gè)生物標(biāo)記物的差異表達(dá)。為此，將多個(gè)抗體排 列并且共價(jià)連接至微陣列或生物芯片的表面。通常用熒光染料或生物素標(biāo)記含有目標(biāo)生物 標(biāo)記物蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)提取物。將標(biāo)記的生物標(biāo)記物蛋白質(zhì)與抗體微陣列孵育。沖洗以除 去未結(jié)合的蛋白之后，掃描微陣列?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法將原始熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化 成表達(dá)值。
[0070] 還可以使用Luminex多重微球來測(cè)定多個(gè)生物標(biāo)記物的差異表達(dá)。這些微小的聚 苯乙烯珠粒內(nèi)部用熒光染料標(biāo)記顏色，從而每個(gè)珠粒都具有獨(dú)特的光譜特征（其中最多有 1〇〇種）。用將會(huì)結(jié)合目標(biāo)靶標(biāo)（即，分別是生物標(biāo)記物mRNA或蛋白質(zhì)）的特異性寡核苷 酸或特異性抗體標(biāo)記具有相同特征的珠粒。反過來，革El標(biāo)也用熒光報(bào)告分子標(biāo)記。因此，有 兩種顏色來源，一種來自珠粒而另一種來自靶標(biāo)上的報(bào)告分子。隨后將珠粒與含有靶標(biāo)的 樣本孵育，其中在一個(gè)孔中可以檢測(cè)到最多100種。珠粒的小尺寸/表面積以及珠粒對(duì)靶 標(biāo)的三維接觸幾乎允許結(jié)合反應(yīng)期間的溶液相動(dòng)力學(xué)。捕獲的祀標(biāo)通過基于流式細(xì)胞術(shù)的 高科技射流技術(shù)檢測(cè)，其中激光激發(fā)標(biāo)識(shí)每個(gè)珠粒的內(nèi)部染料并且還激發(fā)測(cè)定期間捕獲的 任何報(bào)告分子染料。來自采集文件的數(shù)據(jù)可以使用本領(lǐng)域已知的方法轉(zhuǎn)化成表達(dá)值。
[0071] 還可以使用原位雜交來測(cè)定多個(gè)生物標(biāo)記物的差異表達(dá)。這種方法允許組織切片 的細(xì)胞中的目標(biāo)mRNA的定位。對(duì)于這種方法，可以將組織冷凍或固定并且包埋，并且隨后 切割成薄切片，將薄切片排列并且固定在固體表面上。將組織切片與將會(huì)與目標(biāo)mRNA雜交 的標(biāo)記的反義探針孵育。雜交和沖洗步驟通常在非常嚴(yán)格的條件下進(jìn)行。探針可以用可被 另一種蛋白質(zhì)或抗體檢測(cè)的熒光團(tuán)或小標(biāo)記物（如生物素或洋地黃毒苷）標(biāo)記，從而使標(biāo) 記的雜交物可以在顯微鏡下檢測(cè)和觀察?？梢酝瑫r(shí)檢測(cè)多個(gè)mRNA，前提是每個(gè)反義探針都 具有可識(shí)別的標(biāo)記。通常在顯微鏡下掃描雜交的組織陣列。因?yàn)閬碜园┌Y受試者的組織樣 本可能是異質(zhì)的，即，一些細(xì)胞可能是正常的而其他細(xì)胞可能是癌性的，所以可以測(cè)定組織 中的陽性染色細(xì)胞的百分比。這個(gè)測(cè)量結(jié)果以及染色強(qiáng)度的定量可以用于產(chǎn)生每個(gè)生物標(biāo) 記物的表達(dá)值。
[0072] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，可將標(biāo)記物水平與來自對(duì)照的標(biāo)記物水平比較，其中對(duì)照 可以包括取自一個(gè)或多個(gè)患者的一個(gè)或多個(gè)腫瘤樣本，所述患者被確定為患有某種轉(zhuǎn)移性 腫瘤或不患有某種轉(zhuǎn)移性腫瘤，或兩種情況。
[0073] 對(duì)照可以包括作為患者個(gè)體數(shù)據(jù)的同時(shí)獲取的數(shù)據(jù)（例如，在相同雜交實(shí)驗(yàn)中）， 或可以是例如儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)或計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的儲(chǔ)存值或數(shù)值集合。如果使用后者，那 么從初始或后續(xù)樣本獲取的用于選擇標(biāo)記物的新患者數(shù)據(jù)就可以與相同標(biāo)記物的存儲(chǔ)數(shù) 據(jù)比較而不需要額外的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
[0074] 標(biāo)記物表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析
[0075] 如在本文中進(jìn)一步詳述，一旦已經(jīng)獲取樣本的表達(dá)水平的測(cè)量結(jié)果，就可以對(duì)測(cè) 量結(jié)果應(yīng)用算法從而計(jì)算所述樣本的診斷評(píng)分。一般來講，確定樣本診斷評(píng)分中使用的算 法可以包括使用SVM算法、邏輯回歸算法、lasso算法、boosting算法、bagging算法、隨機(jī) 森林算法、CART算法或MATT算法。可以應(yīng)用于對(duì)本文中公開的標(biāo)記物的測(cè)量結(jié)果的實(shí)例 特異性算法包括但不限于以下（u-表示尿液標(biāo)記物，P-表示血漿標(biāo)記物）：
[0091] 在一些情況下，在確定適當(dāng)?shù)暮瘮?shù)形式之后，以其適當(dāng)?shù)暮瘮?shù)形式的所有表達(dá)標(biāo) 記物都可以匯合在邏輯回歸方程中。除了測(cè)定一致性指數(shù)之外，可以檢查模型的靈敏度和 特異性。對(duì)ROC(接受者操作特性）曲線繪圖以檢查模型的預(yù)測(cè)能力。ROC曲線只是模型靈 敏度對(duì)比假陽性率的圖形。ROC曲線下的面積（AUC)越大，模型一致性指數(shù)越好并且模型 以高靈敏度和特異性預(yù)測(cè)重現(xiàn)性越好。AUC只是ROC曲線下的面積；AUC為1表明完美的預(yù) 測(cè)能力-100%靈敏度并且〇%假陽性。AUC為0. 5表明所述模型的預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性就像隨 機(jī)可能性一樣。AUC越接近1，模型的預(yù)測(cè)能力越好。一致性指數(shù)是模型區(qū)分風(fēng)險(xiǎn)能力的度 量，換句話說預(yù)測(cè)低風(fēng)險(xiǎn)觀察結(jié)果具有低可能性并且預(yù)測(cè)所述事件處于高風(fēng)險(xiǎn)的觀察結(jié)果 發(fā)生可能性高。靈敏度是實(shí)際上稍后復(fù)現(xiàn)的檢測(cè)陽性重現(xiàn)的患者的比例。特異性是實(shí)際上 沒有復(fù)現(xiàn)的檢測(cè)陰性重現(xiàn)的患者的比例。假陽性率是1減去特異性，換句話說，它是檢測(cè)陽 性重現(xiàn)但是實(shí)際上沒有復(fù)現(xiàn)的患者的比例。
[0092] II ?定義
[0093] 如本文使用的"獲取生物樣本"或"獲取血液樣本"是指例如直接或間接地接收生 物或血液樣本。本文使用的生物樣本基本上包括無細(xì)胞體液，如血漿、血清和尿液。例如， 在一些實(shí)施方案中，生物樣本如血液樣本或含有外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞（PBMC)的樣本是直接 從處在或靠近分析生物樣本的實(shí)驗(yàn)室或地點(diǎn)的受試者獲得的。在其他實(shí)施方案中，生物樣 本可以由第三方抽取或提取并且隨后轉(zhuǎn)移到例如獨(dú)立單位或地點(diǎn)用于分析。在其他實(shí)施方 案中，可以使用床旁測(cè)試技術(shù)（P〇int-〇f care test)在相同地點(diǎn)獲取并且測(cè)試樣本。在這 些實(shí)施方案中，所述獲取是指例如從患者、從實(shí)驗(yàn)室、從醫(yī)生辦公室、從郵件、快遞員或郵局 等接收樣本。在一些其他方面，所述方法還可以包括向受試者、保健支付者、主治醫(yī)師、藥劑 師、藥房權(quán)益經(jīng)理或所述測(cè)定可能有關(guān)的任何人報(bào)告所述測(cè)定。
[0094] "受試者"或"患者"表示想要療法或診斷測(cè)試的任何單一受試者。在這種情況下， 受試者或患者通常是指人。還預(yù)期作為受試者包括的是沒有顯示任何臨床病征的臨床研究 試驗(yàn)中涉及的任何受試者，或流行病學(xué)研究中涉及的受試者，或用作對(duì)照的受試者。
[0095] 如本文使用的"表達(dá)升高"是指癌癥樣本中的表達(dá)水平相對(duì)于合適的對(duì)照（例如， 非癌性組織或細(xì)胞樣本，參考標(biāo)準(zhǔn)）提高或升高，其中基因表達(dá)水平的提高或升高是統(tǒng)計(jì) 上顯著的（P < 〇. 05)。癌癥樣本中的基因表達(dá)相對(duì)于對(duì)照的升高是否是統(tǒng)計(jì)上顯著的可以 使用適當(dāng)?shù)膖檢驗(yàn)（例如，單樣本t檢驗(yàn)、雙樣本t檢驗(yàn)、韋爾奇t檢驗(yàn)（Welch's t-test)) 或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)確定。癌癥中過表達(dá)的基因可以是例如在癌癥中過 表達(dá)的已知的或已經(jīng)先前確定的基因。
[0096] 如本文使用的"表達(dá)降低"是指癌癥樣本中的表達(dá)水平相對(duì)于合適的對(duì)照（例如， 非癌性組織或細(xì)胞樣本，參考標(biāo)準(zhǔn)）減少或降低，其中基因表達(dá)水平的減少或降低是統(tǒng)計(jì) 上顯著的（P< 0.05)。在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)的減少或降低水平可以是完全沒有基 因表達(dá)或表達(dá)水平為零。癌癥樣本中的基因表達(dá)相對(duì)于對(duì)照的降低是否是統(tǒng)計(jì)上顯著的可 以使用適當(dāng)?shù)膖檢驗(yàn)（例如，單樣本t檢驗(yàn)、雙樣本t檢驗(yàn)、韋爾奇t檢驗(yàn)）或本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的其他統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)確定。癌癥中低表達(dá)的基因可以是例如已知或已經(jīng)先前確定在癌 癥中低表達(dá)的基因。
[0097] 本文中的術(shù)語"抗原結(jié)合片段"是廣義上使用的并且特定地涵蓋完整的單克隆抗 體、多克隆抗體、由至少兩種完整的抗體形成的多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）和抗 體片段。
[0098] 本文使用的術(shù)語"引物"意欲涵蓋能夠在模板依賴性過程中引發(fā)新生核酸合成的 任何核酸。引物可以是長(zhǎng)度為十至二十和/或三十個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸，但是可以使用更 長(zhǎng)的序列。引物可以以雙鏈和/或單鏈形式提供，不過單鏈形式是優(yōu)選的。 NI.實(shí)施例
[0099] 包括以下實(shí)施例以示范本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解以下實(shí)施 例中公開的技術(shù)表示由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的，在本發(fā)明實(shí)踐中發(fā)揮良好作用的技術(shù)，并且因此 可以被認(rèn)為構(gòu)成本發(fā)明實(shí)踐的優(yōu)選模式。然而，根據(jù)本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在不 脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以在已公開并仍獲得類似或相似結(jié)果的特定實(shí)施方 案中做出許多改變。
[0100] 實(shí)施例1-患者和方法
[0101] 患者和樣本。尿液和血液樣本是從分為三個(gè)組的141名男性收集。組1包括61 名活檢之后前列腺癌陽性的患者。組2包括60名活檢之后前列腺癌陰性的患者。組3包 括20名最近進(jìn)行前列腺切除術(shù)的患者。為組1和組3中的患者提供按照Gleason評(píng)分的 腫瘤組織分級(jí)。測(cè)定并記錄每個(gè)患者的血清PSA水平。從沒有DRE的每個(gè)患者收集尿液， 立即運(yùn)送并且次日處理。收集的尿液的體積在30mL至IlOmL范圍內(nèi)。每個(gè)患者提供一個(gè) 不含防腐劑的具有不同尿量的收集杯并且所有患者提供大約9mL在EDTA中保存的外周血 液。所有工作都用具有許可形式的IRB批準(zhǔn)的流程（Western IRP)進(jìn)行并且所有樣本都從 社區(qū)實(shí)習(xí)泌尿科收集。
[0102] 尿液和血漿處理。從每個(gè)患者收集的尿液通過使用具有3kDa膜的Amcion Ultra-15離心過濾機(jī)單元離心來濃縮（Millipore，Billerica，Massachusetts)。使用浮桶 式轉(zhuǎn)頭在4, OOOx g下離心尿液直到只剩下ImL濃縮尿液。將血漿從外周血液樣本分離并 且用于提取總核酸。使用NucliSens (BioMerieux，Durham，NC)提取試劑盒從患者尿液和血 漿提取總核酸。
[0103]定量 RT-PCR。使用 RNA 超敏一步定量 RT-PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems， Foster City，California)進(jìn)行定量RT-PCR，所述系統(tǒng)使用 ViiA 7 實(shí)時(shí) PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems)，其中熱循環(huán)條件如下：50 °C持續(xù)15min的保持階段，95 °C持續(xù)2min，隨 后95 °C持續(xù)15秒和60 °C持續(xù)30秒的45個(gè)循環(huán)。用于PDUM5、PCA3、TMPRSS2 :ERG和 ERG的引物探針組作為分別具有測(cè)定號(hào)Hs00935062_ml、Hs01371939_gl、Hs03063375 和 Hs01554629_ml 的TaqMan?基因表達(dá)測(cè)定（Applied Biosystems)購(gòu)買。用于 UAPl 的引物探針組產(chǎn)生 70bp 的 PCR 產(chǎn)物：5' -TTGCAITCAGAAAGGAGCAGACT-3'（正向；SEQ ID N0:1) ;5' -CAACTGGTTCTGTAGGGTTCGTTT-3'（反向；SEQ ID N0:2)和 5' - VIC? -TGGAGCAAAGGTGGTAGA-小溝結(jié)合劑非熒光淬滅團(tuán)（MGBNNFQ)-3'（探針；SEQ ID NO :3)。 用于HSPDl的引物探針組產(chǎn)生64bp的PCR產(chǎn)物：5' -AACCTGTGACCACCCCTGAA-3'（正 向；SEQ ID N0:4) ;5'-TCTTTGTCTCCGTTTGCAGAAA-3'（反向；SEQ ID N0:5); 5' - VIC⑩ ATTGCACAGGTT