專利名稱：包含瘧原蟲msp－1的c－末端片段的重組蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的來自感染哺乳動(dòng)物尤其是人的瘧原蟲裂殖子形式中的主要表面蛋白的疫苗活性成分，一般稱為MSP-1。
MSP-1已成為許多研究的主題。它在瘧原蟲類寄生蟲尤其是惡生瘧原蟲的裂殖體階段合成，并在瘧原蟲的肝階段和細(xì)胞階段(1,2,3,4)以裂殖子的一種主要表面成分的形式表達(dá)。因?yàn)樵摰鞍椎娘@著特征并且在所有已知的瘧原蟲屬的種類中保守，因此推測它可能是構(gòu)建抗瘧原蟲疫苗(5、6)的一個(gè)候選物。
該蛋白的片段尤其是被觀察到在例如寄生蟲進(jìn)入被感染宿主的紅細(xì)胞的侵入期間形成的天然裂解產(chǎn)物也是如此。這樣的裂解產(chǎn)物有分子量為42kDa的C-末端片段的(7、8)，其本身再次被裂解為具有通常表觀分子量為33kDa的N-末端片段和具有通常表觀分子量為19kDa的C-末端片段(9)，后者在借助于糖基磷脂酰肌醇(GPI)基團(tuán)進(jìn)行修飾后，通常仍保持固定在寄生蟲膜上(10,11)。
還在紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)育周期的早期階段發(fā)現(xiàn)該片段(15,16)，從而作出這樣的觀察結(jié)論，即19kDa片段可起到仍然未知，但毫無疑問在再侵入過程中為必需的作用，這構(gòu)成了過去形成的該蛋白可構(gòu)成疫苗的尤其有效的耙標(biāo)的假設(shè)基礎(chǔ)。
應(yīng)理解下面經(jīng)常提及的來自瘧原蟲屬的一些種類的p42和p19蛋白是指相應(yīng)的該瘧原蟲的MSP-1蛋白的C-末端裂解產(chǎn)物，或廣義地說指通過基因重組，或通過使用常規(guī)技術(shù)，如使用“AppliedSystem”合成儀的化學(xué)合成，或通過“Merrifield”型固相合成而獲得的包含基本上相同的氨基酸序列的產(chǎn)物。為了方便，所提到的“重組p42”和“重組p19”指通過包含至少一個(gè)基因工程步驟的方法而獲得的“p42”和“p19”。
面對獲得大量惡性瘧原蟲寄生蟲的困難以及不可能體外培養(yǎng)間日瘧原蟲，很清楚生產(chǎn)抗瘧原蟲疫苗的唯一方法是求助于使用重組蛋白或肽的方法。然而，由于其具有200kDa的很大的大小，生產(chǎn)全部MSP-1非常困難。這引導(dǎo)研究者研究其C-末端部分，它的(仍然未知的)作用可能更為重要。
已制備出并在猴中測試過的涉及惡性瘧原蟲MSP-1的C-末端部分的重組蛋白(12,40,41)為·大腸桿菌(40)中產(chǎn)生的與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合的p19；·大腸桿菌(12)中產(chǎn)生的與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合的p40；·與來自破傷風(fēng)類毒素的多肽融合的并帶有在釀酒酵母中產(chǎn)生的輔助T細(xì)胞表位的p19(12)；·在桿狀病毒系統(tǒng)中產(chǎn)生的p42(41)。
包含大腸桿菌中產(chǎn)生的與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合的p19蛋白，并混合有明礬或脂質(zhì)體的組合物在六個(gè)接種的Aotus nancymal猴中沒有一個(gè)顯示出保護(hù)性效果(40)。
包含大腸桿菌中產(chǎn)生的與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合的p42蛋白，并混合有弗氏完全佐劑的組合物當(dāng)給予兩類Aotus猴(A.nancymai和A.vociferans)時(shí)沒有顯示出保護(hù)性效果。釀酒酵母中產(chǎn)生的p19蛋白在兩個(gè)A.nancymai種類的Aotus猴中顯示出保護(hù)性效果(12)。而在兩個(gè)A.vociferans種類的Aotus猴中沒有保護(hù)性效果。
一些研究者(Chang等)還報(bào)導(dǎo)了在兔中使用在桿狀病毒系統(tǒng)中產(chǎn)生的含有惡性瘧原蟲(18)中共有的氨基酸序列的重組p42蛋白進(jìn)行的免疫試驗(yàn)。后邊這些作者指出在兔中重組p42基本上以與完整重組MSP-1蛋白(gp195)相同的方式起作用。該p42蛋白結(jié)合弗氏完全佐劑已成為在易被惡性瘧原蟲感染的非人靈長類Aotus、狐猴(lemurinus grisemembra)中進(jìn)行的疫苗接種試驗(yàn)中的主題(40)。結(jié)果表明3個(gè)動(dòng)物中的2個(gè)被完全保護(hù)，第三個(gè)雖然顯示出與對照類似的寄生蟲血癥，但是具有較長的潛伏期。然而推出如此誘導(dǎo)的抗寄生蟲本身的抗體的保護(hù)性是冒險(xiǎn)的。應(yīng)該記住目前對于間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲，在靈長類中沒有非常滿意的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。對于惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲開發(fā)出的松鼠猴模型，對惡性瘧原蟲開發(fā)的Aotus模型，是需要寄生蟲種類適應(yīng)并通常需要切除動(dòng)物的脾以獲得顯著的寄生蟲血癥的人工系統(tǒng)。結(jié)果，來自該模型的疫苗接種對于人類僅具有有限的預(yù)測價(jià)值。
無論如何，用該重組蛋白可能獲得的實(shí)際接種比例為多少仍是一個(gè)問題，記住下面報(bào)導(dǎo)的發(fā)現(xiàn)，即在來自瘧原蟲屬相同種類的p42，尤其是在相應(yīng)的p33中在許多情況下存在高可變區(qū)，這使得在用來自瘧原蟲屬種類的p42接種的個(gè)體中所誘導(dǎo)的抗體抗相同種類其它個(gè)體感染的免疫保護(hù)性功效不確定(13)。
甚至可假設(shè)p42的N-末端部分的高多態(tài)性在通常觀察到的對這類寄生蟲的免疫逃避中起著明顯的作用。
本發(fā)明的目的是生產(chǎn)可避免這些困難、其保護(hù)性效果在真正重要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突蛏踔林苯釉谌酥锌沈?yàn)證的接種用重組蛋白。
更具體地說，本發(fā)明提供一種抗感染人的瘧原蟲型寄生蟲的接種用組合物，它包含可能被或可能未被糖基化的重組蛋白作為活性成分，其必需的組成性多肽序列為·感染人的瘧原蟲型寄生蟲的裂殖子形式表面蛋白1的19千道爾頓的C-末端部分(p19)的序列，其中所述C-末端片段在感染周期的進(jìn)入人紅細(xì)胞的穿透階段末期通常仍然被錨定在寄生蟲表面；·或仍能誘導(dǎo)在體內(nèi)可抑制由于相應(yīng)的寄生蟲而導(dǎo)致的寄生蟲血癥的免疫應(yīng)答的所述片段之部分的序列；·或與所述p19片段或該片段的所述部分免疫學(xué)等價(jià)的多肽的序列；和所述重組蛋白進(jìn)一步包括在還原性介質(zhì)中不穩(wěn)定并優(yōu)選組成被抗相應(yīng)瘧原蟲所形成的人抗血清所識別的大部分表位的構(gòu)象表位。
該構(gòu)象表位的存在可在疫苗活性成分的保護(hù)性功效中起重要的作用。當(dāng)它們在桿狀病素系統(tǒng)中產(chǎn)生時(shí)，特別可在顯示上面定義的其它特性的活性成分中發(fā)現(xiàn)它們。如果需要，下面將提到的“桿狀病毒載體系統(tǒng)”是指由桿狀病毒型載體本身和細(xì)胞系組成的整體，尤其是可被將要轉(zhuǎn)化到這些細(xì)胞系的序列修飾的桿狀病毒轉(zhuǎn)化，并導(dǎo)致該轉(zhuǎn)化序列表達(dá)的昆蟲細(xì)胞系。在Longacre等(19)的文章中已描述了桿狀病毒系統(tǒng)中這兩種成分的優(yōu)選實(shí)例。在下面的實(shí)施例中使用相同的系統(tǒng)。當(dāng)然，不言而喻，桿狀病毒和可被桿狀病毒感染的細(xì)胞的變體可用來代替選擇的那些。
尤其是，當(dāng)它為非還原狀態(tài)或?yàn)榉遣豢赡孢€原的狀態(tài)時(shí)，該重組蛋白被抗相應(yīng)的瘧原蟲或抗類似的瘧原蟲所形成的人抗血清所識別，但當(dāng)它被不可逆地還原時(shí)，則不被或僅在很小程度上被這些相同的抗血清所識別。
在還原介質(zhì)，尤其是在存在β-巰基乙醇時(shí)，這些構(gòu)象表位的不穩(wěn)定特性可通過下面在實(shí)施例中描述的試驗(yàn)來證實(shí)。類似地，下面的實(shí)施例描述了可適用于用來獲得本發(fā)明蛋白質(zhì)的不可逆還原的實(shí)驗(yàn)條件。
從這點(diǎn)上來看，由Longacre等(14)生產(chǎn)的重組蛋白可用于該組合物。應(yīng)該記住S.Longacre等成功地在含有編碼間日瘧原蟲的p19的核苷酸序列的桿狀病毒載體系統(tǒng)中，生產(chǎn)出來自間日瘧原蟲的MSP-1的重組p19，尤其是通過在多角體蛋白啟動(dòng)子的控制下，用包含編碼下面定義的肽序列的序列的桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞〔草地夜蛾(sf9)細(xì)胞系〕的培養(yǎng)物，其中在所用的桿狀病毒載體中序列以下面的順序排列·多角體蛋白信號肽的35個(gè)堿基對的5′末端片段，其中用于啟動(dòng)該蛋白表達(dá)的甲硫氨酸密碼子已突變(為ATT)；·編碼對應(yīng)于MSP-1N-末端部分的32個(gè)氨基酸肽的5′-末端核苷酸片段，包括MSP-1信號肽；·編碼p19的核苷酸序列，或編碼間日瘧原蟲的MSP-1蛋白的p42的序列，根據(jù)情況，以帶有(被“錨定”形式)或失去(可溶形式)這些核苷酸序列的3′末端區(qū)的形式來提供這些序列，其最終C-末端表達(dá)產(chǎn)物被認(rèn)為在將最終p19蛋白錨定在寄生蟲膜上起著實(shí)質(zhì)性作用；·2TAA終止密碼子。
對于p42，來自MSP-1的C-末端區(qū)的序列從氨基酸Asp1325延至氨基酸Leu1726(錨定形式)或至氨基酸1705(可溶形式)，對于p19，序列從氨基酸Ile1602延至氨基酸Leu1726(錨定形式)或至氨基酸Ser1705(可溶形式)，應(yīng)理解其起始和終止氨基酸已在上面描述的p42和p19的全部氨基酸序列是根據(jù)已測序的間日瘧原蟲的Belem分離物的基因(20)得來的。
使相同的載體系統(tǒng)中，使用編碼猴瘧原蟲的p42和p19的核苷酸序列獲得類似結(jié)果。對于猴瘧原蟲的興趣是雙重性的，它是感染恒河猴的與間日瘧原蟲極其接近的寄生種類。它還可感染人。而且，猴瘧蟲的天然宿主恒河猴和高帽猴(toque macaque)的可接近性也使得可檢測來自猴瘧原蟲的MSP-1在天然系統(tǒng)中的保護(hù)功效。對于在人類中的反應(yīng)，恒河猴被認(rèn)為是最具代表性的一個(gè)種類。
尤其是，在使用高帽猴和兩種重組多肽可溶性的p42和尤其是來自猴瘧原蟲的可溶性p19進(jìn)行的接種試驗(yàn)中已獲得了極好的結(jié)果，其中該兩種重組多肽分別在桿狀病毒系統(tǒng)中產(chǎn)生并在具有識別天然MSP-1蛋白的相應(yīng)區(qū)域的單克隆抗體的親和柱上純化。進(jìn)行下面觀察在攻擊感染后，僅用p19(三只猴子)及用p19和p42一起(三只猴子)免疫的六只猴子事實(shí)上均顯示出幾乎無效的免疫性。在用p42免疫的三只猴子中獲得的結(jié)果是不顯著的。它們中的兩個(gè)如上所述，但是由于第三個(gè)顯示出比在存在弗氏佐劑時(shí)用PBS緩沖液免疫的對照(3只猴子)或未免疫(3只猴子)時(shí)低的寄生蟲血癥，因此不甚清楚。
第二次攻擊感染表明僅獲得p19的猴子被保護(hù)了至少六個(gè)月。在該系統(tǒng)中(高帽猴，猴瘧原蟲)用p19及明礬進(jìn)行的第二次接種試驗(yàn)顯示出對于3只猴子中的2只猴子的明顯保護(hù)。這是首次證實(shí)在存在明礬時(shí)MSP-1或其它重組抗原的保護(hù)性效果(42)。
使用恒河猴，用在桿狀病毒系統(tǒng)、采用來自猴瘧原蟲的重組p19產(chǎn)生的重組多肽進(jìn)行的特別有效的試驗(yàn)結(jié)果表明，各自包含來自其它瘧原蟲的重組p19的重組多肽必定以相同方式起作用。對于在人類中的瘧原蟲，它們比來自在“人工宿主”中用間日瘧原蟲或惡性瘧原蟲進(jìn)行的試驗(yàn)的結(jié)果更有意義。
來自C-末端MSP-1部分(p19)的桿狀病毒重組蛋白在天然系統(tǒng)中具有極其顯著的抗瘧原蟲保護(hù)性效果，這構(gòu)成了用于評價(jià)MSP-1對人的保護(hù)性效果的最具代表性的模型。
如果p19形式失去p42的N-末端部分的高可變區(qū)，則獲得的保護(hù)性效果可選一步提高，它的效果在被接種的個(gè)體面臨許多多態(tài)性的自然情況下可以是有害的。而且，p19看來擁有在p42中不存在的特定表位。
19kDa C-末端片段(其序列存在于疫苗活性成分中)在不存在通常位于相應(yīng)的MSP-1蛋白中的p19序列的上游的任何多肽序列時(shí)，可以被限制在p19本身的序列?？墒呛茱@然，如果其存在不改變疫苗的活性成分的免疫學(xué)特性，則活性成分的必需組成性多肽序列還可包含屬于p42自然裂解之前仍與相應(yīng)的p19相連的33kDa(p33)N-末端片段的C-末端一側(cè)的多肽序列。如從下面尤其是在實(shí)施例的描述中將看到的，瘧原蟲屬的相同種類的各個(gè)株中p33的C-末端序列(參見圖4中“區(qū)Ⅲ”肽序列的C-末端部分)也具有一定程度的同源性或基本保守的序列，例如在感染人的瘧原蟲的不同變種中程度為至少80％，這樣它們基本上不改變活性成分的接種性質(zhì)(圖4中其序列相當(dāng)于區(qū)Ⅳ)，尤其是使用從該圖中得到的假設(shè)時(shí)；在p19和p33的區(qū)Ⅲ之間的推測的裂解位點(diǎn)位于特別保守區(qū)(LNVQTQ)中的亮氨酸和天冬酰胺殘基之間。
當(dāng)存在時(shí)，p33的C-末端多肽序列通常包含少于50個(gè)氨基酸殘基，或甚至少于35，優(yōu)選少于10個(gè)氨基酸殘基。
相反，疫苗的活性成分的必需組成性多肽序列不需要包含編碼p19的全部序列，當(dāng)然前提是保持誘導(dǎo)抗寄生蟲的抗體的能力。尤其是，“片段部分”的分子量為10-25kDa，尤其是10-15kDa。優(yōu)選地，該多肽片段部分包含兩個(gè)EGF(表皮生長因子)區(qū)的至少一個(gè)。
顯然，技術(shù)人員可區(qū)分活性片段和不再有活性的那些片段，尤其通過實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生含具有不同長度來源于p19的插入物的修飾載體，分別通過與適宜的限制性酶反應(yīng)，或通過外切核酸酶與編碼p19的片段接觸不同時(shí)間，從編碼p19的序列獲得所述插入片段；可接著檢測來自由相應(yīng)修飾的載體轉(zhuǎn)化的相應(yīng)真核細(xì)胞，尤其是昆蟲細(xì)胞中的這些插入物的表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)生保護(hù)性效果的能力，尤其是在下面實(shí)施例中描述的實(shí)驗(yàn)條件下。特別地，這些插入物的表達(dá)產(chǎn)物必須能抑制體內(nèi)由相應(yīng)的完整的寄生蟲所引導(dǎo)的寄生蟲血癥。
因此，本發(fā)明包括所有接種用組合物，其中活性成分的必需組成性多肽序列由可誘導(dǎo)與由p19或上面定義的片段產(chǎn)生的等價(jià)細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的肽構(gòu)成，前提是在序列中加入、缺失一些氨基酸或被其它的氨基酸取代將不導(dǎo)致被修改的肽的抑制所述寄生蟲血癥的能力的大的改變-下文稱為“免疫等價(jià)肽”。
p19片段自然也可以在N-末端側(cè)或C-末端側(cè)或借助于肽鍵與具有接種潛力的其它胞質(zhì)蛋白片段相連(如來自間日瘧原蟲(29)的Duffy結(jié)合蛋白或來自惡性瘧原蟲的EBA-175(30)和(31)，它的一個(gè)區(qū)特異性地富含半胱氨酸)，前提是它抑制體內(nèi)通常由相應(yīng)寄生蟲所誘導(dǎo)的寄生蟲血癥的能力不發(fā)生變化，除非被增大。
在p19的N-末端最后的上游，編碼p19或其部分的片段還可包含例如所采用的信號肽的C-末端片段的不同肽序列，如MSP-1蛋白的信號肽片段。該序列優(yōu)選包含少于50個(gè)氨基酸，例如10-40個(gè)氨基酸。
這些評述類似地適合于來自其他瘧原蟲尤其是惡性瘧原蟲的p19，惡性瘧原蟲是寄生蟲中主要的種類，引起一種最嚴(yán)重瘧疾形式。
然而，如果要獲得能進(jìn)行免疫保護(hù)性試驗(yàn)的可觀數(shù)量，非常難于將上面總結(jié)的在桿狀病毒系統(tǒng)中產(chǎn)生間日瘧原蟲或猴瘧原蟲的重組p19的方法不加改變地更換到的產(chǎn)生惡性瘧原蟲的重組p19中，而產(chǎn)生令人滿意的產(chǎn)率。
本發(fā)明還提供在很大程度上克服這個(gè)問題的方法。這樣在桿狀病毒系統(tǒng)的表達(dá)載體中還可以使用替代天然核苷酸序列的編碼惡性瘧原蟲p19的合成核苷酸序列來獲得更高產(chǎn)率的惡性瘧原蟲p19和面臨類似困難的其它瘧原蟲的p19，其中該合成核苷酸序列編碼相同的p19，但其特征在于具有比天然核苷酸序列更高的G和C核苷酸比例。
換句話說，本發(fā)明是依據(jù)下面發(fā)現(xiàn)而得出的，即在桿狀病毒系統(tǒng)中編碼p19的核苷酸序列的表達(dá)明顯與待表達(dá)核苷酸序列中的連續(xù)密碼子與可被桿狀病毒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的“細(xì)胞機(jī)器”的提高的相容性相關(guān)，這在通常包含在這些桿狀病毒中并在被感染宿主細(xì)胞中表達(dá)的天然核苷酸序列中可觀察到；因此天然惡性瘧原蟲核苷酸序列的表達(dá)不好或甚至完全沒有表達(dá)；因此也可能解釋了由Longacre等(14)觀察到的在桿狀病毒系統(tǒng)中間日瘧原蟲的p19的更為有效的表達(dá)，以及發(fā)明人已證明的來自相應(yīng)的天然p19核苷酸序列的猴瘧原蟲的序列，因?yàn)樗鼈儽染幋a惡性瘧原蟲p19的天然核苷酸序列具有相對更大量的G和C核苷酸。
因此本發(fā)明更一般地提供一種重組桿狀病毒類型的修飾載體，在包含于所述載體中并被所述載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞識別的啟動(dòng)子的控制下，其包含編碼可被桿狀病毒系統(tǒng)利用的信號肽的第一核苷酸序列，其特征在于第二核苷酸序列位于第一核苷酸序列下游，也受所述啟動(dòng)子的控制并編碼肽序列·感染人類的非間日瘧原蟲的瘧原蟲類寄生蟲的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1蛋白)的19千道爾頓(p19)的C-末端片段的序列，在感染周期中，該C-末端片段在進(jìn)入紅細(xì)胞的穿透階段的末期通常仍然被錨定在寄生蟲表面；·或該肽片段的一部分，前提是來自桿狀病毒系統(tǒng)中的第二序列的表達(dá)產(chǎn)物仍能誘導(dǎo)可抑制體內(nèi)由于相應(yīng)寄生蟲導(dǎo)致的寄生蟲血癥的免疫應(yīng)答；·或通過氨基酸的加入、缺失或取代但不導(dǎo)致其誘導(dǎo)類似于由所述p19肽片段或所述片段的所述部分產(chǎn)生的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答能力發(fā)生大的改變的所述C-末端肽片段(p19)或所述肽片段部分的免疫等價(jià)肽；和如果需要，所述核苷酸序列具有構(gòu)成它的全部核苷酸的40％-60％范圍的G和C核苷酸含量，優(yōu)選至少50％?？赏ㄟ^構(gòu)建合成基因獲得該序列，其中天然密碼子已被變化為不改變它們翻譯(保持肽序列)的富含G/C的密碼子。
由合成DNA提供的核苷酸序列相對于天然基因序列或cDNA，可能具有至少10％改變的密碼子，但仍保留了天然翻譯序列的特征，即保持氨基酸序列。
不能排除G和C核苷酸含量可進(jìn)一步增加，前提是由此導(dǎo)致產(chǎn)生的重組肽，或免疫等價(jià)肽的氨基酸序列的改變尤其是在下面將描述的試驗(yàn)中不導(dǎo)致形成的重組蛋白的免疫性質(zhì)或保護(hù)性性質(zhì)的喪失。
這些評述自然適用于感染人類的其它瘧原蟲，尤其是其中編碼相應(yīng)p19的天然核苷酸序列具有與桿狀病毒系統(tǒng)中的有效表達(dá)相容不好的T和A核苷酸含量的那些。
編碼所使用信號的序列可為通常與有關(guān)的瘧原蟲的天然序列相關(guān)的那些。如果可被識別作為桿狀病毒系統(tǒng)中的信號時(shí)，則它還可來源于其它瘧原蟲，如間日瘧原蟲或猴瘧原蟲或其它生物。
在一種情況下，所述載體中的編碼p19或其片段的序列失去將天然蛋白錨定在為其來源寄生蟲上的序列，在這種情況下，表達(dá)蛋白通常被分泌至培養(yǎng)基中(可溶形式)。在這方面也很明顯，即在本發(fā)明的條件下，產(chǎn)生的重組蛋白的可溶和錨定形式，尤其是當(dāng)它們來自惡性瘧原蟲或猴瘧蟲或間日瘧原蟲時(shí)，趨于形成寡聚體，這個(gè)性質(zhì)可能作為所形成重組蛋白的增加的免疫原性的原因。
本發(fā)明還涉及這樣的載體，其中編碼序列包含編碼通常參與誘導(dǎo)將天然蛋白錨定在表達(dá)它的宿主的細(xì)胞膜上的p19的疏水性C′-末端的最后序列的最后的3′-末端序列。該3′-末端的最后序列對于編碼可溶性p19部分的序列也可以是異源的，例如當(dāng)它編碼將產(chǎn)生的整個(gè)重組蛋白錨定在所采用的桿狀病毒系統(tǒng)的宿主的細(xì)胞膜上的序列時(shí)，相當(dāng)于來自間日瘧原蟲或來自其它生物的3′-末端序列。該錨定序列的一個(gè)實(shí)例為可在草地夜蛾(32)類型的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的CD59抗原的GPI或CD14人蛋白(33)的GPI。
本發(fā)明自然還涉及重組蛋白，這些蛋白包括被抗相應(yīng)的瘧原蟲所形成的人血清所識別的構(gòu)象表位。
通常，本發(fā)明還涉及上述類型的任何重組蛋白，前提是它包含例如在桿狀病毒系統(tǒng)中產(chǎn)生的那些構(gòu)象表位，尤其是在還原介質(zhì)中不穩(wěn)定的那些。
本發(fā)明自然還涉及所述重組蛋白，不論它們?yōu)榭扇苄问交虮痪哂绣^定區(qū)，尤其是錨定至桿狀病毒系統(tǒng)所采用的細(xì)胞宿主上的形式。
本發(fā)明還包括在所采用的桿狀病毒系統(tǒng)中自發(fā)產(chǎn)生的或使用常規(guī)蛋白質(zhì)寡聚體化方法隨后產(chǎn)生的寡聚體。最常用的方法包括戊二醛法。然而，可使用任何用于橋接蛋白中各個(gè)胺與羧基官能團(tuán)的常規(guī)系統(tǒng)。作為實(shí)例，可使用描述在歐洲專利申請EP-A-0602079中的任何方法。
術(shù)語“寡聚體”指包含2-50個(gè)單體單元的分子，每個(gè)單體單元包含如上所定義的能形成聚集物的p19或其片段。本發(fā)明還包括如上定義的p19或p19片段與用于生產(chǎn)疫苗的載體分子，如聚賴氨酸-丙氨酸，借助于共價(jià)或非共價(jià)鍵形成的任何結(jié)合產(chǎn)物。利用它們的接種用組合物也形成了本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及采用這些寡聚或結(jié)合重組蛋白，包括來自間日瘧原蟲的蛋白的疫苗組合物，其中這些評述也延伸至這些重組蛋白寡聚體。
本發(fā)明還包括這樣的組合物，其中上面定義的重組蛋白與佐劑如明礬結(jié)合。包含允許它們錨定至產(chǎn)生它們的細(xì)胞的膜上的C-端末端區(qū)的重組蛋白可有利地與可形成適于生產(chǎn)疫苗的脂質(zhì)體的脂質(zhì)一起結(jié)合使用。非限制性地，可使用描述在J.Delattre等，INSERM,1993的題目為“Les liposomes aspects technologique biologique etpharmacologlque”〔脂質(zhì)體工藝學(xué)、生物學(xué)和藥理學(xué)狀況〕的出版物中脂質(zhì)。
無論對于適當(dāng)?shù)慕臃N部分為同源或異源的錨定區(qū)，重組蛋白中的錨定區(qū)的存在促進(jìn)親細(xì)胞抗體的產(chǎn)生，尤其是在鼠中可具有特別高的保護(hù)性活性的IgG2a和IgG2b類型，這樣可省去將這樣構(gòu)建的疫苗活性成分與用來產(chǎn)生脂質(zhì)體形式的非脂質(zhì)佐劑結(jié)合。這相當(dāng)于一個(gè)很大的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樵谑蛊淠鼙毁A存和運(yùn)輸?shù)臈l件下，脂質(zhì)體可被冷凍干燥，而不需要一系列的冷貯存措施。
本發(fā)明的其它特征從下面對本發(fā)明重組蛋白及可產(chǎn)生它們的條件的實(shí)施例的描述中將變得很清楚。這些實(shí)施例不限制本發(fā)明的范圍。
PfMSP1p19S(可溶)(來自惡性瘧原蟲的可溶性p19)的構(gòu)建的描述重組構(gòu)建物pfMSP1p19S包含對應(yīng)于8個(gè)堿基對的前導(dǎo)序列和來自間日瘧原蟲MSP-1的頭32個(gè)氨基酸即從Met1-Asp32(Belem分離物；Del Portillo等，1991,P.N.A.S.,88,4030)，接著是GluPhe(由于連接兩個(gè)片段的EcoR1位點(diǎn))的DNA。這后面是

圖1描述的編碼惡性瘧原蟲MSP1p19從Asn1613-Ser1705的合成基因(Uganda-Palo Alto分離物；Chang等，1988，實(shí)驗(yàn)寄生蟲學(xué)，67,1)。構(gòu)建物由兩個(gè)TAA終止密碼子終止。該構(gòu)建物產(chǎn)生的重組蛋白從昆蟲細(xì)胞中分泌在培養(yǎng)物上清中。
為了比較，用相同方法在類似于用來產(chǎn)生上面p19的條件下產(chǎn)生重組構(gòu)建物，但是使用由Chang等，實(shí)驗(yàn)寄生蟲學(xué)67,1；1989描述的惡性瘧原蟲株(FUP)的相應(yīng)DNA的直接拷貝構(gòu)成的編碼序列。天然的基因拷貝(從天冬酰胺1613-絲氨酸1705)通過PCR從天然基因形成。
圖1A表明合成基因(Bac19)和“天然基因”(pF19)的序列。
可以看出編碼來自惡性能瘧原蟲的p19的天然序列的93個(gè)密碼子中的57個(gè)密碼子發(fā)生了改變(它們中的55個(gè)的第三個(gè)核苷酸和其它2個(gè)密碼子中的第一和第三個(gè)核苷酸)。在上述條件下，將新的密碼子加入到5′末端以導(dǎo)入肽信號并導(dǎo)入用于克隆的EcoRⅠ位點(diǎn)，類似地加入在惡性瘧原蟲p19中不存在的兩個(gè)終止密碼子以獲得表達(dá)終止信號。位于連續(xù)密碼子上面的各個(gè)字母對應(yīng)于各個(gè)連續(xù)的氨基酸。星號(*)表示終止密碼子。垂直線表明在兩個(gè)序列中相同的核苷酸。PfMSP1p19A構(gòu)建(錨定的GPI)(惡性瘧原蟲的錨定p19)的描述PfMSP1p19A構(gòu)建物具有上面的特征，只是合成序列(圖1B)編碼惡性瘧原蟲的MSP1p19(Uganda-palo alto分離物)從Asn1613到Ile1726，接著是兩個(gè)TAA終止密碼子。該構(gòu)建物產(chǎn)生通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)類型的結(jié)構(gòu)錨定在感染細(xì)胞的質(zhì)膜上的重組蛋白。
圖1C代表在切除信號序列之前的PfMSP1p19S重組蛋白序列。
圖1D代表在切除信號序列之后的PfMSP1p19S重組蛋白序列。
圖1C和1D中下劃線的氨基酸來自于用來連接來源于間日瘧原蟲的MSP-1的N-末端部分的核苷酸序列(具信號肽)和惡性瘧原蟲的MSP-1p19的EcoRⅠ位點(diǎn)。
圖2通過免疫印跡，在存在(還原)或不存在(非還原)B-巰基乙醇時(shí)，使用SDS-PAGE分析通過免疫親和純化的可溶性重組PfMSP1p19抗原。在2％SDS存在下，加熱至95℃后，將樣品上樣至凝膠中。在這些條件下，僅有共價(jià)鍵(二硫橋)可以抵抗解聚作用。左手邊的印跡用與天然p19的線性表位反應(yīng)的單克隆抗體來顯示。右手邊的印跡用來自由于惡性瘧原蟲而具有對瘧原蟲的獲得性免疫的個(gè)體的13份人抗血清的混合物來顯示。這些結(jié)果表明重組桿狀病毒分子可重現(xiàn)其大部分被人抗血清識別的聚合物形式的構(gòu)象表位。
圖2B在非還原(NR)，僅在帶電介質(zhì)中還原(R)和被不可逆還原(IR)條件下，用來自間日瘧原蟲和猴瘧原蟲的純化的重組MSP-1p19的人抗血清進(jìn)行的免疫印跡分析本項(xiàng)工作是基于這樣一種想法，即桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)大量正確重現(xiàn)在體內(nèi)存在于MSP-1的C-末端部分的構(gòu)象表位。測定這種性質(zhì)的最好方法(在不存在相當(dāng)于p19的天然純化的蛋白時(shí)，它可能是唯一可能的方法)是研究重組蛋白與暴露于瘧原蟲的個(gè)體抗血清的反應(yīng)性，這反映出如人免疫系統(tǒng)“看見”的天然蛋白。
因此，在存在(還原的)或不存在(非還原的)DTT時(shí)，使用SDS-PAGE(15％)，通過免疫印跡分析免疫親和純化的可溶性重組PvMSP-1p19和PcMSP-1p19抗原。在2％SDS存在下，加熱至95℃后，將樣品上樣至凝膠中。如下進(jìn)行不可逆的還原將蛋白重新懸浮于0.2M Tris-HCl,pH8.4,100mM DTT,1.0％SDS中，并在70℃加熱30分鐘。在用水稀釋后，加入丙烯酰胺至最終濃度為2M,37℃下，在氮?dú)夥罩性诤诎抵袑⒒旌衔锉?小時(shí)。用來自由于間日瘧原蟲而具有對瘧原蟲的獲得性免疫的個(gè)體的25份人抗血清的混合物來顯示免疫印跡。V和C分別指來自間日瘧原蟲和猴瘧原蟲的MSP-1的蛋白。應(yīng)該注意到不可逆還原的重組蛋白未顯示出與人抗血清的反應(yīng)性，而非不可逆還原的蛋白或未還原的蛋白顯示出良好的反應(yīng)性。(由于在其糖基化狀態(tài)時(shí)與硝酸纖維素紙結(jié)合不好，所以未還原的Pv MSP-1p19有些弱)。這些結(jié)果表明人抗血清對桿狀病毒MSP-1p19分子的識別大部分取決于(如果不是完全)對還原作用敏感的在該系統(tǒng)中被重制的構(gòu)象表位。
圖3-37℃下，在存在來自惡性瘧原蟲裂殖子并用等電聚集分離的蛋白級分時(shí)，將可溶性PvMSP1p42重組抗原(Longacre等，1994，同上)保溫5小時(shí)。接著在存在(還原的)或不存在(未還原的)β-巰基乙醇時(shí)，通過免疫印跡分析樣品。將等電聚焦級分5-12和在存在(Tex)或不存在(T)去污劑時(shí)制備的兩個(gè)全裂殖子提取物進(jìn)行分析。用對間日瘧原蟲的MSP1p42和MSP1p19特異性的單克隆抗體顯示免疫印跡，結(jié)果表明在可用去污劑提取的惡性瘧原蟲裂殖子中具有蛋白水解活性。在一些級分中的對p42的消化看來導(dǎo)致消化產(chǎn)物(p19)的聚合作用；這種聚合作用可能與二硫橋的形成相關(guān)，因?yàn)樵诖嬖讦?巰基乙醇時(shí)，高分子量形式消失而有利于分子量為約19kDa的分子(Tex-R)。因此在這些實(shí)驗(yàn)中觀察到的p19的聚合作用可以是該分子在體內(nèi)的固有性質(zhì)。
圖3B:p42和p19抗原對間日瘧原蟲抗-MSP-1人應(yīng)答的不同分布使用如下的ELISA抑制方法，比較對間日瘧原蟲具有獲得性免疫的個(gè)體的抗血清對間日瘧原蟲MSP-1p42和p19抗原的識別。將來自由于間日瘧原蟲而具有對瘧原蟲的獲得性免疫的個(gè)體的25份人抗清血的混合物稀釋至1∶5000，室溫下，單獨(dú)地或在存在1mM純化的間日瘧原蟲重組p42或p19時(shí)保溫4小時(shí)。將混合物轉(zhuǎn)移至已在4℃下用500ng/ml純化的吸附重組p42或p19包被18小時(shí)的微量滴定孔中，并在室溫下保溫30分鐘。在用含0.1％Tween 20的PBS洗滌后，加入與過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG,37℃下，將混合物保溫1小時(shí)。通過在492nm下讀取光密度來獲得酶活性。根據(jù)不存在競爭性抗原時(shí)對微量滴定平板上覆蓋抗原的100％抗血清活性的值來計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù)。使用Statview程序來計(jì)算統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。每一個(gè)柱代表根據(jù)4-12次測定的競爭/吸附抗原對的平均抑制百分?jǐn)?shù)；豎線相當(dāng)于95％置信區(qū)間。星號(*)指在存在衣霉素時(shí)產(chǎn)生的抗原，因此沒有N-糖基化。這些測定的重要參數(shù)為對抗血清在ELISA曲線敏感區(qū)域內(nèi)的1∶5000稀釋，以及包括低親和性表位競爭的1mM競爭性抗原濃度。因此這些數(shù)據(jù)反映出兩個(gè)被比較抗原之間的最大相似性。結(jié)果表明大多數(shù)(如果不是所有)被人抗血清識別的p42表位存在于p19中，因?yàn)樵诖嬖诤笳邥r(shí)，人抗血清抗p42的反應(yīng)性的抑抑制與被p42抗原本身的抑制一樣多。然而，相反，由于人抗血清抗p19的反應(yīng)性被p42的抑制比被p19本身的抑制小得多，因此約20％由人抗血清識別的p19表位不存在于p42或在p42上不可接近。僅在將p42裂解為p19和p33后者才形成或釋放該p19的特異性表位。這些結(jié)果不受糖基化作用的影響表明這種作用確實(shí)是由于p19和p42的肽成分之間的差異而不是由于糖基化作用的差異。這些結(jié)果預(yù)示這樣一個(gè)事實(shí)，即p19具有與p42截然不同的免疫性質(zhì)。PcMSP1p19S(可溶性)構(gòu)建物(猴瘧蟲的可溶性p19)的描述從猴瘧原蟲株(P.cynomolgi ceylonesis)(22-23)的克隆獲得用于上面構(gòu)建物的DNA。該蟲株通過其天然宿主(Macaca sinica)連續(xù)傳代和借助于蚊子的循環(huán)傳播(27)而得以保持。
處于成熟裂殖體階段的血液寄生蟲從當(dāng)寄生蟲血癥達(dá)到5％水平時(shí)的被感染的猴子中獲得。接著使用在(25)中描述的方法對它們進(jìn)行純化。按在(26)中所描述的提取DNA。
使用圖4中劃線的來自間日瘧原蟲的寡核苷酸，借助于PCR反應(yīng)產(chǎn)生1200個(gè)堿基對的片段。5′寡核苷酸包含EcoRⅠ限制性位點(diǎn)，3′寡核苷酸包含兩個(gè)合成TAA終止密碼子，其后是BgⅢ位點(diǎn)。借助于這些EcoRⅠ和BgⅢ位點(diǎn)以及連接反應(yīng)將該片段導(dǎo)入已包含間日瘧原蟲MSP-1蛋白信號序列的pVLSV200質(zhì)粒(19)中。該新質(zhì)粒(pVLSV200C42)被用來分析DNA序列。
比較猴瘧原蟲和相應(yīng)的間日瘧原蟲的序列。黑色箭頭表示推測的第一和第二個(gè)裂解位點(diǎn)。通過從惡性瘧原蟲的已知位點(diǎn)類推來確定它們(27,28)。豎線和水平箭頭定位所研究約4個(gè)區(qū)域的界限。區(qū)域4相當(dāng)于編碼猴瘧原蟲p19的序列、糖基化位點(diǎn)加框，保守的半胱氨酸下劃線。圖4的下面部分表明間日瘧原蟲和猴瘧原蟲的兩個(gè)分離物之間的相同的百分?jǐn)?shù)。
重組構(gòu)建物PcMSP1p19S包含相當(dāng)于如下的DNA前導(dǎo)序列的8個(gè)堿基對和間日瘧原蟲的MSP-1的從Met1至Asp32頭32個(gè)氨基酸(Belem分離物；Del Portillo等，1991,P.N.A.S.,88,4030)，其后為連接這兩個(gè)片段的GluPhe(由于EcoRⅠ位點(diǎn))，這后面是編碼猴瘧原蟲MSP1p19的從Lys276至Ser380(Ceylon株)的序列。該構(gòu)建物由兩個(gè)終止密碼子終止，該構(gòu)建物產(chǎn)生分泌在被感染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清中的重組蛋白。通過使用特異性識別惡性瘧原蟲p19的單克隆抗體的免疫親和層析純化重組PfMSP1p19蛋白通過使用詳細(xì)描述在Pharmacia采用的方法中的標(biāo)準(zhǔn)方法，將70mg單克隆抗體(從G17.12雜交瘤獲得，該雜交瘤于1997年2月14日保藏在CNCM〔國家微生物培養(yǎng)物保藏中心〕(法國巴黎)，其保藏登記號為I-1846；該G17.12雜交瘤從產(chǎn)生識別惡性瘧原蟲p19的IgG 2a/k的X63Ag8 653骨髓瘤構(gòu)建)結(jié)合至3g活化的CNBr-Sepharose 4B(Pharmacia)來制備層析樹脂。4℃下，將包含可溶性PfMSP1p19的培養(yǎng)上清與層析樹脂分批保溫16小時(shí)。將柱用20體積的含0.05％ NP4O,0.5M NaCl的PBS洗滌一次；用5體積的PBS洗滌一次并用2體積10mM磷酸鈉(pH6.8)洗滌一次。用30ml 0.2M甘氨酸(pH2.2)進(jìn)行洗脫。洗脫液用1M磷酸鈉(pH7.7)中和，接著通過超濾和對PBS透析將其濃縮。為了純化被錨定的PfMSP1p19，所有洗滌和洗脫溶液均包含0.1％的3-(二甲基-十二烷基銨基)丙烷磺酸鹽(Fluka)。在松鼠猴Saimiri sciureus中的重組間日瘧原蟲(p42和p19)MSP1接種試驗(yàn)。
該接種試驗(yàn)在雄性脾未被切除的2-3歲的松鼠猴(Saimirisciureus boliviensis)中進(jìn)行。用約50-100μg經(jīng)免疫親和純化的每種重組可溶性PvMSP1p42和p19(19)以3周的間隔對3只猴肌肉內(nèi)注射3次。如下使用完全和不完全弗氏佐劑第1次注射1∶1FCA/FIA；第2次注射1∶4 FCA/FIA；第3次注射FIA。將這些佐劑組合物與抗原的PBS溶液以1∶1混合。使用相同方法使五只對照猴子接受在大腸桿菌中產(chǎn)生的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)抗原。在最后感染2.5周后，通過注射2×108被適應(yīng)的間日瘧原蟲種類(Belem)感染的紅血細(xì)胞來進(jìn)行攻擊感染。通過檢查被Giemsa染色的涂片來每天確定所有動(dòng)物中的寄生蟲血癥來評價(jià)保護(hù)作用。
圖5中的曲線表明以作為感染后時(shí)間(天)的函數(shù)的每微升血中的被寄生的紅血細(xì)胞數(shù)目(縱坐標(biāo)，對數(shù)比例)測定的寄生蟲血癥中的差異。曲線A相當(dāng)于在三只接種猴子中觀察到的平均值；曲線B相當(dāng)于在五只對照猴子中的平均值。
對圖的研究表明接種的效果是極大地降低了寄生蟲血癥。在高帽猴Macaca sinica中的重組猴皮瘧原蟲(p42和p19)MSP1接種試驗(yàn)如下使用15只捕獲的猴子(1)3只動(dòng)物被注射100μg可溶性PcMSP1p42；(2)3只動(dòng)物被注射35μg(第一次注射)或50μg(第二次和第三次注射)可溶性PcMSP1p42；(3)三只動(dòng)物被注射PcMSP1p42和p19的混合物；(4)三只動(dòng)物被注射佐劑加PBS；(5)三只動(dòng)物未被注射。在上述方案中使用了弗氏完全和不完全佐劑。以4周的間隔進(jìn)行肌肉內(nèi)注射。在最后注射4周后，通過注射2×105被猴瘧原蟲感染的紅血細(xì)胞來進(jìn)行攻擊感染。通過用Giemsa檢測寄生蟲血癥來每天確定所有動(dòng)物中的寄生蟲血癥來評價(jià)保護(hù)作用。僅在計(jì)數(shù)400個(gè)涂片范圍后才將寄生蟲血癥劃分為陰性。寄生蟲血癥以被寄生的紅血細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)來表示。
圖6A-6G表明所獲得的結(jié)果，其中每一個(gè)均顯示作為感染后的時(shí)間函數(shù)(沿橫坐標(biāo)，天數(shù))的在攻擊動(dòng)物中觀察到的寄生蟲血癥(沿縱坐標(biāo)，以對數(shù)比例的被寄生細(xì)血細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)表示)。
結(jié)果涉及·在圖6A中；未接種的對照動(dòng)物；·圖6B涉及接受了包含弗氏佐劑的鹽溶液的動(dòng)物；·圖6C是為了突出從對動(dòng)物施用弗氏佐劑產(chǎn)生的相對結(jié)果(變化顯然是不明顯的)，將圖6A和6B進(jìn)行疊加；·圖6D提供在用p42接種結(jié)束時(shí)所獲得的結(jié)果；·圖6E涉及僅用p19接種的動(dòng)物；·最后，圖6F涉及用p19和p42的混合物接種的動(dòng)物。
p42當(dāng)然誘導(dǎo)一定水平的保護(hù)。然而，如圖6E和6F所示，由本發(fā)明的重組p19產(chǎn)生的保護(hù)相對更好。
可提出這樣的假設(shè)，即提高的保護(hù)作用來自p42的第二次裂解，伴隨裂解的是釋放游離的半胱氨酸，結(jié)果形成分子內(nèi)橋而導(dǎo)致在三種試驗(yàn)的重組蛋白中極具特征的p19多聚體。
用來產(chǎn)生圖(6A-6F)的數(shù)據(jù)在圖6G中給出。
猴瘧原蟲的高帽恒河猴接種試驗(yàn)，僅用p19接種的猴的第二次攻擊感染和對照(圖8)
6個(gè)月后，未進(jìn)行其它接種，接受了p19 MSP-1及FCA/FIA的3只猴(圖6E)和接受了包含弗氏佐劑的鹽溶液的3只恒河猴(圖6B)和2只新的未受影響的未被接種的猴子通過注射1×106個(gè)感染猴瘧原蟲的紅血細(xì)胞接受新的攻擊感染。通過檢查Giemsa染色每天確定所有動(dòng)物中的寄生蟲血癥來評價(jià)保護(hù)作用。僅在計(jì)數(shù)400個(gè)染色范圍后才將寄生蟲血癥劃分為陰性。寄生蟲血癥以被寄生的紅血細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)表示(在圖8D中提供了用來得出圖8A-C的數(shù)據(jù))。各組中除開1只動(dòng)物有1天顯示0.008％寄生蟲血癥外，早在6個(gè)月前經(jīng)歷了攻擊感染的6只免疫動(dòng)物沒有可檢測的寄生蟲血癥(圖8A和8B)。兩個(gè)未受影響的對照顯示具有最大為0.8％并持續(xù)21天的通常的寄生蟲血癥(圖8C)。因此，盡管在第一次攻擊感染后不存在寄生蟲血癥或非常輕微，接種了MSP-1p19的3只動(dòng)物比在第一次攻擊感染后顯示出全部通常感染的3只對照晚6個(gè)月還受保護(hù)。這些結(jié)果提示p19的保護(hù)期為至少6個(gè)月。在猴瘧原蟲高帽恒河猴系統(tǒng)中用p19和明礬進(jìn)行的接種試驗(yàn)(圖9)使用完全(FCA)或不完全(FIA)弗氏佐劑獲得前面的陽性保護(hù)結(jié)果。然而，目前唯一在人中被允許的佐劑為明礬。出于這個(gè)原因，我們在存在明礬作為佐劑時(shí)，在高帽恒河猴中用猴瘧原蟲MSP-1p19進(jìn)行接種試驗(yàn)。如下使用6只捕獲的恒河猴(1)3只動(dòng)物被注射4個(gè)劑量的50mg重組猴瘧原蟲MSP-1p19和20mg明礬；(2)3只動(dòng)物被4次注射生理鹽水和10mg明礬。以4周的間隔進(jìn)行肌肉注射。在最后注射4周后，通過注射2×105個(gè)被猴瘧原蟲感染的紅血細(xì)胞進(jìn)行攻擊感染。通過檢查Giemsa染色涂片每天確定所有動(dòng)物中的寄生蟲血癥來評價(jià)保護(hù)作用。僅在計(jì)數(shù)400個(gè)涂片范圍之后才將寄生蟲血癥劃分為陰性。以被寄生的紅血細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)來表示寄生蟲血癥。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。用重組p19和明礬免疫的3只恒河猴中的2只攻擊感染后在感染期總寄生蟲血癥(圖9A和9B)比用生理鹽水和明礬(圖9D)免疫的3只對照恒河猴少約30倍。用p19免疫的第三只恒河猴(圖9C)與對照沒有明顯不同。對于描述在圖9中的在高帽恒河猴macaca sinica中使用猴瘧原蟲p19的接種試驗(yàn)，用來產(chǎn)生圖(9A-9D)的數(shù)據(jù)提供在(圖9E)中。雖然結(jié)果沒有以前的結(jié)果驚人(圖6、8)，但這是首次觀察到重組MSP-1和明礬的顯著的保護(hù)作用。圖10在松鼠猴中用重組惡性瘧原蟲p19進(jìn)行的接種試驗(yàn)。
如下使用囚禁中飼養(yǎng)的20只約3歲Saimiri sciureus guyanensis(松鼠猴)如下在存在弗氏佐劑時(shí)，4只動(dòng)物被注射50mg可溶性PfMSP-1p19第一次注射1∶1 FCA/FIA；第二次注射1∶4FCA/FIA；第三次注射FIA。接著以1∶1將這些佐劑組合物與抗原的PBS溶液混合；(2)2只對照動(dòng)物接受如(1)所描述的弗氏佐劑和僅PBS；(3)在存在10mg明礬時(shí)，4只動(dòng)物被注射50mg可溶性PfMSP-1p19(Alu-Gel-S,Serva)；(4)2只對照動(dòng)物接受10mg明礬和僅PBS；(5)4只動(dòng)物被注射約50-100mg如下被重構(gòu)到脂質(zhì)體中的GPI錨定的PfMSP-1p19真空干燥300mmol膽固醇和300mmol磷脂酰膽堿，并被重新懸浮在含1.4mg PfMSP-1p19,GPI的330mM.N-辛基葡糖苷的PBS溶液中。用吸附劑Bio-Beads SM-2(Bio-Rad)將溶液對PBS滲析，通過離心濃縮形成的脂質(zhì)體，并重新懸浮在PBS中。用保存在4℃的新制脂質(zhì)體進(jìn)行第1次注射，用已冷凍貯存的脂質(zhì)體進(jìn)行第2和第3次注射；(6)2只動(dòng)物被注射不存在如(5)中描述的p19,GPI的以相同方式制備的對照脂質(zhì)體；(7)2只動(dòng)物被注射了生理鹽水。以4周的間隔進(jìn)行三次肌肉內(nèi)注射。通過注射1×106個(gè)被惡性瘧原蟲感染的紅血細(xì)胞來進(jìn)行攻擊感染。通過檢查Giemsa染色涂片每天確定所有動(dòng)物中的寄生蟲血癥評價(jià)保護(hù)作用。寄生蟲血癥以被寄生的紅血細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)來表示。該接種試驗(yàn)的結(jié)果示于圖10,A-G中。
在攻擊感染后，用弗氏佐劑或脂質(zhì)體中的p19免疫的組被證明具有與對照組類似的寄生蟲血癥(一只被接種弗氏佐劑中p19的動(dòng)物(29號)由于與接種無關(guān)的原因(心臟疾病)，在攻擊感染后幾天死亡)。在這兩組中抗原的施用不規(guī)(弗氏佐劑的不良乳化，被凍凝的脂質(zhì)體)未能使這些結(jié)果的重要性被完全評價(jià)。在明礬組中，2只動(dòng)物在感染期間顯示的全部寄生蟲血癥比對照少約4倍，1只動(dòng)物比對照少約3倍，1只動(dòng)物類似于對照。由于對照的可變性，可能由于用于攻擊感染的寄生蟲株未很好地適應(yīng)僅僅最近在Cayenme開發(fā)的非脾切除的松鼠猴模型，解釋該實(shí)驗(yàn)有些困難。然而，雖然不太完美，但使用明礬的實(shí)際效果卻是令人鼓舞的，因?yàn)槲覀兊目乖磥硎悄壳芭c明礬結(jié)合已顯出一定效果的唯一的重組惡性瘧原蟲MSP-1形式。在松鼠猴中用重組惡性瘧原蟲p19進(jìn)行的接種試驗(yàn)(如圖10的相同試驗(yàn))如下以4周的間隔將囚禁飼養(yǎng)的猴子經(jīng)肌肉內(nèi)注射兩次1mL接種物(1)在存在如下弗氏佐劑時(shí)，4只動(dòng)物被注射50μg可溶性PfMSP1p19第一次注射1∶1 FCA/FIA；第2次注射1∶4 FCA/FIA；接著以1∶1與抗原的PBS溶液混合；(2)在存在10mg明礬時(shí)，4只動(dòng)物被注射50μg可溶性PfMSP1p19；(3)4只動(dòng)物被注射約50μg GPI錨定的重構(gòu)在由1∶1摩爾膽固醇和磷脂酰膽堿組成的脂質(zhì)體中的PfMSP1p19。在第二次注射后，將動(dòng)物飼養(yǎng)17天。
將來自由于惡性瘧原蟲(成熟形式占大多數(shù))導(dǎo)致帶有30％寄生蟲血瘧的松鼠猴的紅細(xì)胞用PBS洗滌，在存在2％SDS和2％二硫蘇糖醇時(shí)，將殘留物稀釋8倍，在上樣至7.5％(分離膠)和4％(濃縮膠)聚丙烯酰胺凝膠之前加熱至95°。在轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素上之后，如下使用抗血清進(jìn)行免疫印跡分析(1)將用弗氏佐劑中可溶性PfMSP1p19接種的4只猴子的抗血清收集物稀釋20倍；(2)將用明礬佐劑中可溶性PfMSP1p19接種的4只猴子的抗血清收集物稀釋20倍；(3)將用脂質(zhì)體中的錨定PfMSP1p19接種的4只猴子的抗血清收集物稀釋20倍；(4)50mg/ml與PfMSP1p19的線性表位反應(yīng)的單克隆抗體；(5)將來自約20只重復(fù)感染惡性瘧原蟲并變得可不受任何后繼惡性瘧原蟲感染的猴子SH190抗血清收集物稀釋500倍；(6)將未受影響的猴子(從未暴露在惡性瘧原蟲中)的抗血清收集物稀釋20倍。
結(jié)果表明用PfMSP1p19接種的猴子的3份抗血清收集物強(qiáng)烈及特異性地與非常高分子量的復(fù)合物(擴(kuò)散在濃縮膠中)反應(yīng)，這些復(fù)合物存在于含更多成熟形式的寄生蟲提取物中。這些結(jié)果支持了這樣的假設(shè)，即在體內(nèi)存在PfMSP1p19的特異性聚集物，尤其是其寡聚體形式，其包含被重現(xiàn)于在桿狀病毒系統(tǒng)中合成的重組pfMSP1p19分子中的表位。
圖7也說明這些結(jié)果。它顯示在凝膠上產(chǎn)生的免疫印跡。頭三個(gè)凝膠泳道說明猴子對注射p19的體內(nèi)應(yīng)答〔(1)與弗氏佐劑，(2)與明礬，(3)以脂質(zhì)體形式〕，尤其是高分子量復(fù)合物的存在支持了在體內(nèi)成熟階段(當(dāng)p42被裂解為p19和p33)特有的寡聚體形式的p19聚集的假設(shè)。
該接種試驗(yàn)還包括與前面注射相同的第三次注射。使用弗氏佐劑的注射僅包含F(xiàn)IA。
對于每組有兩只動(dòng)物對照，即注射了PBS和弗氏佐劑的2只對照動(dòng)物注射PBS和明礬的2只對照動(dòng)物；注射了脂質(zhì)體而沒有蛋白的2只對照動(dòng)物；和注射了PBS而沒有佐劑的2只對照動(dòng)物。如上面描述的來評價(jià)保護(hù)作用。
圖7B該圖的數(shù)據(jù)來自松鼠猴/惡性瘧原蟲接種試驗(yàn)(下面的圖10)。數(shù)目相當(dāng)于圖10中提到的各只猴子。用于該圖中的技術(shù)和方法與圖7中的一樣，只是在三次注射后攻擊感染那天檢測各只猴子的每份抗血清，并將SHI抗血清以1∶250稀釋。結(jié)果表明用p19和明礬接種的4只猴子的抗血清強(qiáng)烈并特異性地與非常高分子量的復(fù)合物反應(yīng)，而用p19和弗氏佐劑或脂質(zhì)體接種的其它組的猴子僅顯示出與這些復(fù)合物很小的反應(yīng)性。由于用p19和明礬接種的猴子也是被保護(hù)得最好的，因此與高分子量復(fù)合物的反應(yīng)性看來指示了保護(hù)性效果，盡管該組中一只猴子相對于對照組沒有被保護(hù)且另一只僅被部分保護(hù)。
當(dāng)然本發(fā)明還涉及其它應(yīng)用，如在下面根據(jù)一些實(shí)例描述的那些，雖然這些本質(zhì)上是非限制性的。治療用途該重組分子PfMSP1p19可被用來產(chǎn)生特異性抗體，該抗體可通過被動(dòng)轉(zhuǎn)移用作由于惡性瘧原蟲導(dǎo)致的具有死亡危險(xiǎn)的嚴(yán)重瘧疾的治療劑。診斷用途來自桿狀病毒的重組分子PvMSP1p42、PvMSP1p19和PfMSP1p19可以并且已被用來產(chǎn)生特異性的鼠單克隆抗體，這些抗體與來自其它種的如兔或山羊的多克隆抗-MSP1p19抗血清結(jié)合可形成瘧疾的半定量診斷試驗(yàn)的基礎(chǔ)，用于區(qū)別可致死的由惡性瘧原蟲導(dǎo)致的瘧疾和通常為非致命的由間日瘧原蟲導(dǎo)致的瘧疾。該試驗(yàn)的原理是捕獲和定量血液中包含p19部分的任何MSP-1分子。
此處，MSP1p19分子的優(yōu)點(diǎn)如下(ⅰ)它在相同種中極其保守，而在不同種之間具有足夠的不同，使得易于產(chǎn)生種類特異的反應(yīng)物。在來自PfMSP1p19和PvMSP1p19的抗體之間未觀察到交叉反應(yīng)；(ⅱ)雖然不準(zhǔn)確地知道，但MSP1p19的作用看來是足夠地重要，因?yàn)樵摲肿硬粫@著變化或被刪除而對寄生蟲無致死效果。(ⅲ)它是在所有裂殖子中發(fā)現(xiàn)的主要抗原，因此原則上它必定在甚至是低的寄生蟲血癥時(shí)可被檢測并與寄生蟲血癥成比例。(ⅳ)由于來自桿狀病毒的重組MSP1p19分子看來重現(xiàn)了MSP1p19天然結(jié)構(gòu)的大部分，因此針對該蛋白產(chǎn)生的抗體將很好地適應(yīng)于診斷用途。
1996年2月1日根據(jù)布達(dá)佩斯條約Rule 6.1條，下面指出的微生物已以下面的登記號被保藏指稱代號 登記號PvMSP1p19A1-1659PvMSP1p19S1-1660
PfMSP1p19A1-1661PfMSP1p19S1-1662PcMSP1p19S1-1663本發(fā)明還涉及這些抗體尤其是固定在固體載體上(例如用于親和層析)的抗體用于純化起初包含在混合物中的p19類肽的用途。
純化指將該混合物與抗體接觸，解離抗原-抗體復(fù)合物并回收純化的p19類型的肽。
本發(fā)明還涉及疫苗組合物，其也包括蛋白或片段的混合物，尤其是這類混合物·惡性瘧原蟲p19和間日瘧原蟲p19；·惡性瘧原蟲p19和惡性瘧原蟲p42，如果需要，后者失去其最可變的區(qū)域；·間日瘧原蟲p19和間日瘧原蟲p42，如果需要，后者失去其最可變的區(qū)域；·惡性瘧原蟲p19和惡性瘧原蟲p42，如果需要，后者失去其最可變的區(qū)域，和間日瘧原蟲p19和間日瘧原蟲p42，如果需要，后者失去其最可變的區(qū)域。
在這種情況中，最可變的區(qū)域被定義為區(qū)域Ⅰ或區(qū)域Ⅱ及區(qū)域Ⅲ的全部或一部分，優(yōu)選除去的區(qū)域Ⅲ的部分是與區(qū)域Ⅱ并列的部分(保守部份位于p33 C-末端這一側(cè)，與p19靠近)。區(qū)域Ⅱ和Ⅲ示于圖4中。
本發(fā)明不局限于生產(chǎn)人疫苗。它還可適用于使用來自感染哺乳動(dòng)物的寄生蟲的相應(yīng)蛋白或抗原及在相同條件下的產(chǎn)物生產(chǎn)獸醫(yī)疫苗組合物。已知相同類型的感染巴貝蟲病還出現(xiàn)在牛、豬和馬中。巴貝蟲屬種類的一種抗原與MSP-1的蛋白部分有高度的構(gòu)象一致性(尤其是在兩個(gè)EFG樣和富含半胱氨酸區(qū))和功能一致性〔(36),(37)和(38)〕。
已描述了使用抗這些寄生蟲的可溶性抗原的獸醫(yī)疫苗(39)。
不言而喻用于這些混合物中的p19在分別考慮時(shí)也可如前面所述地進(jìn)行修飾。
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本發(fā)明還涉及分泌選擇性識別感染人的非間日瘧原蟲的瘧原蟲屬類寄生蟲的裂殖子形式中的MSP-1蛋白的p19而不識別間日瘧原蟲的特異性抗體的雜交瘤。
尤其是，這些雜交瘤分泌不識別間日瘧原蟲p19并特異性識別惡性瘧原蟲p19的單克隆抗體。
本發(fā)明還涉及一種雜交瘤，其特征在于它產(chǎn)生特異性識別間日瘧原蟲的p19和猴瘧原蟲的p19的特異性抗體。F10-3雜交瘤從產(chǎn)生識別間日瘧原蟲p42糖蛋白的IgG 2b/k的X63 Ag8653骨髓瘤構(gòu)建。
權(quán)利要求
1．一種重組蛋白，其必要組成性多肽序列為·感染哺乳動(dòng)物尤其是人的非間日瘧原蟲的瘧原蟲屬類寄生蟲的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1蛋白)的19kDa(p19)C-末端片段的序列，該C-末端片段通常在感染周期中其進(jìn)入人紅細(xì)胞的穿透階段末期仍然錨定在寄生蟲表面；·或仍能誘導(dǎo)可在體內(nèi)抑制由于相應(yīng)的寄生蟲導(dǎo)致的寄生蟲血癥的免疫應(yīng)答的該片段的一部分的序列；·或能誘導(dǎo)與由所述p19片段或該片段的所述部分產(chǎn)生的等價(jià)的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的肽的序列；和所述重組蛋白可能進(jìn)一步包含在還原介質(zhì)中不穩(wěn)定的并組成對抗相應(yīng)瘧原蟲而形成的人抗血清所識別的大部分表位的構(gòu)象表位。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的重組蛋白，其特征在于當(dāng)它為非還原狀態(tài)或非不可逆還原狀態(tài)時(shí)，它可被抗相應(yīng)瘧原蟲或抗同源的瘧原蟲而形成的人抗血清識別，但當(dāng)它為不可逆還原狀態(tài)時(shí)，它不能被這些相同的抗血清識別或僅在很小程度上被識別。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的蛋白，其特征在于它抑制人抗血清與在相同條件下產(chǎn)生的相應(yīng)的p42以及p42本身的免疫反應(yīng)性，而p42僅可部分抑制所述人抗血清對p19的反應(yīng)性。
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的重組蛋白，其特征在于它基本上失去了正常位于p33(33kDa N-末端片段)的C-末端多肽序列上游的任何多肽序列，在p42天然裂解之前在相應(yīng)p42中p33該側(cè)與p19相連，所述p33的最后C-末端多肽序列當(dāng)存在時(shí)包含少于50個(gè)氨基酸殘基。
5．根據(jù)權(quán)利要求1-3任-項(xiàng)的重組蛋白，其特征在于它基本上失去了正常位于p33(33kDa N-末端片段)的C-末端多肽序列上游的任何多肽序列，在p42天然裂解之前在相應(yīng)p42中p33該側(cè)與p19相連，所述p33的最后C-末端多肽序列當(dāng)存在時(shí)包含少于10個(gè)氨基酸殘基。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)權(quán)利要求的重組蛋白，其特征在于它基本上失去了正常位于p33(33kDa N-末端片段)的C-末端多肽序列上游的任何多肽序列，在p42天然裂解之前在相應(yīng)p42中p33該側(cè)與p19相連，所述p33的最后C-末端多肽序列當(dāng)存在時(shí)限于保留感染人的瘧原蟲如惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲中的相當(dāng)程度的保守性的序列。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的重組蛋白，其特征在于p19片段的所述部分包含通常包含在該p19中的兩個(gè)EGF區(qū)域中的至少一個(gè)。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的重組蛋白，其特征在于所述p19片段或p19片段的所述部分的分子量為10-25kDa，尤其是10-15kDa。
9．根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的重組蛋白，其特征在于它還包含使p19片段能錨定在表達(dá)所述重組蛋白的宿主細(xì)胞上的糖基磷脂酰肌醇(GPI)基團(tuán)，其中宿主細(xì)胞尤其是真核細(xì)胞，優(yōu)選可被桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞。
10．根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的重組蛋白，其特征在于它失去了極其疏水的C-末端部分，該C-末端部分參與誘導(dǎo)將所述重組蛋白錨定至表達(dá)它的宿主的細(xì)胞膜上，其中宿主細(xì)胞尤其是真核細(xì)胞，優(yōu)選為可被桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的重組蛋白，其特征在于它為水溶性的。
12．根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的重組蛋白，其特征在于它包含惡性瘧原蟲的MSP-1蛋白的p19序列或相應(yīng)片段的所述部分。
13．根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的重組蛋白，其特征在于它包含猴瘧原蟲的MSP-1蛋白的p19序列或相應(yīng)片段的所述部分。
14．根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的重組蛋白的寡聚體。
15．根據(jù)權(quán)利要求14的寡聚體，其特征在于它包含如權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)中定義的重組蛋白的所述多肽序列的2-50個(gè)單體單位。
16．根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的重組蛋白，其特征在于它與用于生產(chǎn)疫苗的載體分子結(jié)合。
17．一種抗感染人的瘧原蟲類寄生蟲的接種組合物，它包含作為活性成分的重組蛋白，該重組蛋白的必要組成性多肽序列為·感染人的瘧原蟲類寄生蟲的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1蛋白)的19kDa(p19)的C-末端片段的序列，其中在感染周期中的進(jìn)入人紅細(xì)胞的穿透階段的末期，所述C-末端片段通常仍錨定在寄生蟲表面；·或任能誘導(dǎo)可在體內(nèi)抑制由于相應(yīng)的寄生蟲導(dǎo)致的寄生蟲血癥的免疫應(yīng)答的該片段的一部分的序列；·或能誘導(dǎo)與由所述p19片段或該片段所述部分產(chǎn)生的等價(jià)的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的肽的序列；和所述重組蛋白進(jìn)一步包含在還原介質(zhì)中不穩(wěn)定，并組成由抗相應(yīng)瘧原蟲而形成的人抗血清所識別的大部分表位的構(gòu)象表位。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的接種組合物，其特征在于其活性成分由根據(jù)權(quán)利要求2-13任一項(xiàng)或16的重組蛋白，或根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的寡聚體組成。
19．一種抗感染人的瘧原蟲類寄生蟲的接種組合物，其包含作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的重組蛋白的寡聚體。
20．一種抗體，其特異性識別感染人的非間日瘧原蟲的瘧原蟲類寄生蟲的裂殖子形式的MSP-1蛋白的p19，并且它不識別間日瘧原蟲。
21．根據(jù)權(quán)利要求20的抗體，其特征在于它為單克隆的。
22．根據(jù)權(quán)利要求20的抗體，其特征在于它為單克隆抗體，并且在于它特異性識別惡性瘧原蟲的p19。
23．根據(jù)權(quán)利要求20的單克隆抗體，其特征在于它特異性識別間日瘧原蟲的p19。
24．一種區(qū)分由間日瘧原蟲導(dǎo)致的寄生蟲感染和由其它瘧原蟲導(dǎo)致的寄生蟲感染的區(qū)別診斷方法，其特征在于將被瘧原蟲感染的生物樣品與根據(jù)權(quán)利要求23的抗體和與根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求22的抗體接觸，并依情況檢測免疫反應(yīng)的產(chǎn)生或未產(chǎn)生。
25．一種重組桿狀病毒類型的修飾載體，其在包含于所述載體中并被所述載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞識別的啟動(dòng)子的控制下，包含編碼可與桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)相容的信號肽的第一核苷酸序列，其特征在于第二核苷酸序列位于第一核苷酸序列下游，也受所述啟動(dòng)子的控制并編碼肽序列·感染人類的瘧原蟲類寄生蟲的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1蛋白)的19千道爾頓(p19)的C-末端片段的序列，在感染周期中，該C-末端片段在進(jìn)入紅細(xì)胞的穿透階段的末期通常仍然被錨定在寄生蟲表面；·或該肽片段的一部分，前提是第二序列在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)產(chǎn)物仍能誘導(dǎo)可抑制體內(nèi)由于相應(yīng)寄生蟲導(dǎo)致的寄生蟲血癥的免疫應(yīng)答；·或能誘導(dǎo)等價(jià)于由所述p19肽片段或所述肽片段部分產(chǎn)生的應(yīng)答的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的肽；和所述核苷酸序列具有構(gòu)成它的全部核苷酸的40％-60％范圍的G和C含量，優(yōu)選至少50％。
26．根據(jù)權(quán)利要求25的修飾載體，其特征在于所述第二個(gè)多肽序列與在權(quán)利要求2-13任一項(xiàng)中定義的一致。
27．根據(jù)權(quán)利要求2S的修飾載體，其特征在于第二個(gè)核苷酸序列為合成序列。
28．根據(jù)權(quán)利要求25-27任一項(xiàng)的修飾載體，其特征在于第一核苷酸序列編碼來自間日瘧原蟲并通常與瘧原蟲MSP-1蛋白相連的信號肽。
29．根據(jù)權(quán)利要求25-28任一項(xiàng)的修飾載體，其特征在于第二核苷酸在3′末端失去疏水性的C-末端的最后序列，該序列參與誘導(dǎo)將所述重組蛋白錨定至表達(dá)它的宿主的細(xì)胞膜上，尤其是可被桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞。
30．根據(jù)權(quán)利要求25-29任一項(xiàng)的修飾載體，其特征在于它由修飾的桿狀病毒組成。
31．一種生物體，尤其是Sf9型昆蟲細(xì)胞，其可被并且已被根據(jù)權(quán)利要求25-29任一項(xiàng)的修飾載體轉(zhuǎn)染。
32．含有第一核苷酸序列的合成DNA，其中第一核苷酸序列的至少一部分編碼下列肽序列·惡性瘧原蟲的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP-1)的19kDa(p19)的C-末端片段的序列，其中在感染周期中的其進(jìn)入人紅細(xì)胞的穿透階段的末期，所述C-末端片段通常錨定在寄生蟲表面；·或該肽片段的一部分的序列，前提是所述DNA在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)產(chǎn)物仍能誘導(dǎo)在體內(nèi)可抑制由于相應(yīng)寄生蟲而導(dǎo)致的寄生蟲血瘧的免疫反應(yīng)；·或能誘導(dǎo)與由所述p19肽片段或該片段的所述部分產(chǎn)生的等價(jià)的細(xì)胞和/或體液類型的免疫應(yīng)答的肽的序列；和所述核苷酸序列還具有占組成所述合成DNA的核苷酸總量的40-60％，優(yōu)選至少50％的G和C核苷酸含量。
33．根據(jù)權(quán)利要求32的合成DNA序列，其特征在于其第一核苷酸序列在其3′末端失去了編碼疏水C-末端最后區(qū)域的序列，該疏水性C-末端最后的區(qū)域通常參與誘導(dǎo)將p19蛋白錨定至表達(dá)它的宿主的細(xì)胞膜上，尤其是可被桿狀病毒轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞。
34．根據(jù)權(quán)利要求32或權(quán)利要求33的合成DNA序列，其特征在于第一核苷酸序列之前是編碼通常與瘧原蟲MSP-1蛋白相連的信號肽的信號核苷酸序列，其與主要序列同源或異源。
35．根據(jù)權(quán)利要求34的合成DNA序列，其特征在于信號序列來自間日瘧原蟲。
36．根據(jù)權(quán)利要求32-35任一項(xiàng)的合成DNA，其特征在于所述第一核苷酸序列包括編碼多肽細(xì)胞膜錨定區(qū)的3′-末端序列，所述錨定區(qū)將表達(dá)的重組蛋白固定至用含所述合成DNA的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的膜表面，其中所述3′-序列與主要核苷酸序列同源，或是異源的，尤其是來自間日瘧原蟲的序列。
37．根據(jù)權(quán)利要求36的合成DNA，其特征在于3′-末端序列來自間日瘧原蟲。
38．根據(jù)權(quán)利要求32-36任一項(xiàng)的合成DNA序列，其特征在于它失去了所述3′-末端序列。
39．根據(jù)權(quán)利要求25的桿狀病毒類型的載體，其特征在于它選自·以登記號I-1659保藏在CNCM〔全國微生物培養(yǎng)物保藏中心〕的病毒；·以登記號I-1660保藏在CNCM的病毒；·以登記號I-1661保藏在CNCM的病毒；·以登記號I-1662保藏在CNCM的病毒；·以登記號I-1663保藏在CNCM的病毒。
40．分泌具有權(quán)利要求21-23任一項(xiàng)的抗體的特征的單克隆抗體的雜交瘤。
41．一種從肽混合物中分離具有指定特異性的p19肽的方法，其特征在于通過將所述肽混合物與根據(jù)權(quán)利要求20-23任一項(xiàng)的相應(yīng)抗體接觸，優(yōu)選為已固定在不可溶載體上的抗體，接著解離所形成的抗原-抗體復(fù)合物，并回收純化的p19肽。
42．根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求15或16的寡聚體在制備可誘導(dǎo)抗瘧原蟲感染的免疫應(yīng)答的免疫原組合物中的用途。
43．一種疫苗組合物，包含作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的蛋白與需要時(shí)至少除去了保守性較差部分的相應(yīng)的p42，或來自與產(chǎn)生所述蛋白同源的寄生蟲的另一重組p19或p42類蛋白的混合物。
44．根據(jù)權(quán)利要求23的疫苗組合物，其特征在于活性成分的混合物選自下面的混合物·惡性瘧原蟲p19和間日瘧原蟲p19；·惡性瘧原蟲p19和惡性瘧原蟲p42；·間日瘧原蟲p19和間日瘧原蟲p42，如果需要，去除了其最可變區(qū)；·惡性瘧原蟲p19和惡性瘧原蟲p42，如果需要，去除了其最可變區(qū)，和間日瘧原蟲p19和間日瘧原蟲p42，如果需要去除了其最可變區(qū)。
45．根據(jù)權(quán)利要求40的雜交瘤，其特征在于它已于1997年2月14日保藏在CNCM(巴黎，法國)，登記號為I-1846。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在桿狀病毒系統(tǒng)中制備的重組蛋白,其必要組成性多肽序列為感染人的瘧原蟲屬類寄生蟲尤其是惡性瘧原蟲的裂殖子形式的表面蛋白1(MSP－1蛋白)的19kDa(p19)C－末端片段的序列,該C－末端片段通常在感染周期中其進(jìn)入人紅細(xì)胞的穿透階段末期仍然錨定在寄生蟲表面。所述重組蛋白可用于生產(chǎn)抗瘧疾的疫苗。
文檔編號C12N5/10GK1222936SQ97193033
公開日1999年7月14日 申請日期1997年2月14日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月14日
發(fā)明者S·朗加克里-安德里, C·羅斯, F·納托, J·W·巴恩維爾, K·曼迪斯 申請人:巴斯德研究所, 紐約大學(xué)