專利名稱：通過肝細胞生長因子拮抗物預(yù)防人的瘧疾感染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及肝細胞生長因子受體拮抗物并涉及肝細胞生長因子所誘導(dǎo)信號的抑制劑。更特別地，本申請涉及此類化合物用于預(yù)防惡性瘧原蟲(plasmodium falciparum)和間日瘧原蟲(plasmodium vivax)感染的用途。
背景技術(shù)：
瘧疾的發(fā)病機理已有廣泛的研究并在許多科學(xué)出版物和綜述文章中得以描述[新近的實例見Miller等人，Nature 415673-679，(2002)]。該疾病的原因是惡性瘧原蟲，較次要的原因是間日瘧原蟲、三日瘧原蟲(Plasmodiummalariae)和卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)。瘧疾造成的死亡幾乎全部由惡性瘧原蟲引起。寄生蟲由載體岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)傳播，該寄生蟲優(yōu)先以人為食并且壽命長。由于蚊叮咬，子孢子得以注入皮膚。它們移動至肝臟，在此處它們在穿過幾個肝細胞后建立感染并分裂。每個子孢子發(fā)展成幾萬個裂殖子，這些裂殖子從肝臟中釋放并侵入紅細胞。惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲在紅細胞內(nèi)部以無性方式繁殖。在兩天的時期內(nèi)，每個裂殖子產(chǎn)生大約20個裂殖子。紅細胞破裂并釋放再次侵入紅細胞的裂殖子。該疾病起始于紅細胞內(nèi)寄生蟲的無性繁殖。少數(shù)裂殖子發(fā)育成配子體，該配子體不引起疾病但通過雌性按蚊將感染傳播給其他人。間日瘧原蟲在從肝臟釋放后不久即發(fā)育成配子體，而惡性瘧原蟲配子體發(fā)育則晚得多。
在亞洲和南美洲的一些地區(qū)以及特別是撒哈拉沙漠以南的非洲瘧疾是重要的健康問題。在任一給定年中，全球人口的幾乎10％將患瘧疾——6億臨床病例。根據(jù)近來估計，每年至少發(fā)生100萬瘧疾導(dǎo)致的死亡——每30秒鐘一例瘧疾導(dǎo)致的死亡[Greenwood和Mutabingwa，Nature 415670-672(2002)]。在非洲每20名五歲前兒童中的1名就死于瘧疾。近來，由于許多造成瘧疾負擔(dān)加重的因素的結(jié)果，瘧疾形勢已惡化，最重要的因素是對便宜并有效的藥物有抗性的惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲變種的出現(xiàn)，及殺蟲劑抗性蚊子的出現(xiàn)。
發(fā)明概述本發(fā)明幫助實現(xiàn)本領(lǐng)域中的這些需要。瘧疾的逃避已使確定性治療變得困難。本文所提供的是能夠預(yù)防瘧疾感染的傳播或獲得并能夠幫助預(yù)防和治療此類感染的活性劑和方法。
更特別地，本發(fā)明提供了在體內(nèi)抑制瘧疾活性的方法，其中該方法包含對人類宿主施用抗瘧疾活性劑，所述活性劑能夠通過防止受感染的宿主例如人的肝臟中瘧疾寄生蟲的起始復(fù)制而表現(xiàn)出保護效果。該抗瘧疾活性劑由HGF活性的至少一種抑制劑，和任選地，抗瘧疾藥物例如伯胺喹組成。將抗瘧疾活性劑以足以預(yù)防或至少抑制體內(nèi)瘧疾造成的肝細胞感染或者預(yù)防或至少抑制體內(nèi)瘧疾寄生蟲的復(fù)制或傳播的量施用于人。
本發(fā)明涉及肝細胞支持引起人類瘧疾的寄生蟲生長的能力。引起人類疾病的瘧原蟲屬寄生蟲是惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲。更特別地本發(fā)明揭示了瘧原蟲感染建立所必需的Met激活和下游信號。以前已知瘧原蟲子孢子在它們能夠在肝細胞中形成泡并在肝細胞中分裂之前穿過幾個肝細胞。以前未知子孢子穿過肝細胞與眾所周知的稱為肝細胞生長因子(HGF)的細胞因子有關(guān)。已知HGF以無活性的單鏈蛋白質(zhì)釋放。其通過蛋白酶解剪切活化，該剪切形成二硫鍵連接的異二聚體。異二聚體結(jié)合并激活受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶Met。激活的Met的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域募集了通過幾個不同通路傳遞信號的多種蛋白質(zhì)。這些信號導(dǎo)致了多種反應(yīng)，例如細胞分散、增殖、管泡發(fā)生(tubulogenesis)和侵入性生長。本發(fā)明揭示了新的Met介導(dǎo)的針對HGF的肝細胞反應(yīng)。HGF致使肝細胞以允許子孢子在泡內(nèi)部繁殖的方式允許子孢子的侵入。
本發(fā)明還提供了預(yù)防瘧原蟲感染的新策略。
在優(yōu)選的實施方案中，肝細胞的瘧原蟲感染通過分子得以預(yù)防，所述分子干擾受損肝細胞的HGF產(chǎn)生。
還適合感染預(yù)防的是干擾HGF蛋白酶剪切成其活性形式的分子，及隔離HGF并因此阻止它經(jīng)其受體Met結(jié)合到肝細胞上的分子。
在另一方面，本發(fā)明揭示了Met是預(yù)防瘧疾感染的藥物靶標(biāo)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，瘧疾感染通過干擾HGF對其受體Met的結(jié)合的分子來預(yù)防。此類分子是對HGF特異性的抗體，其封閉了HGF對Met的結(jié)合位點。而且在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中此類分子是針對Met的抗體，或者此類抗體的片段，其阻斷HGF結(jié)合但不激活Met。在本發(fā)明的另一實施方案中，此類分子是結(jié)合到Met但不激活Met的寡核苷酸(適體)。在本發(fā)明的又一個實施方案中，此類分子是通過HGF干擾Met激活的HGF變體。此類變體包括，但不限于NR4。
在本發(fā)明的另一方面，通過藥物預(yù)防肝細胞的瘧原蟲感染，該藥物干擾受激活的Met的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，此類藥物是蛋白質(zhì)酪氨酸抑制劑。此種藥物的實例是染料木黃酮。
在另一優(yōu)選的實施方案中，此類藥物是蛋白質(zhì)酪氨酸激酶Met的選擇性抑制劑。在優(yōu)選的實施方案中這些抑制劑是小分子量的化合物并通過經(jīng)口途徑或作為栓劑施用。
附圖簡述

圖1顯示子孢子通過細胞遷移以及機械性細胞損傷誘導(dǎo)“感染易感性誘發(fā)因子”(ISIF)的釋放。
圖2顯示由子孢子穿過的宿主細胞分泌的HGF是感染所需的。
圖3顯示HGF對于瘧原蟲感染的作用通過其受體MET介導(dǎo)。
圖4顯示在體外和體內(nèi)HGF由瘧原蟲穿過的細胞表達并且其通過MET的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是瘧疾感染所必需的。
圖5顯示在體外染料木黃酮影響由柏氏瘧原蟲(Plasmodium berghei)子孢子導(dǎo)致的肝感染。
圖6顯示在體內(nèi)染料木黃酮影響由柏氏瘧原蟲子孢子導(dǎo)致的肝感染。
發(fā)明詳述如此處所用，術(shù)語“抗瘧疾活性劑”意指包含一種或多種HGF活性抑制劑的組合物。術(shù)語“HGF活性抑制劑”意指獨立地選自HGF受體拮抗物、HGF介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑和蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑的一種或多種化合物。HGF活性抑制劑可單獨使用或相互聯(lián)合使用。HGF活性抑制劑可任選地聯(lián)合一種或多種已知的抗瘧疾藥物而形成本發(fā)明的抗瘧疾活性劑。
本發(fā)明涉及瘧疾寄生蟲對肝細胞的侵入。在經(jīng)蚊叮咬傳播至人類宿主后，瘧疾子孢子找到它們進入肝臟的途徑，在此每個子孢子可產(chǎn)生多至10000個釋放入血液的裂殖子。肝細胞的侵入是瘧疾感染的必須步驟。子孢子可通過破壞質(zhì)膜然后寄生蟲遷移通過細胞或者，像胞內(nèi)細菌或其它寄生蟲一樣，通過在侵入的病原體周圍形成內(nèi)化泡來侵入肝細胞。最初子孢子穿過肝細胞不形成內(nèi)化泡。子孢子突破肝細胞的質(zhì)膜進入肝細胞，穿過胞質(zhì)溶膠并離開宿主細胞，該宿主細胞死亡或成功修復(fù)質(zhì)膜。瘧原蟲通過肝細胞和隨后寄生泡形成的潛在分子機制鮮有了解。由約氏瘧原蟲(plasmodium yoelii)和惡性瘧原蟲而不是由嚙齒類動物瘧疾寄生蟲柏氏瘧原蟲導(dǎo)致的泡形成依賴于肝細胞表達的tetraspin蛋白質(zhì)CD81。已知CD81是丙型肝炎病毒的受體，但其似乎不與子孢子表面的任何配體相互作用。其在某些瘧原蟲種類導(dǎo)致的肝細胞侵入中的作用有待闡明[Silvie等人，Nature Medicine 993-96，(2003)]。有趣的是，子孢子在通過形成寄生泡侵入肝細胞之前必須穿過幾個細胞的胞質(zhì)溶膠，這對進入下一感染階段的分化是必不可少的[Mota等人，Science 291440-42，2001]]。此發(fā)現(xiàn)暗示子孢子造成的肝細胞損傷釋放一種或多種使鄰近肝細胞對感染敏感的感染易感性誘發(fā)因子(ISIF)。本發(fā)明的重要方面是發(fā)現(xiàn)被稱為肝細胞生長因子的蛋白質(zhì)在瘧疾感染中用作ISIF。
I.HGF和其受體Met肝細胞生長因子被發(fā)現(xiàn)作為肝細胞的有絲分裂原[Michalopolous等人，Cancer Res.，44441-4419(1984)；Rusasel等人，Cell Physiol.，119183-192(1984)；Nakamura等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1221450-1459(1984)]并獨立地作為促進上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞解離的分散因子[Stocker等人，Nature 327，239-242(1987)]。為簡單起見，將此因子稱作HGF。HGF首次從肝臟切除的大鼠血清純化[Nakamura等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1221450-1459(1984)]并隨后從大鼠血小板[Nakamura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，836849-6493(1986)]和人血漿純化[Gohda等人，J.Clin.Invest.81414-419(1988)]。編碼大鼠HGF、人HGF和稱為“delta5 HGF”的天然存在的變體的cDNA得以克隆[Miyazawa等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，163967-973(1989)；Nakamura等人Nature 342440-443(1989)；Seki等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，172321-327(1990)；Tashiro等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，873200-3204(1990)；Okajima等人，Eur.J.Biochem.，193375-381(1990)]。人HGF由440個氨基酸的α-亞基(M，62kDa)和234個氨基酸的β-亞基(M，34kDa)組成。它以生物學(xué)上無活性的(728個氨基酸)產(chǎn)生，所述前HGF經(jīng)蛋白酶在Arg494和Val495之間剪切而形成二硫鍵連接的異二聚體。62-kDa的α-亞基包含N-末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)域(大約27個氨基酸)，接著是4個規(guī)范的三環(huán)(canonical kringle)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是由3個S-S橋穩(wěn)定的80個氨基酸的雙環(huán)結(jié)構(gòu)。第一個環(huán)結(jié)構(gòu)域結(jié)合到蛋白質(zhì)酪氨酸激酶受體Met上，下面將對Met有更詳細的描述。發(fā)夾環(huán)和第二個三環(huán)結(jié)構(gòu)域以低親和力結(jié)合膜結(jié)合的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。34kDa的β-亞基包含絲氨酸蛋白酶樣的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與絲氨酸蛋白酶凝血因子的絲氨酸蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域非常相似，但其無蛋白酶活性。HGF顯示出與纖溶酶原38％的總序列同一性及與另一稱為巨噬細胞刺激蛋白質(zhì)(MSP)的細胞因子45％的同一性。HGF結(jié)合到稱為Met的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶受體上，而其近親MSP結(jié)合到另一稱為Ron的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶受體上。
HGF以單鏈前HGF分泌。此HGF前體結(jié)合到與胞外基質(zhì)或與生產(chǎn)細胞鄰近的細胞表面相結(jié)合的蛋白聚糖上。通過Arg494和Val495之間的蛋白酶剪切完成的單鏈前體向生物活性異二聚體的激活是嚴(yán)格受控的過程[(綜述見Kataoka等人，Life XY 11036-1042(2001))。
在HGF激活中首先涉及的酶是尿激酶類型纖溶酶原激活劑(uPA)和組織類型纖溶酶原激活劑(tPA)。隨后鑒定了三種另外的HGF激活酶，即凝結(jié)因子XIIa、也稱為matriptase的膜類型絲氨酸蛋白酶-1(MT-SP1)和HGF激活劑(HGFA)。這些酶中的每一種均在內(nèi)源性抑制劑蛋白質(zhì)的控制之下。HGFA是最有效的HGF切割酶。像HGF一樣，HGFA是通過Arg407后的切割而從單鏈前HGFA產(chǎn)生的異二聚體。HGFA切割酶之一是凝血酶，是一種通過凝結(jié)級聯(lián)(coagulation cascade)激活于受傷組織的酶。活性HGFA異二聚體不由主要血清蛋白酶抑制劑抑制，但在兩種蛋白質(zhì)HGA抑制劑I類(HAI-1)和HGA抑制劑II類(HAI-2)的控制下，后者等同于胎盤尿抑胰酶素(PB)。HAI-1在受傷的和再生的組織中是上調(diào)的。它表達于細胞表面，在此處它結(jié)合和抑制HGFA。細胞因子例如IL-1β通過TNF-α轉(zhuǎn)化酶(TACE)和ADAM(解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶)蛋白質(zhì)家族的TACE樣金屬蛋白酶誘導(dǎo)HGFA/HAI-1復(fù)合體的脫落。脫落后HGFA從HAI-1解離，然后能夠激活HGF。因而，HAI-1不僅是成熟HGFA的抑制劑而且是HGFA的特異接納體，作為細胞表面上此酶的存儲器。HAI-1在公開于2002年10月15日的美國專利號6,465,622B2中有所描述，其中要求保護HAI-1作為HGF和HGFA的控制因子的用途。
HGF受體Met最初作為致癌融合蛋白的組分發(fā)現(xiàn)，所述致癌融合蛋白產(chǎn)生于經(jīng)致癌物處理過的肉瘤細胞系[Cooper等人，Nature，31129-33(1984)]。在正常細胞中，原代Met轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生150kDa的多肽，該多肽經(jīng)糖基化然后切割形成S-S連接的異二聚體。HGF及其受體Met是公開于7月15日的美國專利號5,648,273的主題，該專利要求保護配體-受體用于診斷增殖病癥和疾病例如肝炎和肝癌發(fā)生的用途。
Met異二聚體由高度糖基化和完全胞外的β-亞基及具有大的胞外區(qū)域和胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的α-亞基組成。Met是受體酪氨酸激酶(RTKs)超家族的成員。該超家族分為至少19個家族，包括Her家族(EGFR、Her2、Her3、Her4)、胰島素受體家族(胰島素受體、IGF-1R、胰島素相關(guān)受體)、PDGF受體家族(PGFRa和b、CSF-R、kit、FIk2)、FIk家族(F1k-1、F1t-1、F1k-4)、FGF受體家族(FGF-R1、2、3和4)及其它。Met及其近親Ron分別形成配體HGF和巨噬細胞刺激蛋白(MSP)的不同的受體家族。
HGF結(jié)合時，c-Met經(jīng)歷特異酪氨酸殘基的自磷酸化。當(dāng)定位在酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的激活環(huán)內(nèi)的Tyr1234和Tyr1235磷酸化激活了c-Met的內(nèi)在激酶活性時，C-末端Tyr1349和Tyr1356的磷酸化產(chǎn)生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)，例如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷脂酶C-γ(PLC-γ)、src、Stat3、Grb2和Grb2結(jié)合的停靠蛋白質(zhì)Gab1的多底物?？课稽c。Grb2也通過銜接蛋白質(zhì)Shc與Met相互作用。Grb2募集Ras核苷交換蛋白質(zhì)SOS，其激活Ras-MAPK信號通路。因而，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白對激活的Met受體的停靠通過多種通路起始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Met C-末端26個氨基酸不僅為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白提供?？课稽c，而且調(diào)節(jié)Met的酶活性。激酶結(jié)構(gòu)域的突變(M1250T)繞開了C-末端氨基酸的調(diào)節(jié)作用[Gual等人，Oncogene 205493-502(2001)]。
不同的Met表達靶細胞中針對HGF的多種反應(yīng)已有所描述。這些反應(yīng)包括增殖、程序性細胞死亡、細胞的解離(dissociation)、相互排斥、細胞通過胞外基質(zhì)的運動和分枝形態(tài)發(fā)生。在胚胎發(fā)生過程中，產(chǎn)生HGF的間葉細胞和表達Met的上皮細胞之間的相互作用似乎參與多種器官例如胎盤、乳腺、肝臟、肌肉和神經(jīng)元組織的形成。HGF基因敲除小鼠及Met基因敲除小鼠顯示出胎盤、肝臟和肌肉發(fā)育的缺陷并在E13.5和15.5之間死亡[(Schmidt等人，Nature 373699-702(1995)；Uehara等人，Nature 373702-705(1995)；Bladt等人，Nature 376768-771(1995)]。在成體生命中，HGF-Met相互作用涉及傷口愈合、血管生成和組織再生。并不令人驚訝地，HGF導(dǎo)致的Met激活已涉及腫瘤的生長、侵入和轉(zhuǎn)移。HGF和其受體Met的生物學(xué)在幾篇綜述文章[Maulik等人.，Cytokine & Growth FactorReviews，1341-59(2002)]及其中所參考的眾多出版物中有充分描述。
基于它們的生物學(xué)特性，HGF和HGF拮抗物都已被建議對于多種疾病的治療是有用的。HGF的生產(chǎn)和其治療性應(yīng)用已在幾項專利中要求保護?；谄鋵τ诟嗡氐母哂H和力，已從血液中分離HGF(公開于1991年4月2日的US 5,004,805)。HGF的聚乙二醇化延長了其清除率，減少了所需劑量，并被認為改善了HGF治療的副作用(公開于1999年11月2日的美國專利號5,977,310)。HGF降解抑制性多糖例如肝素、透明質(zhì)酸、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、軟骨素、或硫酸軟骨素(公開于1998年4月17日的美國專利號5,736,506)可提高HGF水平。已經(jīng)要求保護HGF激活性蛋白酶(公開于1997年10月14日的美國專利號5,677,164)。HGF治療的應(yīng)用包括動脈阻塞性疾病的治療(公開于2000年10月17日美國專利號6,133,231)，炎性腸病的治療(公開于2001年11月20日的美國專利號6,319,899B1)，受到損傷和破壞的血管再表面化(resurfacing)的增加，例如通過血管手術(shù)或者血管成形術(shù)(公開于2000年10月17日的美國專利號6,133,234)。還聲稱HGF能夠改善由普遍應(yīng)用的免疫抑制劑引起的副作用(公開于1998年7月7日的美國專利號5,776,464)。最后，包含HGF基因的載體對于血管或其它靶器官的局部應(yīng)用已有描述用于多種治療目的(公開于2001年6月19日的美國專利號6,248,722B1)。Met和下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路長期被認為是癌癥治療的引人注目的靶標(biāo)。首先，利用腫瘤細胞系和動物中腫瘤模型的研究已表明Met在癌細胞侵入生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。第二，在結(jié)腸直腸癌的肝轉(zhuǎn)移中觀察到Met基因的擴增。第三，在幾種類型的人類腫瘤例如甲狀腺癌和胰腺癌中Met過表達。第四，在遺傳性乳頭狀腎癌發(fā)現(xiàn)有Met基因的種系(germ line)突變，且在散發(fā)性乳頭狀癌中發(fā)現(xiàn)有體細胞Met基因突變。
本發(fā)明鑒定了Met受體以前未知的功能，該受體的抑制代表了Met拮抗物新的治療性應(yīng)用。通過Met的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使肝細胞允許瘧疾子孢子的生產(chǎn)性侵入。Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對于子孢子通過內(nèi)化泡的形成和/或子孢子在由肝細胞質(zhì)膜形成的泡內(nèi)部增殖而進入肝細胞是必需的。Met此功能的發(fā)現(xiàn)是預(yù)防瘧疾感染的新方法的基礎(chǔ)。本發(fā)明進一步的實施方案是化合物的用途，所述化合物通過干擾HGF介導(dǎo)的Met激活或Met下游的信號事件預(yù)防瘧疾感染的形成，所述Met激活或Met下游的信號事件涉及致使肝細胞允許瘧疾寄生蟲的感染。幾種Met拮抗物在文獻中已有描述，且某些已在專利要求保護用于治療至少部分由Met過度或異常的功能引起的疾病的用途。以前要求保護的有關(guān)Met拮抗物的適應(yīng)癥是惡性腫瘤的治療。Met拮抗物對于感染性疾病并且尤其是瘧疾寄生蟲感染治療的潛在應(yīng)用通過本發(fā)明變得顯而易見。本發(fā)明要求保護的是Met拮抗物對于預(yù)防瘧疾寄生蟲造成的人類感染的用途。已知的HGF拮抗物在下面的部分中有所描述。
II.HGF受體拮抗物A.HGF變體HGF的多種形式——天然存在的和通過對HGF編碼cDNA的遺傳操作所產(chǎn)生的，均能拮抗某些或所有Met功能。未切割的前HGF結(jié)合但不激活Met。通過最初HGF轉(zhuǎn)錄物的不同剪接產(chǎn)生了幾種HGF同工型。這些同工型包括NK1(由HGF的N結(jié)構(gòu)域和第一個三環(huán)結(jié)構(gòu)域組成)和NK2(由HGF的N結(jié)構(gòu)域和前兩個三環(huán)結(jié)構(gòu)域組成)。發(fā)現(xiàn)于獼猴子宮內(nèi)膜和胎盤中的另外兩種變體即dNK1和dNK2與NK1和NK2同工型相似，只是dNK1和dNK2編碼在第一個三環(huán)結(jié)構(gòu)域中帶有5個氨基酸缺失的蛋白質(zhì)[Lindsey和Brenner，Mol Human Reprod.881-87(2002)]。NK1和NK2以高親和力結(jié)合到HGF受體Met上并已報道作為HGF拮抗物[Lokker和P.J.Godowski，J.Biol.Chem.26817145-17150(1993)；Chan等人，Science2541382-1387(1991)]。然而，隨后的研究顯示，依賴于細胞環(huán)境、肝素的存在或缺乏、和所分析的HGF的功能，這些HGF變體既可作為部分HGF激動劑也可作為HGF拮抗物。利用過表達轉(zhuǎn)基因HGF、NK1、NK2、HGF+NK1或HGF+NK2的小鼠的體內(nèi)研究揭示了HGF同工型潛在的體內(nèi)功能。HGF的轉(zhuǎn)基因表達具有多種表型結(jié)果，例如增強的肝生長、進行性腎血管球硬化癥、嗅粘膜的破壞、肌細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的異常定位及黑色素細胞在真皮和表皮中異常定位、早熟的乳腺小葉肺泡發(fā)育(lobuloalveolar)和對腫瘤誘導(dǎo)的易感性。NK1的轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)生類似的表型，而NK2的轉(zhuǎn)基因表達未顯示出HGF和NK1誘導(dǎo)的表型特征。在HGF+NK2雙轉(zhuǎn)基因小鼠中NK2拮抗HGF過表達的病理結(jié)果并下調(diào)移植的Met表達型腫瘤細胞的皮下生長。然而，NK2的轉(zhuǎn)基因過表達促進這些相同腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。因而，NK2拮抗許多針對HGF的反應(yīng)，但與HGF都具有解離(分散)細胞的能力——促進轉(zhuǎn)移的應(yīng)答[Otsuka等人，Molecular和Celleular Biology 202055-2065(2000)]。
另一種NGF變體NK4是通過用彈性蛋白酶對HGF的單切割消化產(chǎn)生的。NK4包含N末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)和4個三環(huán)結(jié)構(gòu)域。與NK1和NK2相比，NK4是純的HGF拮抗物[Date等人，F(xiàn)EBS Letters 4201-6(1997)]。像分離的HGFα鏈一樣，NK4結(jié)合Met但不誘導(dǎo)其自磷酸化，除非加入HGFβ鏈。由于其拮抗HGF的能力，NK4蛋白質(zhì)或NK4基因轉(zhuǎn)移的施用[Hirao等人，Cancer Gene Ther 9700-7(2002)；Maehara等人，Clin ExpMetastasis 19417-26(2002)]估計為治療Met表達型癌癥的新方法。已經(jīng)工程化而對蛋白酶剪切呈抗性的類似于NK4的單鏈HGF變體在公開于1999年3月9日的美國專利號5,879,910和公開于1996年12月3日美國專利號5,580,963中有所描述。
B.可溶性Met受體Met的可溶性形式釋放自培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和多種腫瘤細胞系。認為可溶性受體阻礙HGF對細胞表面結(jié)合的Met的激活。已產(chǎn)生Met-IgG融合蛋白，其保持了以高親和力結(jié)合HGF的能力并因此能夠中和HGF的活性。
C.制管張素制管張素——血管發(fā)生的抑制劑，是包含3-4個三環(huán)結(jié)構(gòu)域的纖溶酶原的片段。認為制管張素的抗血管發(fā)生效應(yīng)是基于其抑制內(nèi)皮細胞表面的ATP酶、及干擾整聯(lián)蛋白功能和細胞外周蛋白質(zhì)水解的能力。最近的研究指出制管張素的抗血管發(fā)生活性至少部分是由于其中和HGF效應(yīng)的能力[Wajih和Sane，在線預(yù)先發(fā)表在Blood，October 24，(2002)]。
制管張素與HGF具有47％的序列同源性，結(jié)合Met并防止內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中HGF介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。它抑制這些細胞應(yīng)答HGF的增殖，但不抑制這些細胞應(yīng)答通過蛋白質(zhì)酪氨酸激酶受體而不是Met起作用的其它生長因子例如血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)或堿性成纖維細胞生長因子(BFGF)的增殖。因此制管張素作為選擇性Met拮抗物起作用。
D.抗-HGF受體抗體雖然某些抗Met抗體是受體激動劑，其它則阻斷配體介導(dǎo)的受體激活。Met阻斷性單克隆抗體和多種此類抗體的衍生物已由Genentech公司開發(fā)并在US 6,468,529B1(公開于2002年10月22日)、US 6,214,344B1(公開于2001年4月10日)、US 6,207,152B1(公開于1996年5月)和US 5,686,292(公開于1995年6月)中有所描述。聲稱這些抗體或此類抗體的衍生物可用于癌癥治療。
E.Met選擇性適體含有隨機序列的單鏈寡核苷酸能夠形成很多種結(jié)構(gòu)。結(jié)合到特異靶標(biāo)的寡核苷酸可通過被稱為SELEX方法的方法從大的隨機寡核苷酸文庫中篩選出來。選擇性地結(jié)合到Met并阻斷配體介導(dǎo)的Met激活的寡核苷酸配體已由Gilead公司利用SELEX方法鑒定出。這些HGF拮抗物在US6,344,321B1(公開于2002年2月2日)、US 5,843,653(公開于1995年6月)和US 5,475,096(公開于1991年6月)中有所描述。
III.HGF介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑A.Met c-尾肽Met胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的建模表明c-末端尾與催化口袋相接觸并因而作為受體的分子內(nèi)調(diào)節(jié)子。Bardelli等人設(shè)計了對應(yīng)于Met的c尾中序列的肽。通過利用相應(yīng)于觸角足同源域的內(nèi)化介導(dǎo)性序列的序列延伸所述肽使得這些肽成為細胞滲透性的。Met尾肽阻斷了配體誘導(dǎo)的自磷酸化以及下游Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此肽也阻斷了通過Met的近親Ron的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但并不影響通過經(jīng)其它蛋白質(zhì)酪氨酸激酶受體的EGF、PDGF或VEGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，Met c-尾肽是選擇性的Met/Ron拮抗物。
B.Grb2拮抗物SH2結(jié)構(gòu)域利用Tyr-P殘基C-近側(cè)的2或3個氨基酸內(nèi)另外的二級結(jié)合相互作用識別磷酸酪氨酸殘基(Tyr-P)。Tyr-P臨近殘基的差別產(chǎn)生了對于SH2結(jié)構(gòu)域亞家族的不同親和力。因而，特定組的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域可由包含Tyr-P的三肽選擇性地阻斷。SH2結(jié)構(gòu)域與磷酸化酪氨酸相互作用的抑制劑在公開于1999年7月13日的美國專利號5,922,697中有所描述。在其中以膦酰甲基苯丙氨酸或相關(guān)結(jié)構(gòu)替換Tyr-P殘基的化合物對降解磷酸酶是抗性的。肽的多種其它修飾增加了對于特異SH2結(jié)構(gòu)域的親和力或增強了化合物通過質(zhì)膜到達它們胞內(nèi)靶標(biāo)的能力[Yao等人J.Med.Chem.，4225-35(1999)]。已有報道Grb2 SH2結(jié)構(gòu)域的基于三肽的抑制劑可阻斷HGF介導(dǎo)的細胞運動性、基質(zhì)侵入和分枝形態(tài)發(fā)生。這些相同的抑制劑對HGF介導(dǎo)的細胞增殖只有較小的影響。具有對Grb2的SH2結(jié)構(gòu)域的特異高親和力的抑制劑在公開于2001年7月12日的美國專利號6,254,742B1中描述可用于治療癌癥、轉(zhuǎn)移、牛皮癬以及過敏性疾病、自身免疫疾病、病毒性疾病和心血管疾病的化合物。
C.Gab1磷酸化的誘導(dǎo)物
PKC-α和PKC-β對Grb2相關(guān)的粘合劑1(Gab1)的絲氨酸/蘇氨酸殘基的磷酸化為Met信號下調(diào)提供了機制。通過岡田酸對絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶PP1和PP2A的抑制導(dǎo)致了絲氨酸/蘇氨酸激酶例如PKCs的激活，以及gab1的絲氨酸/蘇氨酸殘基的高磷酸化。伴隨的酪氨酸殘基的高磷酸化阻止了Gab1為Met募集PI3激酶[Gual等人，Oncogene 20156-166(2001)]。
D.顯性失活的src變體Src經(jīng)其SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合到配體激活的Met的磷酸化酪氨酸殘基上。突變受體METM1268T組成性地結(jié)合src，并且表達突變受體基因的NIH3T3細胞在裸鼠中形成腫瘤。報道稱顯性失活的src構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進入這些細胞阻止了它們的生長，并下調(diào)了黏著斑激酶(FAK)和paxicillin的磷酸化，但對Grb2結(jié)合或PLC-γ磷酸化無影響[Nakaigawa等人，Oncogene192996-3002(2000)]。
E.PI3K抑制劑PI3K對Met的結(jié)合是不尋常的，在于它不包括規(guī)范基序YXXM而是新基序YVXV。盡管新基序?qū)I3K的p85亞單位的N-和C-末端SH2結(jié)構(gòu)域具有低親和力，但是Met c-尾的兩個相距很近的YVXV基序卻代表著PI3K的?？课稽c。該結(jié)合受合成的磷酸肽的抑制。PI3K介導(dǎo)的信號看來似乎對HGF誘導(dǎo)的細胞分散(細胞骨架重組、胞間連接點的丟失、細胞遷移)和形態(tài)發(fā)生是必須的。一種PI3K的抑制劑渥曼青霉素抑制Met誘導(dǎo)的膠原蛋白基質(zhì)上腎細胞的分枝。PI3K信號似乎對細胞轉(zhuǎn)化并不是必需的，但卻有助于轉(zhuǎn)移。
F.NFkB抑制劑在肝細胞中，HGF經(jīng)規(guī)范IkappaB磷酸化降解循環(huán)以及經(jīng)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2和p38促分裂原活化蛋白激酶級聯(lián)刺激NF-kappaB DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活。利用NFkB抑制劑的研究指出HGF誘導(dǎo)的NGkB激活是增殖和管泡發(fā)生所需的，但不是HGF的分散和抗細胞凋亡功能所需的[(Muller等人，Mol Cell Biol 221060-72，(2002)]。
G.小GTP結(jié)合蛋白質(zhì)的抑制劑Ras的抑制干擾上皮細胞的擴散、肌動蛋白重組、和分散。顯性失活的Rac消除非小細胞肺癌細胞中HGF誘導(dǎo)的擴散和肌動蛋白重組。Rho的顯微注射抑制HGF誘導(dǎo)的擴散和分散但不抑制運動性。
H.Hsp90拮抗物伴侶蛋白Hsp90穩(wěn)定許多涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)。此伴侶蛋白似乎是多種突變的或異常表達的信號蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和功能所需的，所述信號蛋白質(zhì)促進癌細胞的生長和/或存活。Hsp90的客戶蛋白質(zhì)包括突變的p53、Bcr-Abl、src、Raf-1、Akt、ErbB2和低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)。苯醌安沙霉素化合物格爾德霉素和除莠霉素(herbimycin)以及結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的根赤殼菌素(radicicol)阻斷Hsp90N-末端的核苷結(jié)合口袋并引起Hsp90客戶蛋白質(zhì)的降解，所述客戶蛋白質(zhì)中有許多涉及腫瘤發(fā)展。一種Hsp90的抑制劑17-烯丙基氨格爾德霉素(17AAG)目前處于I期臨床試驗，以及新的根赤殼菌素的肟衍生物(KF58333)正在臨床前評估中[(Soga等人，Cancer Chemother Pharmacol 48435-45，(2001))。
最近研究顯示Met是Hsp90客戶，其對格爾德霉素或相關(guān)化合物尤其敏感。在納摩爾濃度，格爾德霉素下調(diào)Met蛋白質(zhì)表達，抑制HGF介導(dǎo)的細胞運動性和侵入并使表達HGF和Met或組成型激活的Met突變體的細胞轉(zhuǎn)化表型得以回復(fù)。Met信號通路下游對于Hsp90抑制劑似乎更加敏感。格爾德霉素在飛摩爾(femtomolar)濃度抑制HGF介導(dǎo)的纖溶酶激活，該濃度是在它們的生長抑制濃度以下的9個數(shù)量級。有趣的是，已有報道稱在小鼠中根赤殼菌素對柏氏瘧原蟲具有適當(dāng)活性。[Tanaka等人，J.Antibiot.51153-60(1998)]。然而，此活性可能與Met抑制無關(guān)[Tanaka等人，J Antibiot 10880-8(1999)]。
IV.蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑蛋白質(zhì)上酪氨酸殘基的可逆磷酸化是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要機制。已知很多種天然的或合成的化合物是酪氨酸激酶抑制劑。幾乎所有這些抑制劑通過阻斷酶的ATP口袋來阻斷蛋白質(zhì)激酶。因此，許多具有不僅針對酪氨酸激酶而且針對絲氨酸/蘇氨酸和/或其他利用ATP的蛋白質(zhì)的廣譜活性。
1.通用的蛋白質(zhì)激酶抑制劑Indrocarbazole K252a最初分離自馬杜拉放線菌(Actinomadura)的培養(yǎng)液中，后來在對Ca2+介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗物的篩選中分離自擬諾卡氏菌(Nocardiopsis)。K252a抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶例如蛋白質(zhì)激酶C(PKCs)的多種同工型，cAMP和cGMP依賴性激酶以及蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，尤其是Trk和Met家族的那些。K252a在納摩爾濃度抑制Met介導(dǎo)的信號。該化合物抑制Met自磷酸化并阻止其下游效應(yīng)子MAPK激酶和Akt的活化。它防止MLP-29細胞中HGF介導(dǎo)的分散，減少GTL-16胃癌細胞中Met驅(qū)動的增殖，并逆轉(zhuǎn)NIH3T3成纖維細胞的Met介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。K252a及相關(guān)化合物是可用于治療Trk和Met驅(qū)動的癌癥的有前景的藥物的榜樣[Morotti等人，Oncogene 214885-4893，(2002)]。令人信服地，K252a可作為Met特異性抑制劑開發(fā)中的榜樣。
2.對蛋白質(zhì)酪氨酸激酶具有選擇性的抑制劑幾類化合物是已知的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑。幾種這類化合物已分離自植物或微生物并已廣泛用于研究目的。最著名的是染料木黃酮、熏草菌素A、酪氨酸磷酸化抑制劑47、除莠霉素、星形孢菌素和根赤殼菌素。除莠霉素A是苯醌型安沙霉素抗生素，其通過與它們的激酶結(jié)構(gòu)域共價相互作用而抑制廣譜的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶。星形孢菌素是吲哚咔唑抗生素，其抑制多種激酶，包括scr家族成員，及絲氨酸/蘇氨酸激酶。新近大量蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑已得以合成并在幾項專利申請中要求保護。1)雙單環(huán)的、雙環(huán)的或雜環(huán)的芳基化合物(PCT WO 92/20642)；2)1，2-亞乙烯基-吖吲哚衍生物(PCT WO94/14808)；3)1-環(huán)丙基-4-吡啶基-喹諾酮(美國專利號5,330,992)。4)苯乙烯基化合物(美國專利號5,217,999)；2)苯乙烯基取代的吡啶基化合物(美國專利號5,302,606)；5)喹唑啉衍生物(EP申請?zhí)? 566 266A1和美國專利號6,103,728)；6)硒代吲哚和硒化物(PCT WO94/03427)；7)三環(huán)多羥基化合物(PCT WO 92/21660)；8)苯甲基膦酸化合物(PCT WO91/15495)；9)酪氨酸磷酸化抑制劑樣的化合物(美國專利號6,225,346B1)；10)噻吩基化合物(美國專利號5,886,195)；11)對src和FGF-r酪氨酸激酶具有選擇性的基于苯二氮雜的化合物(公開于2000年8月8日的美國專利號6,100,254)。來自多種類別的酪氨酸激酶抑制劑被申請用于癌癥的治療，所述癌癥由酪氨酸激酶例如Met以及HER2、EGFR、IGFR、PDGFR、scr和KDR/FLK-1驅(qū)動。已知的酪氨激酶抑制劑中沒有對于Met是選擇性的。然而，可想象將來能夠開發(fā)出Met特異性的抑制劑。這種樂觀是基于已合成幾種化合物的事實，所述化合物抑制有限的一組蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，其中之一經(jīng)批準(zhǔn)用于癌癥治療且其中的幾種處于臨床開發(fā)中。這些化合物包括1)吡唑嘧啶PP1顯示對lck和src激酶的選擇性，該選擇性高于對ZAP-70、JAK2和EGF受體激酶的選擇性。2)STI-571(GLEEVEC)抑制abl、PDGF受體和c-kit酪氨酸激酶的所有形式。3)ZD1839是對EGF受體具有一定選擇性的合成的苯胺基喹唑啉。4)OSI-774是另一個對EGF受體具有一定選擇性的經(jīng)口活性喹唑啉衍生物。5)4-苯胺基喹唑啉衍生物顯示對VEGF-R的選擇性(美國專利6,291,455B1，公開于2001年9月18日)。6)SU101顯示對PDGF受體的選擇性，但其抗增殖效應(yīng)部分是由于開環(huán)代謝物，該代謝物抑制二氫乳清酸脫氫酶，其是一種對嘧啶的生物合成至關(guān)重要的線粒體酶。7)芳基和雜芳基喹唑啉化合物顯示對CSF-R(美國專利RE37,650E，公開于2002年4月9日)的選擇性，在吲哚滿-2-酮藥效團和FGF受體酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的晶體學(xué)研究基礎(chǔ)上設(shè)計出VEGF受體(Flk1/KDR)拮抗物SU 5416。9)二單環(huán)和二環(huán)芳基及雜芳基化合物顯示對EGFR和PDGFR(美國專利號5,409,930)的選擇性。10)Piceatannol(3，4，3，5V-四羥基-反式-芪)顯示對syk和lck的選擇性，但也抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶和腺苷三磷酸酶。11)基于苯二氮雜的幾種化合物顯示對非受體型酪氨酸激酶src及對FGF-R酪氨酸激酶受體家族的一定選擇性。這些實例表明可產(chǎn)生出對一種或幾種酪氨酸激酶具有選擇性的化合物。
V.蛋白質(zhì)激酶抑制劑的抗瘧疾效果像植物一樣，有關(guān)的apicomplexan寄生蟲例如瘧原蟲似乎不產(chǎn)生蛋白質(zhì)酪氨酸激酶。少數(shù)報道指出瘧原蟲中發(fā)生蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化(見下面的A部分)。然而同源性搜索未能檢測到任何與已知蛋白質(zhì)酪氨酸激酶家族有關(guān)的序列。因此可以想象，蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑的抗瘧疾效果是由于人類宿主產(chǎn)生的這些酶的抑制。已報道多種喹唑啉衍生物具有抗瘧疾活性。這些化合物包括2，4-二氨基-6(3，4-二氯芐胺喹唑啉(PAM1392[Thompson等人，Exp.Parasitol 2532-49，1969])、2，4-二氨基-6-[93，4-二氯芐基-亞硝基氨基]-喹唑啉(CI-679)[Schmidt和Rossan，Am.J.Trop.Med.Hyg.28781-92，(1979)]、由Elslager和同事[Elsager等人，J.Med.Chem.211059-70，(1978)]及中國科學(xué)家[Gy等人，Xao Xue Bao 19108-18，(1984)，Yao等人，Yao Xue Bao 1976-8，(1984)]合成的幾種其它2，4-二氨基-6-取代的喹唑啉衍生物。2，4-二氨基-5-甲基-693，4，5-三甲氧基苯胺基甲基)喹唑啉鹽在公開于1983年3月15日的美國專利號4,376,858中有所描述。喹唑啉衍生物抗瘧原蟲作用的一種可能模式是酪氨酸激酶的抑制(公開于2000年8月15日的美國專利號6,103,728)。
A)瘧原蟲蛋白質(zhì)激酶的抑制1)Dluzeski和Garda報道了幾種蛋白質(zhì)激酶抑制劑(星形孢菌素、染料木黃酮、2，5-二羥基肉桂酸甲酯、酪氨酸磷酸化抑制劑B44和B46，熏草菌素A和RO3)抑制惡性瘧原蟲的紅細胞周期[Dluzewski和Garda，Experientia 52621-623，(1996)]。除了星形孢菌素——一種強的絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑之外，這些化合物優(yōu)選地抑制蛋白質(zhì)酪氨酸激酶。這些抑制劑阻止了寄生蟲在紅細胞內(nèi)部的發(fā)育和/或侵入。由于這些抑制劑的廣譜活性，蛋白質(zhì)酪氨酸激酶的抑制是否在所觀察到的效果中起到任何作用還不清楚，也不清楚靶蛋白質(zhì)是來源于紅細胞還是寄生蟲。
2)在從微生物中篩選青蒿素樣的化合物時，Tanaka和同事鑒定了幾種具有抗瘧疾活性的真菌代謝物。這些化合物中之一、廣譜蛋白質(zhì)激酶抑制劑根赤殼菌素對于小鼠中的柏氏瘧原蟲是中等活性的[Tanaka等人，J.Antibiot 51153-60，(1998)]。
3)新近Sharma報道了膜結(jié)合的PTK活性在從環(huán)形期到營養(yǎng)子期的成熟過程中增加。氯喹對PTK活性的抑制經(jīng)建議代表了此種藥物對抗瘧原蟲作用的一種可能機制[Sharma和Mishra，Indian J.Biochem.Biophys.36299-304(1999)；Sharma，Indian J.Exp.Biol.381222-6(2000)]。
B)人類蛋白質(zhì)酪氨酸激酶的抑制瘧原蟲的多種致病作用均由人類宿主的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶介導(dǎo)，因而可通過蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑來抑制。文獻中已報道了幾個實例。
1)受感染的紅細胞對血管內(nèi)皮的粘附涉及惡性瘧原蟲膜蛋白質(zhì)1(PfEMP1)對由宿主的內(nèi)皮細胞表達的CD36的結(jié)合。CD36介導(dǎo)的信號對于粘附是必需的。Src和lck激酶的選擇性抑制劑吡唑嘧啶PP1抑制此種信號并阻止粘附[Yipp等人，Blood online，(2002)]。
2)CD36和CD36介導(dǎo)的蛋白質(zhì)激酶依賴性信號還涉及由單核細胞和巨噬細胞對惡性瘧原蟲感染的紅細胞的非調(diào)理性清除。染料木黃酮及選擇性ERK和p38 MAPK抑制劑(PD98059和SB203580，分別地)都將受感染的紅細胞的攝取減少到與CD36阻斷幾乎相同的程度[McGilvray等人，Blood 963231-40，(2000)]。
3)糖基磷脂酰肌醇(GPI)是惡性瘧原蟲的主要毒素。瘧疾的GPI在加入細胞的1分鐘內(nèi)誘導(dǎo)多重胞內(nèi)底物快速起始酪氨酸磷酸化。這些信號涉及寄生蟲粘附的上調(diào)及誘導(dǎo)巨噬細胞和內(nèi)皮細胞釋放一氧化氮(NO)。粘附和NO釋放均可由酪氨酸激酶拮抗物酪氨酸磷酸化抑制劑和染料木黃酮抑制[Tachado等人，J Immunol 1561897-1907，(1996)；Schofield等人，J.Immunol.1561886-96]。
在以前的工作中蛋白質(zhì)酪氨酸激酶受體Met未涉及瘧疾感染。本發(fā)明將蛋白質(zhì)酪氨酸激酶Met確認為肝細胞對由瘧疾子孢子導(dǎo)致的感染的易感性極其重要的介質(zhì)。
VI.HGF相關(guān)的抗瘧疾藥A.硫酸多糖如上所述，HGF的水平可通過HGF降解抑制性多糖增加，所述多糖包括硫酸葡聚糖、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、軟骨素和硫酸軟骨素而得以提高。硫酸化多糖例如硫酸化凝乳聚糖、硫酸糊精、硫酸軟骨素、肝素、carageenan與奎寧的組合用于治療瘧疾在1998年7月14日公開的美國專利號5,780,452中有所描述。所建議的策略是以硫酸化多糖抑制瘧疾寄生蟲對人類紅細胞的侵入的能力為基礎(chǔ)。本發(fā)明提高了關(guān)于此策略的關(guān)注，因為硫酸化多糖可通過抑制HGF降解而提高HGF水平，這是在1998年4月17日公開于美國專利號5,736,506中所描述的事實。因此將硫酸化多糖排除于本發(fā)明的抗瘧疾活性劑之外。
實施例實施例1與瘧原蟲子孢子孵育的肝細胞釋放‘感染易感性誘導(dǎo)因子’(ISIF)從包含小鼠肝癌細胞Hepa1-6和約氏瘧原(P.yoelii)蟲子孢子的培養(yǎng)物中(mH/Py條件培養(yǎng)基)產(chǎn)生上清液。為檢測ISIF活性，用mH/Py條件培養(yǎng)基孵育新鮮的肝癌細胞不同的時段。然后洗滌細胞并與約氏瘧原蟲子孢子一起孵育。24小時后通過對寄生蟲的紅細胞外形式(EEFs)染色來檢驗感染。作為對照，我們用經(jīng)新鮮培養(yǎng)基預(yù)孵育過相同時段的Hepa1-6細胞，之后加入約氏瘧原蟲子孢子。用mH/Py條件培養(yǎng)基對肝癌細胞的預(yù)處理提高了感染水平(圖1a)。在用mH/Py條件培養(yǎng)基預(yù)處理1小時的肝癌細胞中觀察到對感染的易感性的最大增強(圖1a)。用熱滅活的子孢子所獲得的mH/Py條件培養(yǎng)基是無效的(圖1b)。由于子孢子是通過對感染的蚊唾液腺解剖而得，我們也測試了從包含肝癌細胞和未感染的蚊子的唾液腺材料的培養(yǎng)物獲得的條件培養(yǎng)基。如此所得條件培養(yǎng)基是無效的(圖1b)。
實施例2
受損肝細胞的ISIF釋放為研究ISIF的來源(子孢子或肝細胞)及其釋放的必要條件，利用機械應(yīng)力將Hepa1-6細胞損傷。將受損的細胞放入組織培養(yǎng)孔中并在1小時后收集上清液。在加入約氏瘧原蟲子孢子之前用此上清液預(yù)孵育新鮮的Hepa1-6細胞。上清液的預(yù)孵育導(dǎo)致了類似于用mH/Py條件培養(yǎng)基所觀察到的感染的增強(圖1c)。該發(fā)現(xiàn)說明ISIF不是衍生自子孢子而是由于損傷而釋放自肝細胞。
實施例3ISIF是肝細胞生長因子(HGF)為測試ISIF活性是否由已知的生長因子介導(dǎo)，對已知在損傷后釋放的兩種詳細表征的生長因子進行了測試堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和肝細胞生長因子(HGF)。在加入柏氏瘧原蟲子孢子之前用人的HGF或bFGF預(yù)孵育HepG2細胞。作為陽性和陰性對照，用hH/Pb條件培養(yǎng)基或新鮮培養(yǎng)基分別孵育細胞。HGF比hH/Pb條件培養(yǎng)基更大程度地增強感染(圖2a)。bFGF是無效的。為確定hH/Pb條件培養(yǎng)基中的ISIF是否是HGF，在與新的HepG2細胞和子孢子孵育前，將中和性單克隆抗HGF抗體加入此培養(yǎng)基中?？贵w不僅消除了hH/Pb條件培養(yǎng)基的效果，還將感染降低至在照培養(yǎng)物中所觀察到的基礎(chǔ)水平之下(圖2a)。單克隆抗bFGF抗體的加入沒有效果(圖2a)。這些結(jié)果表明條件培養(yǎng)基中的ISIF是HGF，并說明HGF釋放是肝細胞的子孢子感染的先決條件。
實施例4ISIF/HGF由肝細胞在損傷后分泌用布雷菲德菌素-A(BFA)處理HepG2細胞，布雷菲德菌素-A(BFA)是蛋白質(zhì)向高爾基小泡運輸?shù)囊种苿?，可阻斷真核細胞中固有分泌。然后洗滌BFA處理過的細胞和未處理的對照細胞，并與柏氏瘧原蟲子孢子一起孵育以產(chǎn)生條件培養(yǎng)基。此條件培養(yǎng)基的測試顯示BFA處理抑制ISIF/HGF分泌(圖2b)。BFA的效果是劑量依賴性的。在不同時間段的孵育后收集機械損傷的HepG2細胞的上清液。如通過感染易感性試驗(圖2c)和蛋白質(zhì)印跡分析(圖2d)所測定的ISIF/HGF水平隨時間而增加。ISIF活性通過加入中和性抗HGF抗體而得以消除(圖2c)。
實施例5ISIF/HGF活性與感染水平的相關(guān)性盡管具有較低的效率，但是柏氏瘧原蟲能夠感染非肝的上皮細胞系HeLa(圖2e)。進行了一系列實驗以比較HepG2細胞和HeLa細胞對于寄生蟲誘導(dǎo)的ISIF/HGF產(chǎn)生和對ISIF/HGF的反應(yīng)性。條件培養(yǎng)基產(chǎn)生自寄生蟲與HepG2細胞(hH/Pb條件培養(yǎng)基)及與HeLa細胞(HeLa/Pb條件培養(yǎng)基)的培養(yǎng)物。兩種條件培養(yǎng)基均包含ISIF/HGF，雖然其水平不同。如通過蛋白質(zhì)印跡和ELISA所確定的，ISIF活性與HGF水平顯著相關(guān)。像HepG2細胞一樣，HeLa細胞對ISIF/HGF是敏感的。通過hH/Pb條件培養(yǎng)基增強了HeLa細胞感染且通過HeLa/Pb條件培養(yǎng)基增強了HepG2感染。hH/Pb條件培養(yǎng)基中的ISIF活性總是高于HeLa/Pb條件培養(yǎng)基中的ISIF活性(圖2e)。這些數(shù)據(jù)說明HeLa細胞對ISIF/HGF起反應(yīng)且感染的程度隨HGF劑量而提高。
實施例6HGF對感染的作用通過Met介導(dǎo)應(yīng)用多種實驗方案以證明HGF經(jīng)其受體Met而作用。首先，用柏氏瘧原蟲子孢子與Hepa1-6細胞孵育1小時，致使Met激酶的激活，如通過受體的酪氨酸磷酸化所證實的(圖3a)。第二，在用組成性激活的MET酪氨酸激酶(tpr-Met)14轉(zhuǎn)染的HepG2細胞中(圖3b)，以及在用針對MET15胞外結(jié)構(gòu)域的對抗性單克隆抗體處理過的HepG2細胞中(圖3c)柏氏瘧原蟲的感染得以增強。這些結(jié)果顯示MET的激活增強了肝細胞對子孢子導(dǎo)致的感染的易感性。另外，由于在tpr-Met中tpr序列取代了Met的胞外結(jié)構(gòu)域，這就排除了如發(fā)生在利斯特氏菌(Listeria)感染中的瘧原蟲子孢子能夠利用Met作為受體進入肝細胞的可能性。
將兩種方案用于下調(diào)MET。首先，用包含融合到gfp序列上的met的胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域的嵌合構(gòu)建體轉(zhuǎn)染HepG2。該構(gòu)建體的產(chǎn)物表達于質(zhì)膜上，并結(jié)合HGF但由于其缺乏用于激酶結(jié)構(gòu)域和用作胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)物的?？课稽c的酪氨酸，所述產(chǎn)物不能將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞；此嵌合體起顯性干涉蛋白質(zhì)的作用，由于其與內(nèi)源性MET形成二聚物，阻止其激活。由于只有54.3±2.1％的轉(zhuǎn)染效率，柏氏瘧原蟲子孢子感染在總細胞群體中減少了大約60％(圖3d)。如通過GFP表達所顯示的受轉(zhuǎn)染的個體細胞完全抵抗感染。利用FGF受體的顯性干涉構(gòu)建體的類似實驗不影響HepG2對于柏氏瘧原蟲感染的易感性。在第二種方法中，利用干擾RNA下調(diào)MET。用特異met oligos轉(zhuǎn)染HepG2細胞的兩個獨立群體引起了如蛋白質(zhì)印跡檢測的MET表達的減少(圖3e)。這些細胞的感染率與模擬轉(zhuǎn)染的細胞相比降低了90％(圖3f)。這些結(jié)果證實HGF通過其受體MET的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是瘧原蟲子孢子對肝細胞感染的先決條件。
實施例7瘧疾感染中HGF/MET的體內(nèi)相關(guān)性通過肝臟灌注獲得了原代肝細胞。由這些細胞限定條件的培養(yǎng)基具有與由肝細胞系限定條件的培養(yǎng)基類似的ISIF活性(圖4a)。特異的HGF受體抑制劑K252a消除了ISIF活性(圖4a)。利用只滲透進入損傷細胞的細胞-不透性熒光示蹤劑大分子可檢測到已被子孢子穿過的細胞。對HGF染色前，在熒光標(biāo)記的葡聚糖存在下將約氏瘧原蟲子孢子與Hepa1-6細胞一起孵育。為檢測體內(nèi)由子孢子穿過的細胞，利用了用于小鼠中受損細胞檢測的標(biāo)準(zhǔn)試驗。獲得了肝組織切片并對HGF染色。在體外和體內(nèi)葡聚糖陰性細胞均不表達HGF，而大多數(shù)葡聚糖陽性細胞對于HGF染色也是陽性的(圖4b)。結(jié)果表明在肝細胞感染過程中由子孢子穿過的肝細胞表達HGF，這大概是由于損傷引起的脅迫，且表明HGF通過其受體MET的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是感染所需的。為證明在瘧疾的自然感染中MET信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是肝細胞感染過程所需的，用表達針對MET的顯性干涉蛋白質(zhì)(MET-GFP，實施例7)的慢病毒注射一組3只小鼠。作為對照，用類似但只表達GFP的病毒注射一組3只小鼠。兩天后，用300000個瘧原蟲子孢子刺激兩組的小鼠。并在2或3天后檢查寄生蟲血癥。獲得每個肝臟切片以確定病毒感染的水平(圖4c)。結(jié)果顯示肝臟中MET-GFP的表達是自然感染所需的(圖4d)。
實施例8染料木黃酮對體外柏氏瘧原蟲子孢子引起的肝臟感染的影響在DMEM 10％FCS，1mM谷氨酰胺中培養(yǎng)HepG2細胞。從感染的印度按蚊(Anopheles stephensi)唾液腺的解剖中獲得了柏氏瘧原蟲子孢子。將柏氏瘧原蟲子孢子(5×104)加入到2×105HepG2細胞的單層中(染料木黃酮存在或不存在下)達24小時，之后固定并用抗EEF的mAb(2E6)隨后用抗小鼠IgG-FITC抗體染色。通過計數(shù)每蓋玻片EEFs的數(shù)目來定量感染。結(jié)果顯示于圖5中。結(jié)果顯示了受感染細胞的數(shù)目。25μM的染料木黃酮已經(jīng)顯示出感染減少大約75％。
實施例9染料木黃酮對體內(nèi)柏氏瘧原蟲子孢子引起的肝臟感染的影響再次從感染的印度按蚊唾液腺的解剖中獲得了柏氏瘧原蟲子孢子。將柏氏瘧原蟲子孢子(5×104)靜脈注射進入兩組小鼠，每組5只。其中一組在6小時前用含4mg染料木黃酮的DMSO注射注射，而另一組只用DMSO注射(對照)。42小時后用寄生蟲特異的引物通過實時RT-PCR對肝感染進行定量。結(jié)果顯示于圖6中。感染減少大約80％。
I.目前應(yīng)用的抗瘧疾藥物如前所述，本發(fā)明的抗瘧疾活性劑可任選地包含目前應(yīng)用的抗瘧疾藥物，聯(lián)合HGF活性抑制劑。
盡管很久前就已知抗瘧疾藥物存在于開花植物青蒿(artemisia annua)和金雞納樹皮中，目前卻只有少數(shù)可用于治療或預(yù)防該疾病的藥物。目前應(yīng)用的抗瘧疾藥物在最近的綜述文章中[Ridley，Nature 415686-693，(2002)]和由P.Rosenthal編輯的書中[Antimalarial chemotherapy.Mechanisms of action，resistance，and new directions in drug discovery，Humana，Totowa，New jersey，(2001)]有所描述。最廣泛研究的抗瘧疾藥物是喹啉、抗葉酸藥、青蒿素、電子轉(zhuǎn)移抑制劑例如阿托代醌(atoquavone)，和抗生素例如四環(huán)素。為消除抗性的產(chǎn)生，將一些藥物以固定的組合使用，且?guī)追N新的藥物組合目前正在研究中。
A.喹啉在南美洲，產(chǎn)生自金雞納樹樹皮的粉末長久以來被用于治療發(fā)燒。17世紀(jì)金雞納樹粉末引入歐洲且在1820年由Pelletier和Caventou將抗發(fā)熱的成分——奎寧分離出來?？鼘幠壳坝糜趪?yán)重瘧疾、多種藥物抗性瘧疾和懷孕的前三個月期間瘧疾的治療?？岫∈强鼘幍挠倚菍τ钞悩?gòu)體，比奎寧活性更強，但也是更具心臟毒性且更加昂貴。由于其作為抗心率不齊活性劑的廣泛有效性，腸胃外奎尼丁在美國用于嚴(yán)重瘧疾的治療。當(dāng)以快速濃注注射方式施用時，奎寧和奎尼丁可能引起低血壓，以及低血糖，這在懷孕婦女尤其是問題。為了鑒定更有效和更安全的抗瘧疾藥物，以奎寧結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)合成了大量相關(guān)化合物。1934年氯喹首先在德國合成并被獨立地確定為二戰(zhàn)期間美國所合成的一系列4-氨基喹啉中最有希望的首選藥物。具有多種商品名例如Nivaquine、Malarquine和Aralen的氯喹幾十年來已成為惡性瘧原蟲化學(xué)療法的支柱。它便宜、當(dāng)以正確的劑量應(yīng)用時安全、高效且對于門診病人使用是可行的。氯喹通常是良好耐受的，盡管它可能引起瘙癢，尤其是在黑皮膚病人中，還可引起惡心，和少見的神經(jīng)精神癥狀或小腦功能紊亂。氯喹可通過肌內(nèi)或皮下施用或者通過靜脈內(nèi)灌注給藥。針對氯喹的抗性已緩慢發(fā)展，但目前是廣泛存在的，不僅在東南亞，而且在非洲的許多地區(qū)。它目前用于非惡性感染的治療以及還未出現(xiàn)其抗性的地區(qū)的惡性瘧原蟲瘧疾的治療和預(yù)防。
氯喹是4-氨基喹啉。為鑒定針對氯喹抗性瘧原蟲株系有活性的新藥，合成了大量的4-氨基喹啉類。該努力導(dǎo)致了目前用于治療氯喹抗性瘧疾的氨酚喹(氨酚喹啉)的發(fā)現(xiàn)。然而，其顯示出與氯喹的一些交叉抗性的事實和用于預(yù)防時的副作用，例如肝炎和粒細胞缺乏癥限制了氨酚喹的用途。盡管過去三十年的廣泛努力，但是科學(xué)家們未能產(chǎn)生出替代氯喹的便宜且有效的4-氨基喹啉[由O′Neill等人綜述，Pharmacol.Ther.7729-58，(1998)]。
在20世紀(jì)60年代，兩種抗瘧疾藥甲氟喹和鹵泛曲林在美國Walter Reed醫(yī)學(xué)研究所(Walter Reed Institute of Medical Research)中的奎寧相關(guān)結(jié)構(gòu)測試中浮現(xiàn)出來。由Hoffmann La Roche以商品名Lariam開發(fā)的甲氟喹于1985年首先應(yīng)用于預(yù)防，且后來已用于1450萬人的預(yù)防和160萬人的治療。它目前用于有氯喹抗性的地區(qū)的治療和預(yù)防中。甲氟喹具有2到3周的消除半衰期。治療的過程包括2或3個劑量，副作用包括消化道失調(diào)和神經(jīng)精神影響。像甲氟喹一樣，緊密相關(guān)的鹵泛曲林是昂貴的。由于其吸收在病人與病人間有所不同，已開發(fā)了靜脈內(nèi)制劑。鹵泛曲林用在疑為氯喹抗性的惡性瘧原蟲引起的瘧疾治療中。其用途受到致命性心臟毒性的限制。
伯胺喹是一種8-氨基喹啉，其在Paul Ehrlich 1891年發(fā)現(xiàn)甲基藍具有弱的抗瘧原蟲活性后開發(fā)出來。從一大系列甲氧基和8-氨基喹啉衍生物中，首先將撲瘧喹啉確定為引導(dǎo)者并于1926年引入藥物。在更少毒性、更有效的此類化合物的探索中出現(xiàn)了戊胺喹、異戊胺喹和伯胺喹。伯胺喹在朝鮮戰(zhàn)爭期間得以廣泛測試并且現(xiàn)在用于特定適應(yīng)癥中。伯胺喹與氯喹盡管結(jié)構(gòu)上相關(guān)，但是在作用模式上有所不同。不像其它的奎寧抗瘧疾藥，伯胺喹針對惡性瘧原蟲的肝階段起作用并破壞間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲的晚期肝階段和潛伏形式。后一活性在目前所用的抗瘧疾藥中是獨一無二的，并使得伯胺喹成為預(yù)防瘧疾復(fù)發(fā)的藥物選擇，所述瘧疾復(fù)發(fā)可能直到間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲最初侵襲后的40周才會發(fā)生。盡管伯胺喹針對間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲的紅細胞形式起作用，它并不抑制這些寄生蟲的最初侵襲。與間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲的紅細胞形式相反，惡性瘧原蟲的那些形式對伯胺喹是不敏感的。因此，伯胺喹不用于由惡性瘧原蟲引起的瘧疾治療。伯胺喹具有很短的半衰期而必須每天給藥。胃腸副作用通常是溫和的，但可能發(fā)生更嚴(yán)重的氧化性溶血，尤其是在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏的病人中。相關(guān)化合物他非諾喹(tafenoquine)清除慢得多，具有大約14天的終末半衰期。此新的化合物可能比伯胺喹具有更大的治療指數(shù)，但其治療作用還有待于確定。
B.青蒿素青蒿素是中國開花植物青蒿(Artemisia annua)的活性成分，中國的草藥醫(yī)生對所述青蒿在過去的2000年前已有所使用。20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)青蒿的醚提取物青蒿素對抵抗小鼠瘧疾有效。1972年中國科學(xué)家分離了其活性成分。中國生產(chǎn)了基于水的青蒿酯制劑并安全地用于100多萬瘧疾病人的治療中。在美國，Klayman發(fā)現(xiàn)了蒿屬物種青蒿，并開發(fā)了基于油的提取物，其用于嚴(yán)重性瘧疾治療測試。由于動物中神經(jīng)毒性影響，基于油的制劑在西方世界未經(jīng)批準(zhǔn)。然而，由于喹啉為基礎(chǔ)的抗瘧疾藥抗性的出現(xiàn)，對于青蒿素的興趣已有所增強并已生產(chǎn)了幾種半合成的衍生物。除了已通過從青蒿植物中提取所獲得的青蒿素外，目前還使用幾種半合成的衍生物。它們包括蒿甲醚、青蒿素甲醚、青蒿酯和二氫青蒿素。后一化合物是所有其他基于青蒿素藥物的代謝物及體內(nèi)的主要活性劑。青蒿素具有抗紅細胞內(nèi)所有寄生蟲階段，尤其是幼年的環(huán)形體的廣譜活性。青蒿素比其它抗瘧疾藥物能更快速度地降低寄生蟲血癥并抑制配子體傳播。半合成青蒿素衍生物的缺點是它們比母本藥物更加昂貴。當(dāng)這些化合物單獨應(yīng)用時，青蒿素衍生物及其活性代謝物二氫青蒿素的短半衰期需要5-7天的治療。蒿甲醚最初用于治療嚴(yán)重瘧疾。然而，此藥物的肌內(nèi)應(yīng)用證明并不比奎寧的靜脈內(nèi)應(yīng)用更好。青蒿素及其衍生物目前與其它抗瘧疾藥聯(lián)合用于對非并發(fā)瘧疾的治療。
B.喹啉和青蒿素的作用模式理解已知的抗瘧疾藥物的作用和瘧原蟲針對這些藥物發(fā)展的抗性所潛在的分子機制對于將來藥物的開發(fā)是重要的。喹啉和青蒿素濃縮在溶酶體食物泡中，在此處它們似乎通過與血紅素相互作用而發(fā)揮其抗瘧疾活性。血紅素由宿主紅細胞中豐富的血紅蛋白降解產(chǎn)生。亞鐵血紅素(FeII)氧化成為正鐵血紅素(FeIII)并作為叫作瘧原蟲色素的惰性色素隔離于胞質(zhì)中。瘧原蟲色素包含聚集的血紅素二聚體的結(jié)構(gòu)晶格。血色素的隔離保護了寄生蟲免受游離血紅素的脂質(zhì)過氧化作用或其它毒性影響。喹啉的首要靶標(biāo)是較老的營養(yǎng)子，它們在其食物泡中產(chǎn)生大量的亞鐵血紅素。人們認為氯喹和其它抗瘧疾喹啉抑制亞鐵血紅素的二聚化或阻止其從食物泡至胞質(zhì)的處理，胞質(zhì)是瘧原蟲色素形成的地方。青蒿素的抗瘧疾作用也依賴于血紅素。人們認為這些藥物經(jīng)自由基殺死寄生蟲，所述自由基由于在亞鐵血紅素存在下藥物的過氧化物鍵的氧化切割而產(chǎn)生。然而，喹啉抗瘧疾藥[Sullivan等人，J.Biol Chem 27331103-31107，(1998)]和青蒿素[OlIiaro等人，Trends in Parasitology 17122-126，(2001]的精確作用模式仍有待于闡明。
惡性瘧原蟲對氯喹和可能其它喹啉的抗性似乎是由于藥物向食物泡運輸?shù)臏p少。藥物運輸?shù)娜毕菘赡苡赏贫ǖ穆揉剐赞D(zhuǎn)運蛋白基因(PFCRT)和P-糖蛋白編碼基因(Pfmdr1)的突變造成。盡管青蒿素轉(zhuǎn)運似乎受Pfmdr1基因突變的影響，但是還未觀察到針對青蒿素及其衍生物的臨床抗性。
D.抗葉酸物除氯喹外，最重要的抗瘧疾藥物是設(shè)計為抑制葉酸輔助因子合成的化合物，所述葉酸輔助因子對于核苷酸合成是必需的并參與氨基酸代謝。最普遍應(yīng)用的抗葉酸物是2，4-二氨基嘧啶、乙胺嘧啶、氯胍(氯胍或白樂君)及硫磺藥物周效磺胺、磺胺甲氧吡嗪或氨苯砜。乙胺嘧啶抑制以與胸苷酸合成酶(TS)的融合蛋白質(zhì)的形式存在于瘧原蟲中的二氫葉酸還原酶(DHFR)?；前匪幬镏苄Щ前芬种芼ihydroopteroate合酶(DHPS)——葉酸通路中的另一種酶。針對惡性瘧原蟲的抗葉酸治療的成功已歸因于宿主-寄生蟲的參與葉酸輔助因子合成的相應(yīng)酶的藥物結(jié)合的差異。乙胺嘧啶對瘧原蟲DHFR-TS比人類DHFR具有更高的親和力。然而，其它DHFR-TS抑制劑對于寄生蟲也是選擇毒性的，而不更強烈的地結(jié)合瘧原蟲酶。與哺乳動物細胞相比，寄生蟲對抗葉酸物提高的敏感性似乎至少部分是由于瘧疾寄生蟲和人類宿主間在DHFR翻譯的調(diào)節(jié)方面的差異[Zhang和Rathod，Science 296545-7，(2002)]。
當(dāng)抗葉酸藥物單獨使用時，由于靶酶中的突變，針對其效果的抗性快速發(fā)展，所述靶酶對于乙胺嘧啶指二氫葉酸還原酶(DHFR)，對于周效磺胺和相關(guān)硫磺藥物指dihydroopteroate(DHPS)。因此，抗葉酸物被聯(lián)合使用。將乙胺嘧啶與其它抗葉酸物化合物例如周效磺胺、磺胺甲氧吡嗪或氨苯砜以固定組合配制。已知商品名為Fansidar的乙胺嘧啶和周效磺胺的固定組合代表了瘧疾的最重要的抗葉酸物治療。將周效磺胺/乙胺嘧啶或磺胺甲氧吡嗪/乙胺嘧啶用于被認為是氯喹抗性的嚴(yán)重惡性瘧原蟲感染的治療。經(jīng)證明這些組合對于懷孕期間的間歇治療是有用的。對于硫磺成分偶然的超敏性可引起皮膚的疼痛起皰。該副作用阻礙了周效磺胺/乙胺嘧啶的預(yù)防用途。設(shè)計了兩種化合物的組合以降低抗性發(fā)展的風(fēng)險，所述兩種化合物相互獨立地對葉酸通路中兩種不同的酶起作用。然而，不幸地，由于廣泛的組合使用，出現(xiàn)了惡性瘧原蟲的株系。
新近已將抗葉酸物與通過與葉酸合成不相關(guān)的機制抵抗瘧疾寄生蟲的藥物組合在固定組合中。阿托代醌——最初開發(fā)用來抵抗AIDS病人中肺囊蟲感染的藥物，證明對瘧疾是有效的，大概通過干擾線粒體中的電子傳遞發(fā)揮效果。為抵消抗性的快速發(fā)展，將阿托代醌與氯胍(氯胍、白樂君)相組合。氯胍的抗瘧疾活性是由于其環(huán)狀三嗪代謝物環(huán)氯胍，其選擇性地抑制瘧原蟲雙功能二氫葉酸還原酶-胸苷酸合成酶(DHFR-TS)。由GlaxoSmithkline有限公司以商品名Malarone出售的阿托代醌-氯胍組合是安全且有效的新型抗瘧疾藥物。然而，由于其復(fù)雜合成，阿托代醌是昂貴的。制造商已為非洲發(fā)起了藥物捐贈計劃，但捐贈的治療數(shù)目對于其一線使用可能并不充足。
E.抗生素瘧原蟲和其他寄生蟲擁有稱為頂體(apicoplast)的質(zhì)體細胞器，其包含35kb的環(huán)狀DNA。質(zhì)體整合那些類似原核轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)的元件。此系統(tǒng)對已知為抑制細菌蛋白質(zhì)合成的化合物例如四環(huán)素、強力霉素和氯林肯霉素敏感，。由于它們緩慢的作用模式，這些抗生素主要與其他快速作用藥物聯(lián)合使用。四環(huán)素和強力霉素的使用限于8周歲以上的病人且在懷孕和哺乳婦女中禁用。這兩種抗生素與奎寧聯(lián)合使用。氯林肯霉素(7-氯-林肯霉素)，其是林肯霉素的半合成衍生物，于20世紀(jì)60年代引入作為抗生素。氯林肯霉素對于兒童和孕婦是安全的。可以利用氯林肯霉素的幾種一般的制劑。三天的療程花費高于周效磺胺/乙胺嘧啶但低于阿托夸酮-氯胍或鹵泛曲林。在幾個試驗中已將氯林肯霉素用于瘧疾的單治療中，但其在與快速作用藥物的組合中最有效[Lell和Kremsner，AntimicrobialAgents and Chemotherapy 463215-2320，(2002)]。
F.抑制瘧疾寄生蟲的肝內(nèi)發(fā)育的治療目前所用的抗瘧疾藥物中僅有少數(shù)針對肝細胞中瘧原蟲的發(fā)育起作用。這些藥物包括伯胺喹和抗葉酸物組合乙胺嘧啶/周效磺胺。雖然伯胺喹抗瘧原蟲的肝形式的作用機制是未知的，抗葉酸物組合可能抑制子孢子增殖所需的瘧原蟲DNA的合成。本發(fā)明提供了干擾瘧原蟲肝內(nèi)發(fā)育的新的藥物靶標(biāo)和藥物靶標(biāo)候選者。
II.目前在抗瘧疾藥物開發(fā)方面的努力A.藥物抗性逆轉(zhuǎn)劑抗瘧疾物的主要問題是藥物抗性瘧原蟲株系的產(chǎn)生。對藥物的抗性可通過將藥物與逆轉(zhuǎn)抗性的化合物聯(lián)合來抵消。在體外通過多種化合物降低惡性瘧原蟲對氯喹的抗性[Singh和Puri，Acta tropica 77185-193，(2000)]。然而，在小鼠模型中只有二苯環(huán)庚啶經(jīng)證明是對yoelii nigeriensis瘧原蟲的氯喹抗性系有效的，而其他如戊脈安和抗組胺氯苯那敏顯示出中等活性。氯苯那敏常常用于治療由氯喹引起的瘙癢癥。在臨床研究中，氯喹/氯苯那敏組合產(chǎn)生了比單獨氯喹更高的治療效率[Sowumi等人，Tropical Mecicine and International Health 3177-185，(1998)]，而在先前的研究中氯喹與去甲丙咪嗪的組合沒有臨床益處[Warsame等人，Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine Hygiene 86235-236，(1992)]。設(shè)計用來降低參與藥物運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)表達的反義寡核苷酸在公開于2002年8月27日的美國專利號6,440,660B1中有所描述。
B.新的抗瘧疾藥物組合防止抗性最重要的策略是使用藥物組合。如上面已經(jīng)提到的，過去通過利用固定組合例如乙胺嘧啶和sulfodoxine(Fansidar)或者阿托代醌和氯胍(Mlalarone)的組合，對此策略已有所應(yīng)用。新近，多種新策略得以實施且其它幾個正在研究中[綜述見最近的World Health Organization出版物(WHO/CDS/RBM/2001.35)]。喹啉化合物例如氯喹、氨酚喹、甲氟喹和奎寧與抗葉酸物組合周效磺胺/乙胺嘧啶進行組合?；谶@些化合物具有相加的抗瘧疾活性這一觀察，開發(fā)了甲氟喹與周效磺胺/乙胺嘧啶(Fansimef，Roche)的組合。然而，出乎意料地，使用此組合作為非并發(fā)瘧疾的一線治療導(dǎo)致了對甲氟喹抗性的快速發(fā)展。因此，沒有推薦將該組合用于預(yù)防或治療。將青蒿素與更長半衰期的藥物相組合以減少治療時間及增加依從性。認為寄生蟲對青蒿素的快速清除降低了產(chǎn)生針對伴侶藥物的抗性的機會?；谇噍锼氐慕M合包括青蒿酯加氯喹，或氨酚喹，或甲氟喹，或周效磺胺/乙胺嘧啶及蒿甲醚與苯芴醇(lumefantrine)的組合。已知以商品名Coartem and Riamet(Novartis)命名的后一組合可作為固定組合得到，且代表了目前可利用的最有希望的組合治療。該組合最近已通過管理機構(gòu)批準(zhǔn)。正在研究中的組合包括多種哌喹-dihydroartesmisinin-三甲氧芐二氨嘧啶(Artecom)、Artecom加伯胺喹(CV8)、青蒿酯加雙喹哌、磷酸萘酚喹(naphtoquine)加二氫青蒿素，以及chloroguanil-氨苯砜加artesinate(CDA或Lapdap plus)。抗生素四環(huán)素和強力霉素常常用于與奎寧的組合中，且氯林肯霉素與奎寧、氯喹相組合，及新近與新型抗瘧疾藥物膦胺霉素(fosmidomycin)相組合，膦胺霉素抑制1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP)還原異構(gòu)酶，其是類異戊二烯生物合成的非甲羥戊酸通路的關(guān)鍵酶。
C.新型抗瘧疾藥物由于藥物作用和藥物抗性潛在的機制得以闡明以及對瘧原蟲疾病所利用的生物化學(xué)通路的了解增加，目前可期望抗瘧疾藥物的開發(fā)比過去更快地前進。有關(guān)瘧原蟲中代謝通路的綜述可在因特網(wǎng)上獲得(http//sites.huii.ac.il/malaria/)。瘧原蟲基因組計劃的實施、改進的轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展及RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用加速了學(xué)習(xí)過程?？汞懠菜幬镩_發(fā)的新方法在最近的出版物中有所綜述[Winstanley，Parasitology Today 16146-153，(2000)；Antimalarial chemotherapy.Mechanisms of action，resistance，and new directions in drug discovery，Humana，Totowa，NewJersey，由P.Rosenthal編輯，(2001)；Ridley，Nature 415686-693(2002)；Robert和McConkey，Molecular & Biochemical Parasitology 119273-278(2002)])。為了將這些成果與作為本發(fā)明主題的策略相對比，在下面部分中提供了這些成果的簡短描述。
目前針對瘧疾治療的方法可分為三類已知藥物的改進類型、針對新鑒定靶標(biāo)的藥物、及具有未知或很不明確的靶標(biāo)的藥物。
1)已知藥物的改進類型氯喹仍是新型藥物開發(fā)的有吸引力的引導(dǎo)者。新的引導(dǎo)化合物的實例包括短鏈氯喹類似物(bisquionlines)、缺乏形成毒性代謝物能力的氨酚喹的類似物、及雙喹哌——最初由中國開發(fā)的4-氨基喹啉。大化合物文庫的高通量篩選已用于鑒定以與喹啉的結(jié)合相似的方式結(jié)合血紅素的新結(jié)構(gòu)。青蒿素相關(guān)的三噁烷在公開于2000年10月24日的美國專利6,136,847中有所描述。新型藥物候選物還包括針對乙胺嘧啶的靶標(biāo)DHFR的雙胍，和瘧原蟲中嘌呤和嘧啶代謝的其它抑制劑(公開于1997年9月2日的美國專利號5,663,155)。細胞色素c還原酶-阿托夸酮的靶標(biāo)的新型抑制劑包括β-甲氧基丙烯酸酯類。
2)針對新發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)的藥物2.1蛋白酶抑制劑。用于治療后生動物寄生蟲感染的蛋白酶抑制劑在公開于1998年4月14日的美國專利號5,739,170和公開于2001年2月27日的美國專利號6,194,421 B1中有所描述。
2.1.2參與血紅蛋白降解的蛋白酶。瘧原蟲的紅細胞形式在食物泡中降解高達80％的宿主細胞血紅蛋白。血紅蛋白在食物泡內(nèi)降解為肽，這些肽然后輸出到細胞質(zhì)，最終降解成氨基酸。參與血紅蛋白降解的酶包括天冬氨酸蛋白酶(plasmepsins)、半胱氨酸蛋白酶falcipain，一種金屬肽酶和其它肽酶。最知名的血紅蛋白降解蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶[Coombs等人，Trends in Parasitology 17532-7，(2001)]。以前已開發(fā)了抑制人類免疫缺陷性病毒(HIV)的天冬氨酸蛋白酶的催化活性的藥物，并已鑒定出抑制人類天冬氨酸蛋白酶例如腎素和來自多種致病微生物例如曲霉(Aspergillus)和假絲酵母(Candida)的天冬氨酸的引導(dǎo)者。瘧原蟲基因組的同源性搜索揭示了除兩種先前已知的plasmepsins I和II之外的8種plasmepsins。瘧原蟲plasmepsins的抑制劑在大量化合物中發(fā)現(xiàn)，所述化合物已經(jīng)合成用于篩選針對人類天冬氨酸蛋白酶的藥物。同源性建模揭示了半胱氨酸蛋白酶falcipain-2的抑制劑(乙烯基砜，isopuinolone)，其在體外抑制瘧疾寄生蟲的生長[Sabnis等人，J.Biomol.Struct.Dyn.19，765-74，(2002)]。難題是發(fā)現(xiàn)對瘧原蟲酶有活性但對同源的人類蛋白酶無活性或活性程度低得多的抑制劑。
2.1.3.涉及紅細胞侵入的蛋白酶。裂殖子進入紅細胞需要寄生蟲和紅細胞表面的幾種蛋白質(zhì)的蛋白酶剪切。已研究了裂殖子表達的兩種蛋白酶惡性瘧原蟲枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶-1和-2(PfSUB-1和PfSUB-2)。這些和幾種其它的蛋白酶潛在的藥物靶標(biāo)[Blackman，Curr.Drug Targets 159-83，(2000)]。
2.2.脂肪酸合成。脂肪酸的合成利用2-碳供體丙二酰輔酶A(CoA)以?；湹姆磸?fù)延長的方式出現(xiàn)。細菌中該通路(稱為II類通路)包括幾種脂肪酸合成酶(FAS)。動物中該通路(稱為I類通路)由一種大的多功能蛋白質(zhì)催化。用于從頭脂肪酸合成的II類通路不僅存在于細菌中，還存在于植物中以及某些寄生蟲包括瘧原蟲的頂體中。瘧原蟲II類通路包括?；d體蛋白質(zhì)(ACP)、β-酮脂酰-ACP-合成酶III(FabH)和I/II(FabB/F)、及烯酰-ACP還原酶(FabI)。抗生素三氯生和硫乳霉素及其衍生物是抑制脂肪酸合成的新抗瘧疾藥物研究中的引導(dǎo)化合物[Waller等人，Antimicrobial Agents and chemotherapy 47297-301，(2003)；Prigge等人，Biochemistry 421160-69，(2003)]。
2.3.類異戊二烯合成的非甲羥戊酸通路。雖然類異戊二烯在人類中經(jīng)甲羥戊酸通路合成，在瘧原蟲中它們通過非甲羥戊酸通路也稱為MEP通路而合成。該通路已知在某些細菌和植物中起作用。在瘧原蟲中它包括由頂體中的環(huán)狀DNA編碼的酶。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸[DOXP]還原異構(gòu)酶——非甲羥戊酸通路的關(guān)鍵酶受膦胺霉素抑制。該抗生素最初分離自淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae)。膦胺霉素在體外和鼠瘧疾中具有強烈抗瘧疾活性。最初的臨床試驗表明此藥是良好耐受的。然而，不幸地，此藥導(dǎo)致抗性的快速產(chǎn)生。因此它必須用于與其它藥物的組合中。臨床前研究表明膦胺霉素與林肯霉素和氯林肯霉素的組合可能是有用的。
2.4蛋白質(zhì)異戊烯轉(zhuǎn)移酶。多種蛋白質(zhì)包括小G蛋白質(zhì)，例如Ras、Rac、Rap、Rho、Rab、異三聚體G蛋白質(zhì)γ-亞基、核內(nèi)核纖層蛋白、蛋白質(zhì)激酶和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶在翻譯后用法呢基(C15)或忙牛兒基忙牛兒基(C20)在羧基末端得以異戊二烯化。法呢基或忙牛兒基忙牛兒基的連接由異戊烯轉(zhuǎn)移酶來催化。這些酶的抑制劑是廣泛研究的抗癌藥物候選物。已鑒定了惡性瘧原蟲中的兩種異戊烯轉(zhuǎn)移酶，PET和PGGT-1。幾種模擬肽和單萜、檸檬烯抑制異戊二烯化和寄生蟲生長[Chakrabarti等人，J.Biol.Chem.27742066-73，(2002)]。法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(phosphosequiterpene)在公開于2002年8月2日的美國專利6,429,203中有所描述。
2.5.乳酸脫氫酶(LDH)。瘧原蟲LDH(pLDH)對于瘧原蟲的性階段和無性階段的ATP的厭氧產(chǎn)生是必需的。發(fā)現(xiàn)pLDH的不同異構(gòu)體存在于不同的瘧原蟲種類中。將它們的檢測用作診斷測試和用于監(jiān)測藥物的抗瘧疾功效。由于與人類LDH的結(jié)構(gòu)差異，認為pLDH是有前景的藥物靶標(biāo)[Dunn等人，Nat.Struct.Biol.3912-5，(1996)]。
2.6.磷脂生物合成抑制劑。紅細胞瘧原蟲的發(fā)育和增殖需要大量磷脂。磷脂酰膽堿(PC)——存在于受感染的紅細胞中的主要磷脂——主要通過寄生蟲的酶從血漿來源的膽堿合成而來。大量膽堿樣的化合物已得以合成且一些具有抗瘧疾活性。引導(dǎo)化合物G25及其類似物、VB5-T、VB5-T在對哺乳動物細胞系無毒性的濃度下在體外抑制惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲的生長。非常低劑量的G25治療治愈了由惡性瘧原蟲和食蟹猴瘧原蟲(P.cynomolgi)感染的猴子。這些基于膽堿的藥物似乎干擾膽堿吸收因而干擾PC合成[Wengelnik等人，Science 2951311-14，(2002)]。
2.7.糖基磷脂酰肌醇(GPI)合成。GPIs在真核細胞中是普遍存在的。它們通過糖基轉(zhuǎn)移酶的作用通過向磷脂酰肌醇(PI)的連續(xù)添加糖殘基在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中合成。成熟的GPI移位穿過膜，從胞質(zhì)進入ER的腔面。合成完成后，GPI糖脂輸出至細胞表面，游離或與蛋白質(zhì)共價結(jié)合。GPIs是瘧原蟲以及其它寄生蟲重要的炎癥誘導(dǎo)化合物。兩種GPI錨定蛋白質(zhì)環(huán)子孢子蛋白質(zhì)(CS)及裂殖子表面蛋白質(zhì)MSP-1和MSP-2以及GPI本身是疫苗候選物。由于瘧原蟲的GPIs和由哺乳動物合成的GPIs之間存在差異，瘧原蟲中GPIs的合成是具有吸引力的藥物靶標(biāo)[Delorenzi等人，Infection and Immunity 704510-4522，(2002)]。
在布魯斯錐蟲(Trypanosoma brucei)中已獲得了對于此方法原理的證據(jù)通過破壞PIG-B基因阻斷GPI合成使布魯斯錐蟲的血液階段無法生存。
2.8.蛋白質(zhì)激酶。瘧原蟲蛋白質(zhì)激酶可分為幾個組和家族[Kappes等人，Parasitology Today 15449-454(1999)]。這些激酶的大多數(shù)在氨基酸水平上顯示出與其哺乳動物的對應(yīng)激酶的40至60％同源性。對于藥物開發(fā)尤其重要的是經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在于植物和一些原生動物種類中但不存在于哺乳動中的鈣依賴性蛋白質(zhì)激酶(CDPKs)以及在催化結(jié)構(gòu)域中具有大的插入的幾種激酶，例如PfPK1、PfPK4和FEST。Pfnek-1是這一類中潛在的藥物靶標(biāo)的一個實例。它顯示出與涉及真核細胞分裂的蛋白質(zhì)激酶的從未存在于有絲分裂/曲霉菌(NIMA)/NIMA樣激酶(Nek)家族的同源性。與其它惡性瘧原蟲蛋白質(zhì)激酶和NIMA/Nek家族相似，Pfnek-1除了催化結(jié)構(gòu)域還具有大的C末端延長。其底物之一是Pfmap-2——非典型的惡性瘧原蟲MAPK同源物。細菌表達的重組Pfnek-1蛋白質(zhì)可用于抑制試驗中篩選抑制劑[Dorin等人，Eur J Biochem 2682600-8，(2001)]。在瘧原蟲中還未發(fā)現(xiàn)與已知的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶具有同源性的蛋白質(zhì)，盡管已報道發(fā)生蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化。
2.9.多胺。像所有真核生物一樣，瘧原蟲包含三種多胺二胺腐胺和其衍生物、亞精胺和精胺?；衔镌诩毎鲋澈头只芯哂卸嘈怨δ?。干擾多胺功能的策略包括對多胺合成、多胺反轉(zhuǎn)變(back conversion)和多胺運輸?shù)囊种?，或通過結(jié)構(gòu)類似物使多胺代謝失調(diào)。多胺合成抑制劑與多胺結(jié)構(gòu)類似物的組合用于瘧疾和由其它致病原生生物引起的疾病的治療正在研究中。此方法受益于在新型抗癌藥物研究中產(chǎn)生的大型化合物文庫[Muller等人，Trends in Parasitology 17242-9，(2001)]。
2.10.組蛋白脫乙酰酶組蛋白是經(jīng)特定賴氨酸殘基的連續(xù)乙?；?脫乙酰化參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的核蛋白質(zhì)。在惡性瘧原蟲中，組蛋白是豐富的且至少已鑒定了一種組蛋白脫乙酰酶。Apicidin——分離一種鐮孢霉(Fusarium)的環(huán)狀四肽——可能通過干擾連續(xù)的乙酰化/脫乙?；倪^程抑制哺乳動物細胞增殖和Apicomplexan寄生蟲包括瘧原蟲物種的體外發(fā)育[Darkin-Rattray等人，Proc Natl Acad Sci USA 9313143-7，(1996)]。該發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致對瘧原蟲選擇性組蛋白脫乙酰酶抑制劑的探求。引導(dǎo)化合物包括制滴菌素A(TSA)、正-丁酸鈉、六亞甲基雙乙酰胺(HBMA)和新近開發(fā)的HMBA類似物例如壬二酸二異羥肟酸(ABHA)和辛二酸雙二甲基酰胺[Andrews等人，International Journal For Parasitology 30761-768，(2000)]。
2.11.莽草酸通路。莽草酸通路存在于原核生物、真菌及植物和藻類的質(zhì)體中，但不存在于脊椎動物中。此通路產(chǎn)生分枝酸——對氨基苯甲酸(PABA)和葉酸合成的必需底物。它也是泛醌、芳香族氨基酸和幾乎所有其它芳香族化合物合成所需的。哺乳動物沒有莽草酸通路，依賴外源葉酸。利用最近開發(fā)的RNA干擾技術(shù)已將分枝酸合成酶(CS)確認為有用的藥物靶標(biāo)[Robert和McConkey，Molecular & Biochemical Parasitology119273-278(2002)]。已獲得了抑制該通路的藥物的引導(dǎo)者。除草劑草甘膦(通過其RoundUp、Zero或Tumbleweed的商品名更為知名)是5-enopyruvyl莽草酸-3-磷酸合成酶的抑制劑，其抑制瘧原蟲在體外的生長。
2.12.親環(huán)蛋白。親環(huán)蛋白存在于所有活的生物體中。人親環(huán)蛋白A(hCyPA)最初鑒定為免疫抑制藥物環(huán)孢菌素A(CSA)的胞質(zhì)靶標(biāo)。用CSA抑制小鼠免疫性的嘗試揭示了CSA抑制嚙齒類動物瘧疾生長這一意外事實。CSA和幾種非免疫抑制性CSA類似物隨后已顯示在體外具有抗瘧疾活性。早期紅細胞環(huán)形期寄生蟲顯得尤其敏感。在三種克隆的瘧原蟲親環(huán)蛋白之一中，PfCyP19是人CypA的最近的同系物。像其它親環(huán)蛋白一樣，PfCyP19具有肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase或旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶)活性。它以高親和力結(jié)合CSA。其抑制寄生蟲生長的能力似乎并不與旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶活性的抑制有關(guān)，而是與PfCyP19-CSA復(fù)合體對未鑒定的靶標(biāo)蛋白質(zhì)的抑制有關(guān)。
2.13.運送系統(tǒng)。紅細胞的寄生蟲侵入與在未感染的紅細胞中未發(fā)現(xiàn)的紅細胞膜運送系統(tǒng)中的變化和新的滲透通路(NPP)的出現(xiàn)有關(guān)[由Kirk，Physiological Reviews 81495-537，(2001)綜述]。寄生蟲和/或紅細胞衍生的轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)定位于泡膜和寄生蟲表面。寄生蟲表面的一些轉(zhuǎn)運蛋白例如ATP/ADP交換子、V-型H1-ATP酶、H1-PPase通常發(fā)現(xiàn)于胞內(nèi)細胞器的膜上。轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)對于瘧疾化學(xué)療法的新方法是重要的。一方面，可設(shè)計阻斷寄生蟲營養(yǎng)攝取的藥物。另一方面可將運送系統(tǒng)作為細胞毒性劑靶向胞內(nèi)寄生蟲的途徑。正在研究中的藥物靶標(biāo)候選物包括定位于受感染的紅細胞表面的電壓依賴性通道，其在營養(yǎng)攝取中發(fā)揮作用[Desai等人，Nature406949-51，(2000)]、參與δ-氨基乙酰丙酸脫水酶(ALAD)和可能由瘧原蟲用于血紅素合成的其它宿主酶的攝取的蛋白質(zhì)[Bonday等人，NatureMedicine 6898-903，(2000)]，以及定位于受感染的紅細胞內(nèi)部寄生蟲質(zhì)膜的寄生蟲編碼的己糖轉(zhuǎn)運蛋白[Woodrow等人，J.Biol.Chem.2747272-7，(1999)]。
3.作用機制不清楚的抗瘧疾藥物3.1色胺酮。在其于1963年合成后，吲哚并[2，1-b]-喹唑啉-6，12-二酮(色胺酮)從菘藍(Isatis tinctoria)中得以分離，菘藍是一種古老的歐洲和中國的染料植物和藥草。該化合物可容易地合成，且由解脂假絲酵母(Candida lipolytica)在包含過量的色氨酸和鄰氨基苯甲酸的培養(yǎng)基中生長時產(chǎn)生，因而名為色胺酮。色胺酮對多種微生物有活性，尤其是胞內(nèi)微生物，例如分枝桿菌(mycobacteria)、多氏利什曼蟲(Leishmaniadonovani)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)和瘧原蟲[Bhattacharjee等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry 101979-1989，(2002)；Scovill等人，Antimicrobial Agents And Chemotherapy 46882-883，(2002)]。該化合物是芳基氫受體的激動劑，誘導(dǎo)細胞色素P4501A1在肝細胞中的表達[Schrenk等人，Biochem.Pharmacol.54165-71，(1997)]并抑制環(huán)加氧酶-2及5-脂肪加氧酶[Danz等人，Planta Med.68152-7，(2002)]。針對胞內(nèi)微生物的作用機制還是未知。為獲得針對瘧疾寄生蟲的最佳活性而開發(fā)的系列衍生物在公開于2001年9月4日的美國專利號US6284772中有所描述。
3.2.常山堿。20世紀(jì)40年代末和50年代初，在黃常山(Dichroafebrifuga)或傘形繡球(Hydrangea umbellate)的提取物中發(fā)現(xiàn)了常山堿和異常山堿作為抗瘧疾活性劑。盡管常山堿顯示出與氯喹的結(jié)構(gòu)類似性[Chang，J.Theor.Biol.59497-501，1976]]，但是其抗瘧疾活性似乎并不與血紅蛋白降解有關(guān)。該化合物提高了一氧化氮產(chǎn)生——一種抗瘧原蟲作用的可能模式[Murata等人，Biochemical Pharmacology 581593-1601，(1999)]。常山堿合成及其抗瘧疾活性在美國專利號6,420,372B1中有所描述。
3.3.雜合肽。由天然存在的環(huán)肽例如殺菌肽、天蠶抗菌肽、爪蟾抗菌肽、sacrotoxin、sapecin、牛白細胞抗菌肽、alamethidicin、防衛(wèi)素和PGLA2與毒素例如鏈球菌溶血素、蜂毒肽、barbatolysin、paradaxin和δ溶血素組成的肽在公開于1998年2月3日的美國專利5,714,467中作為抗瘧疾化合物有所描述。
III.細胞因子的抗瘧疾效應(yīng)白細胞介素-1(IL-1)抑制獼猴中惡性瘧原蟲子孢子的肝內(nèi)發(fā)育，但只是當(dāng)子孢子接種前應(yīng)用有效[Maheshwari，Bull.World Health Organ.68138-44，1990]]。IL-1的保護效應(yīng)可能由于其能夠誘導(dǎo)急性期蛋白質(zhì)例如IL-6[Vreden等人，Eur.J.Immunol.222271-5，(1992)]或c-反應(yīng)性蛋白質(zhì)(CRP)。CRP可能經(jīng)磷酸膽堿結(jié)合位點結(jié)合到惡性瘧原蟲和約氏瘧原蟲的子孢子上，并因而抑制體外和體內(nèi)肝細胞的感染。松節(jié)油的注入也誘導(dǎo)CRP產(chǎn)生并保護大鼠免受瘧原蟲感染。此保護效應(yīng)可通過松節(jié)油注射過的大鼠的血清轉(zhuǎn)移并且此保護可通過抗-CRP的抗體消除[J.Immunol 1394192，(1987)]。γ干擾素(IFN-γ)似乎干擾肝細胞內(nèi)部瘧原蟲的紅細胞外型(EEFs)的發(fā)育[J.Immunol 1384447]。在低劑量下IFN-γ在體外[J.Immunol 1392020，(1987)]和體內(nèi)[Ferreira等人，Science 232881-884，(1986)；Masheshwari等人，Inf.Immunity 53628-630，1986]]抑制肝細胞內(nèi)部EEF的發(fā)育。在第-2、0和+2天給予的五個劑量的人IFN-γ保護了獼猴免受食蟹猴虐原蟲子孢子在第0天的感染。未觀察到針對營養(yǎng)子誘導(dǎo)的感染的保護[Maheshwari，Bull.World Health Organ.68138-44，1990]]。IFN-γ對于瘧疾治療的用途在公開于1993年12月14日的美國專利號5,270,037和公開于1990年4月10的美國專利號4,915,941中有所描述。腫瘤壞死因子(TNF)施用未能保護免受文氏瘧原蟲(P.vinckei)的感染[Acta Tropica 45289，(1988)]，但通過微型泵長時間施用減少了用來自查氏瘧原蟲(P.chabaudi)的子孢子感染后的寄生蟲血癥[J.Immunol.1393493，1987)]。
IV.瘧疾疫苗對抗瘧疾的另一重要策略是接種疫苗。通過用減毒的微生物或非致病性成分免疫接種進行的保護性免疫的誘導(dǎo)是醫(yī)學(xué)上的的巨大成功。接種疫苗實際上已經(jīng)消除了來自幾種急性傳染病的發(fā)病和死亡。不幸地，接種疫苗在預(yù)防慢性感染例如肺結(jié)核和瘧疾中較少成功。在20世紀(jì)下半期已大力開發(fā)針對惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲的三個主要發(fā)育階段的疫苗。針對紅細胞前期的疫苗目的在于防止感染進入人類宿主的血液。針對無性血液期寄生蟲的疫苗目的在于一旦感染已經(jīng)進入血液就對抗這些疾病引起期。針對血液和蚊中腸中寄生蟲有性階段的疫苗目的在于預(yù)防寄生蟲感染蚊載體并因而切斷瘧疾在人類和蚊種群中的傳播。目前，多成分疫苗正在開發(fā)中。這些疫苗旨在誘導(dǎo)針對瘧原蟲發(fā)育的不同階段表達的多種抗原的體液和細胞介導(dǎo)的免疫[最近的實例見Kumar等人，Trends in Parasitology 18129(2002)]。過去所測試的疫苗中沒有一個已證明是有效的。
V.靶定宿主成分疫苗和大多數(shù)抗瘧疾藥物的靶標(biāo)是寄生蟲的成分。這些靶標(biāo)中的許多涉及對寄生蟲存活和生長所必需的宿主寄生蟲相互作用和/或涉及由感染引起的病理。目前策略可能的備選策略是調(diào)節(jié)已知與寄生蟲產(chǎn)生的分子相互作用的宿主成分。乍看起來此策略是違反直覺的。事實上，傳統(tǒng)的抗微生物化學(xué)療法的重要要求是不干擾宿主的功能。然而，宿主成分的靶定具有藥物靶標(biāo)的變化不會引起藥物抗性的優(yōu)勢。兩類重要的抗瘧疾藥物喹啉和青蒿素是非常好的，因為它們靶定宿主的成分血紅素。針對喹啉的抗性發(fā)展很慢，因為它需要選擇影響藥物轉(zhuǎn)運的變種。如果靶定的宿主成分保持在微生物的外面，抗性甚至更少可能發(fā)生。在瘧疾的嚙齒動物模型中，可通過阻斷肝細胞或紅細胞表面的宿主細胞蛋白質(zhì)，以及通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑預(yù)防或減輕疾病(見下面)。這些發(fā)現(xiàn)有助于對疾病發(fā)病機理的了解和疫苗的設(shè)計，但未能促進任何抗瘧疾藥物開發(fā)的計劃。本發(fā)明涉及宿主產(chǎn)生的并且瘧疾寄生蟲形成感染所需的蛋白質(zhì)。該宿主蛋白質(zhì)不是包圍在寄生蟲膜的內(nèi)部。它是稱為Met的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，其用作稱為肝細胞生長因子的另一種宿主蛋白質(zhì)的受體。
也將可以理解，可用在體內(nèi)改變?yōu)榭汞懠不钚詣┑幕衔镆约霸隗w內(nèi)產(chǎn)生與抗瘧疾活性劑所產(chǎn)生的代謝物類似的代謝物的化合物來實施本發(fā)明的方法。
一種或多種抗瘧疾藥物的組合可用于實施本發(fā)明的方法。因而，例如，HGF活性的抑制劑可與其它抗瘧疾藥物例如氯喹一起或與抗瘧疾藥物組合例如周效磺胺/乙胺嘧啶一起使用?？汞懠菜幬锟梢杂坞x堿的形式或藥學(xué)上可接受的加酸鹽的形式使用。適合的鹽的實例是氯化物、鹽酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽和二磷酸鹽。其它水溶性的、無毒的、無機的或有機的鹽也可使用。
實施本發(fā)明的方法中，通過經(jīng)口途徑將抗瘧疾活性劑施用于人類宿主，因為其作用方式主要是在肝臟中。為了經(jīng)口施用，本發(fā)明的抗瘧疾活性劑可制備成固體形式，例如，膠囊劑、片劑、丸劑、粉劑、錠劑和顆粒劑，或者包含通常用于本領(lǐng)域的惰性稀釋劑(例如水)的液體形式，例如，乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。也可使用其它的施用方式。
本發(fā)明方法中以充足的量使用抗瘧疾活性劑從而提供足夠濃度的活性劑以預(yù)防或至少抑制瘧疾載體在體內(nèi)的感染，或者預(yù)防或至少抑制瘧疾在體內(nèi)的傳播?；钚詣┑牧繌亩蕾囉谌祟愃拗鞯奈?、分配和清除。當(dāng)然，抗瘧疾活性劑的效果是劑量相關(guān)的?？汞懠不钚詣┑膭┝繎?yīng)該足夠產(chǎn)生最小的可檢測的效果，但該劑量應(yīng)至少低于所確定的致死劑量的10倍。施用于宿主的抗瘧疾活性劑的劑量可在寬限制范圍內(nèi)變動。可以在治療上是有效的最小量施用活性劑，且該劑量可根據(jù)需要提高到病人所能承受的最大劑量?？汞懠不钚詣┛梢韵鄬Ω叩呢摵蓜┝渴┯茫S后是較低的維持劑量，或者可以以統(tǒng)一劑量施用。
施用的劑量和頻率將隨本發(fā)明方法中所使用的抗瘧疾活性劑而改變。例如，染料木黃酮可通過經(jīng)口途徑以每天5mg至每天約5000mg，優(yōu)選地每天約50mg至每天約500mg的量使用。通常，劑量不超過每天約500mg，且最通常不超過每天約50mg。對平均大小的成人指定抗瘧疾活性劑的劑量。因此，可以理解對于具有較輕或較重體形的病人該劑量可調(diào)整20-25％。類似地，對于兒童的劑量可利用眾所周知的計算公式來調(diào)整。
與HGF活性抑制劑相組合以形成本發(fā)明的抗瘧疾活性劑所用的抗瘧疾藥物的量通常不超過所發(fā)現(xiàn)的對瘧疾治療安全和有效的量。因此，作為實例，二磷酸伯胺喹可以以包含5mg-7.5mg的藥物的片劑形式，以每天2-3片的速率經(jīng)口施用。伯胺喹對于成人的劑量是經(jīng)口大約15mg/天的堿(26mg/天的鹽)或者經(jīng)口大約45mg/周的堿(79mg/周的鹽)。對于兒童劑量是經(jīng)口每天約0.3mg/kg的堿(每天0.5mg/kg的鹽)或者經(jīng)口大約每周0.9mg/kg的堿(每周1.5mg/kg的鹽)。
利用標(biāo)準(zhǔn)的體外試驗，闡明了本發(fā)明的抗瘧疾活性劑在預(yù)防和抑制細胞感染中的效果。因此，抗瘧疾活性劑對瘧疾感染或復(fù)制的抑制效果可通過將瘧疾子孢子加入含有或不含抗瘧疾活性劑的肝細胞培養(yǎng)物中并而后通過標(biāo)準(zhǔn)方法測試肝細胞內(nèi)子孢子的增殖來證明。抗瘧疾活性劑在預(yù)防或抑制瘧疾感染或復(fù)制的中的效果可在瘧疾感染的哺乳動物模型中在體內(nèi)得以證實。進行這些試驗所需的瘧疾可利用常規(guī)技術(shù)從常規(guī)來源獲得。
抗瘧疾活性劑及其藥學(xué)上可接受的鹽可用于哺乳動物，包括但不限于人類，以丸劑、片劑、錠劑、含錠(troche)、膠囊劑、栓劑、可注射的或可吸收的溶液劑等等形式的預(yù)防或治療。
為制備用于哺乳動物中病理狀況的藥物組合物，可將適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體、稀釋劑、佐劑與此處所述的抗瘧疾活性劑相結(jié)合。本發(fā)明的藥物組合物包含活性劑和固體或液體的藥學(xué)上可接受的無毒載體。這類藥物載體可為無菌液體，例如水和油，包括石油、動物、蔬菜或合成來源的油。合適的液體的實例有花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。當(dāng)靜脈內(nèi)施用藥物組合物時，水是優(yōu)選的載體。生理鹽水溶液和水性葡萄糖及甘油溶液也可用作液體載體，特別是用于可注射的溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、面粉、白堊、硅膠、碳酸鎂、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、一硬脂酸甘油酯(glycerol monstearate)、滑石、氯化鈉、脫脂奶、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。這些組合物可采取溶液劑、混懸劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、緩釋制劑等等。合適的藥物載體由E.W.Martin在″Remington′s Pharmaceutical Sciences″中有所描述。該藥物組合物包含有效治療量的活性劑和合適量的載體以便提供正確施用于宿主的形式。
總之，該抗瘧疾活性劑可用作預(yù)防人類瘧疾感染活性劑。它顯示出抗瘧疾載體的活性，這是非常不尋常的和意外的。所述抗瘧疾活性劑顯示了對肝細胞培養(yǎng)物和注射了瘧疾子孢子的小鼠肝臟中的瘧疾子孢子增殖的顯著抑制。抗瘧疾活性劑可降低人類中死亡率和發(fā)病率現(xiàn)象，尤其通過降低感染的發(fā)生實現(xiàn)死亡率和發(fā)病率的降低。
權(quán)利要求
1.預(yù)防或抑制體內(nèi)瘧疾活性的方法，其中該方法包括將抗瘧疾活性劑以足以預(yù)防或抑制瘧疾寄生蟲對人的感染或者預(yù)防或抑制瘧疾在體內(nèi)傳播的量施用于需要其的人。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將抗瘧疾活性劑以與藥學(xué)上可接受的載體的混合物施用于人。
3.人的治療，其預(yù)防對人類致病的瘧原蟲株系感染的形成，其中此類瘧原蟲株系是惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲。
4.權(quán)利要求3的治療，其中所述治療包含干擾蛋白質(zhì)酪氨酸激酶Met激活的分子，所述激活由瘧原蟲穿過肝細胞引起。
5.權(quán)利要求4的分子，其中所述分子干擾HGF的激活。
6.權(quán)利要求4的分子，其中所述分子隔離HGF并因此阻止其對Met的結(jié)合。
7.權(quán)利要求4的分子，其中所述分子是Met拮抗物。
8.權(quán)利要求7的分子，其中所述分子是針對Met的抗體或此類抗體的片段。
9.權(quán)利要求7的分子，其中所述分子是寡核苷酸(適體)。
10.權(quán)利要求7的分子，其中所述分子是結(jié)合但不激活Met的HGF變體。
11.權(quán)利要求10的分子，其中所述分子是NK4蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求5的分子，其中所述分子是小分子量的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑。
13.權(quán)利要求11的分子，其中所述分子是染料木黃酮。
14.權(quán)利要求12的分子，其中所述分子是選擇性Met拮抗物。
15.用于預(yù)防或抑制體內(nèi)瘧疾活性的方法，其中該方法包括將抗瘧疾活性劑以足以預(yù)防或抑制瘧疾寄生蟲對人的感染或者預(yù)防或抑制瘧疾在體內(nèi)傳播的量施用于需要其的人。
16.用于預(yù)防或抑制體內(nèi)瘧疾活性的方法，其中該方法包括將抗瘧疾活性劑以足以預(yù)防或抑制瘧疾寄生蟲對人的感染或者預(yù)防或抑制瘧疾在體內(nèi)傳播的量施用于需要其的人。
全文摘要
提供了預(yù)防瘧原蟲寄生蟲對人類感染的方法。所述方法為應(yīng)用干擾間日瘧原蟲對肝細胞感染的化合物。
文檔編號A61P33/02GK1809382SQ200480011978
公開日2006年7月26日 申請日期2004年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月12日
發(fā)明者M·M·莫塔, A·羅德里格茨, S·焦?fàn)栠_諾, M·C·羅德里格斯 申請人:西恩卡古爾班基安研究所