一種用于鑒別人體瘧原蟲種類的試劑盒及其方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領域,涉及人體瘧原蟲,具體來說是一種用于鑒別人體瘧原 蟲種類的試劑盒及其方法。
【背景技術】
[0002] 隨著社會和經濟的發(fā)展,以及全球瘧疾消除工作的不斷推進,許多國家的瘧疾發(fā) 病率持續(xù)下降,并逐步轉變?yōu)橐暂斎胄辕懠膊±秊橹?。在中國,?1世紀以來,本地瘧疾 病例逐年減少,分布范圍逐漸從24個省市減少為2014年的僅云南和西藏2省,但輸入性 瘧疾病例卻在逐年增加,同時報告輸入病例的省市也逐漸擴展到全國各地。由于瘧疾不再 是我國居民的常見傳染性疾病,因此,許多醫(yī)務工作者對該病及其病原體的辨識水平逐步 下降,從事該方面的專業(yè)人員亦逐年呈下降趨勢,特別是在瘧原蟲種類的鑒定方面,僅僅依 靠瘧疾診斷的金標準一鏡檢,往往不能滿足實踐的需求。因此,國家瘧疾診斷參比實驗室 依據(jù)形勢的變化和《中國消除瘧疾行動計劃(2010-2020年)》關于瘧疾病例的實驗室確診 率100%的要求,不斷尋求在現(xiàn)場更切實可行且能夠準確鑒定瘧原蟲的檢測方法。在瘧原 蟲的3種檢測方法中,以PCR為基礎的基因檢測方法,在準確確定瘧原蟲蟲種和檢測多種 瘧原蟲混合感染病例方面能夠彌補RDT和鏡檢方法的不足,已在低瘧區(qū)、無專業(yè)瘧疾鏡檢 人員的機構及瘧疾病例的復核確認工作中被廣泛推薦和應用。當前最為常用的PCR檢測 體系為Snounou設計的以核糖體RNA小亞基(SSU rRNA或18S rRNA)基因為分子標記的巢 式PCR檢測體系(NP-1993體系),及其隨后修改完成的NP-2002體系。二者在第一輪反應 和第二輪反應中分別有1條屬特異引物和種特異引物的序列不同。但這2種體系在檢測瘧 原蟲方面均存在各自的缺陷。一方面,二者第二輪擴增體系擴增的間日瘧原蟲目標片段長 度(120bp)和三日瘧原蟲的(141bp)僅有21bp的差異,在凝膠電泳圖上不宜于區(qū)分,因此 第二輪反應不易于采用多重PCR反應體系開展瘧疾病原體檢測,只能采用單一種特異引物 對,分4次分別擴增檢測;另一方面,NP-1993體系不能檢測卵形瘧中的wallikeri亞種,而 NP-2002體系雖能檢測,但除三日瘧和間日瘧外,第二輪PCR擴增獲得的卵形瘧原蟲目標片 段長度(226bp)與惡性瘧原蟲的(205bp)也僅有21bp的差異。因此,本實驗室借鑒蔡賢錚 等(2001)的雙重PCR檢測方法中的上游引物,重新設計了 4種瘧原蟲的種特異下游引物, 并對改進的新體系進行了特異性和敏感性的應用評價,以解決當前瘧疾診斷實踐中存在的 問題。
【發(fā)明內容】
[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于鑒別人體瘧原蟲種類的試劑盒及其方法,所述的 這種用于鑒別人體瘧原蟲種類的試劑盒及其方法解決了現(xiàn)有技術中檢測瘧原蟲的方法過 于繁瑣,不宜采用多重PCR-次反應進行檢測以及不能鑒別卵形瘧wallikeri亞種的技術 問題。
[0004] 本發(fā)明一種用于鑒別人體瘧原蟲種類的試劑盒,其包含五條特異性的引物,其堿 基序列分別如 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 所示。
[0005] 特異的引物序列為:
[0006] P1:5,-CGACGGTATCTGATCGTCTTC-3,;
[0007] P2 :5' -TCATGATTGAGTTCATTGTGTTTG-3' ;
[0008] P3 :5' -TGCTTTGTATATTTATAACAAAGTTG-3' ;
[0009] P4:5 ' -CAATACAACGTATCTGTTCTTTGC-3 ' ;
[0010] P5:5,-TTTTAAGGACTTTCTTTGCTTCGG-3,。
[0011] 進一步的,還含有聚合酶鏈式反應試劑、陽性對照和陰性對照,反應試劑含有l(wèi)〇 倍聚合酶鏈式反應緩沖液、滅菌的去離子水、四種脫氧核苷酸(每種脫氧核苷酸濃度為 10mM)和Taq DNA聚合酶和屬特異引物。
[0012] 10倍聚合酶鏈式反應緩沖液包括如下成份:
[0013] Tris-HCl 100mM ;
[0014] MgCl225mM。
[0015] 屬特異引物序列如下:
[0016] P6 :5, -CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC-3(SEQ ID NO:6);
[0017] P7 :5, -TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG-3' (SEQ ID N0:7)。
[0018] 本發(fā)明還提供了采用上述的試劑盒鑒別瘧原蟲種類的方法,包括如下步驟:
[0019] 1)收集待檢測的血液樣品,提取總DNA,用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋 到 0? 1 ii g/ml-〇. 4 u g/ml ;
[0020] 2)采用特異性的引物擴增DNA片段,所述的特異性的引物的堿基序列分別如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 所示;
[0021] 3)將擴增的DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳,比較PCR擴增產物結果,如果DNA片 段的大小為268bp,則表示該DNA片段代表的血液樣品中含有惡性瘧蟲,如果DNA片段的大 小為446bp,則表不該DNA片段代表的血液樣品中含有三日痕蟲,如果DNA片段的大小為 394bp,則表示該DNA片段代表的血液樣品中含有卵形瘧蟲,如果DNA片段的大小為323bp, 則表示該DNA片段代表的血液樣品中含有間日瘧原蟲,如果DNA片段不產生條帶或者不能 清晰的產生條帶,說明該血液樣品中不含有瘧原蟲。
[0022] 進一步的,當提取的DNA濃度較低時,先用SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7所述的引物 進行首輪擴增后,再以其PCR擴增產物為模板DNA,應用SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5所示特異引物進行擴增。
[0023] 進一步的,取8 ill或適量PCR產物進行電泳,使用50bp DNA ladder檢測PCR片 段大小。
[0024] 應用DNAman軟件對惡性瘧、三日瘧、卵形瘧和間日瘧原蟲18S rDNA基因序列(登 錄號M19172、AF488000、L48987和X13926)進行了比較分析,應用01igo6. 0引物設計軟件, 于其保守區(qū)間的變異區(qū)設計引物序列,并初步評價和分析5條引物間可能產生的引物二聚 體、發(fā)夾結構及Tm值等情況,從中選擇出條件較好的引物序列備用和測試,依據(jù)所測試的 引物及其擴增體系PCR擴增后獲得的不同種類瘧原蟲的目標條帶間差異是否明顯和彼此 易于區(qū)分,不同蟲種的PCR產物條帶是否單一、明晰、鮮亮,擴增體系和擴增條件是否較為 穩(wěn)定等,篩選出最好的引物序列(SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、 SEQ ID NO:5)和擴增體系。
[0025] 本發(fā)明可解決以往判斷瘧疾患者和瘧原蟲種類時,不同種類瘧原蟲的PCR擴 增條帶大小相差太少(21bp)不宜應用多重PCR擴增區(qū)分的難題,以及不能鑒別卵形瘧 wallikeri亞種的缺陷。不同的血液樣品通過總DNA的提取,對于瘧疾和瘧原蟲種類用本方 法均可以檢測和鑒別出來,本方法既可以直接準確地鑒定原蟲血癥在600個/yl以上的瘧 疾患者體內痕原蟲蟲種(含卵形痕wallieri亞種)或者102_103copy/ii 1,甚至低至14個/ yl或者18copy/yl的瘧疾患者也能被準確檢測。也可以作為第二輪反應體系,與NP-1993 的第一輪體系搭配組成新的巢式PCR反應體系(M-Nest),并可將多重PCR檢測體系的檢測 敏感性再提高10-100倍(表1-2)。應用實踐表明,M-Nest檢測體系與NP-1993具有相同 的敏感性(表3)。
[0026] 本發(fā)明和現(xiàn)有技術相比,其效果是積極和明顯的。本發(fā)明能夠簡便、快速的鑒別瘧 原蟲的種類,對于在實驗室進行各種瘧原蟲的分類研究、瘧疾的快速鑒定和控制具有十分 重要的意義。