來自惡性瘧原蟲的p47(pfs47)或來自間日瘧原蟲的p47(pvs47)作為疫苗或藥物篩選靶標 ...的制作方法
【專利說明】來自惡性瘧原蟲的P47(PFS47)或來自間日瘧原蟲的 P47(PVS47)作為疫苗或藥物篩選靶標用于抑制人瘧疾傳 播的用途
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求享有2012年8月17日提交的美國臨時申請?zhí)?1/684, 333的優(yōu)先權(quán) 權(quán)益，其所有內(nèi)容在此完整引入作為參考。
技術領域
[0003] 本發(fā)明包括用于遞送瘧原蟲P47疫苗或P47抗體以預防惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum)或間日皰原蟲（Plasmodium vivax)皰疾的方法和組合物。P47疫苗、抗體疫 苗或藥物阻斷或減少寄生蟲在按蚊中的傳播，從而使主要導致瘧疾流行的媒介失效。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 人類瘧疾由瘧原蟲寄生蟲造成。根據(jù)疾控中心，瘧疾是世界范圍內(nèi)最嚴重的公共 衛(wèi)生問題之一。在許多發(fā)展中國家，它是死亡和疾病的主要原因，主要影響幼兒和孕婦。超 過30億人（世界人口的一半）生活在具有瘧疾傳播風險的區(qū)域，分布于109個國家和地區(qū)。 35個國家（30個位于撒哈拉以南非洲，5個位于亞洲）占據(jù)全球瘧疾死亡數(shù)的98%。世界 衛(wèi)生組織（WHO)估計在2008年，瘧疾造成1. 90-3. 11億臨床發(fā)作和708, 000-1，003, 000例 死亡。世界范圍內(nèi)89%的瘧疾死亡發(fā)生在非洲。瘧疾是世界范圍內(nèi)傳染性疾病的第五大流 行的死因（排在呼吸道感染、HIV/AIDS、痢疾疾病和結(jié)核之后）。在非洲，瘧疾是傳染性疾 病的第二主要死因，排在HIV/AIDS之后。
[0006] 在撒哈拉以南非洲的大量區(qū)域，蚊子閃比亞按蚊（Anopheles gambiae)是惡性皰 原蟲瘧疾的主要媒介。當蚊子從被感染的人吸取血液時，它就被感染，并且寄生蟲需要在蚊 子中經(jīng)歷復雜的發(fā)育周期以傳播至其他人。來自動物模型的研宄表明，蚊子通過建立免疫 應答（其能夠大大限制瘧原蟲存活）能夠自我防護。因此，還不清楚為什么疾病傳播在高 度流行區(qū)域如此有效。在世界上已經(jīng)消滅瘧疾的所有區(qū)域中，這是通過控制蚊子媒介的群 體實現(xiàn)的，并且降低疾病傳播率被認為是消滅流行區(qū)域瘧疾的關鍵步驟。
[0007] 目前，沒有FDA批準的用于瘧疾的疫苗，并且對現(xiàn)有抗瘧疾藥物的抗性也在增加。 現(xiàn)有的用于瘧疾傳染的療法包括氯喹、硫酸奎寧、羥氯奎、甲氟喹、強力霉素和青蒿素。氯喹 抗性是公知的；已經(jīng)報道了對青蒿素的抗性。傳播阻斷疫苗將降低疾病載荷，從而提高現(xiàn)有 療法的有效性。
[0008] 已經(jīng)和正在惡性瘧原蟲配子表面蛋白領域進行研宄，目標通常是為了鑒定瘧疾疫 苗候選物。在其生命周期中，惡性瘧原蟲在蚊子和人宿主之間交替。當被感染的蚊子吸取 血餐時，寄生蟲子孢子感染人宿主的肝，增殖并定殖于紅細胞（RBC)，在那里它們繼續(xù)增殖 并且其中一些發(fā)育為配子母細胞。當蚊子下一次血餐吸取到RBC時，配子母細胞作為配子 離開RBC進入蚊子中腸。接著發(fā)生受精以形成合子，其及時發(fā)育為能動的動合子。動合子 轉(zhuǎn)化為卵囊，該階段寄生蟲增殖并釋放數(shù)以千計的子孢子，其迀移到蚊子唾液腺，當被感染 的蚊子吸取血餐時將感染新的人。
[0009] 性階段特異性的表面抗原是疫苗候選物的目標，因為破壞這些抗原將降低生育 力，從而降低寄生蟲的感染性。在Eksi, S.等人（2006)Molec. Microbiol. 61 (4) :991-998 中，發(fā)現(xiàn)在雄配子表面找到的Pfs230抗原具有性階段同源物Pfs48/45和Pfs47。關注到 Pfs230是一種重要的疫苗候選物，因為其在RBC相互作用和卵囊產(chǎn)生中起作用。測定Pfs47 作為Pf s48/45的結(jié)構(gòu)模擬物與完整Pf s230 Λ 1大配子表面的反應性。在GerIoff，DL等人 (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. 102 (38) : 13598-13603 中，Pfs230 被鑒定為瘧原蟲 10 成員家 族的最大蛋白，其特征在于富含半胱氨酸的雙結(jié)構(gòu)域，每一半具有1-3個二硫鍵。由于它們 在配子上的表面定位，Pfs230、Pfs 48/45、Pfs4等等被描述為潛在的傳播阻斷疫苗。
[0010] 在 Anthony, TG 等人（2007)Mol. Biochem. Parasitol. 156(2) :117-23 中，觀 察到Pf s47和fs48/45的序列非同義多態(tài)性，表明對生育力具有功能重要性。在van Schai jk, BCL 等人（2006)Molec.Biochem.Parasitologyl49(2) :216-222 中，討論了 Pfs48/45和Pfs230作為候選疫苗的重要性，因為它們定位于配子表面。同源物Pfs47,盡 管在雌配子上表達，根據(jù)敲除和單克隆抗體實驗，顯示對生育力來說不重要。具體來說，當 向包含野生型寄生蟲的血餐中添加抗Pfs47的3種單克隆抗體時，它們不能抑制斯氏按蚊 (Anopheles Stephens)的感染。作者總結(jié)得出，Pfs47不可能是疫苗候選物。
[0011] 還進行研宄以確定一些瘧原蟲寄生蟲逃避蚊子免疫系統(tǒng)的機制。已經(jīng)報道稱對一 些惡性瘧原蟲品系感染抗性的蚊子可以黑化（melanize)其他品系。具體來說，閃比亞按蚊 L3-5抗性品系黑化巴西惡性瘧原蟲7G8品系，但不黑化非洲惡性瘧原蟲3D7、NF54和GB4 株。對寄生蟲感染相同抗性品系能力的這種差異的研宄表明，包含硫酯的蛋白I(TEPl)在 蚊子抑制瘧原蟲傳播的能力中起作用（Molina-Cruz (2012)PNAS 109(28) :E1957 -E1962)。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 惡性瘧原蟲具有數(shù)種分離株，包括在非洲、美國和亞洲發(fā)現(xiàn)的。這些株的每一種表 達稍微不同形式的Pfs47蛋白。本發(fā)明包括認識到Pfs47允許寄生蟲抑制或逃避免疫系統(tǒng) 從而確保寄生蟲存活的。Pfs47的進化提供非常強大的機制，通過該機制允許惡性瘧原蟲在 野外的有效傳播。
[0014] 盡管已知編碼Pf s47的基因，但之前并未了解Pf s47通過操縱蚊子免疫系統(tǒng)使寄 生蟲存活的事實。因為現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)系，所以有可能開發(fā)新的瘧疾疫苗和用于鑒定 其他的藥劑的方法，所述藥劑可以干擾Pfs47操縱蚊子免疫系統(tǒng)的能力。
[0015] 降低瘧疾傳播速率對于消滅該疾病來說是必不可少的。如本文所述，關于Pfs47 作為傳播阻斷靶標只有很少的支持。當將Pfs47抗體添加到用于野生型寄生蟲的血餐時， 它們不能抑制蚊子感染（Schaijk等人（2006)，上文）。與現(xiàn)有技術已接受的觀點相反，本 發(fā)明包括確認Pfs47實際上對于惡性瘧原蟲的野外傳播非常關鍵。Pfs47和相關化合物作 為傳播阻斷靶標的新用途涉及蚊子免疫系統(tǒng)的主動參與。具體來說，將疫苗（包括Pfs47 或其抗體）或藥劑（其抑制Pfs47)與蚊子接觸可以阻止Pfs47與蚊子免疫系統(tǒng)相互作用 并操縱該系統(tǒng)。通過這類疫苗或藥劑抑制或失活Pfs47,蚊子免疫系統(tǒng)能夠"看見"寄生蟲， 并將其摧毀或?qū)嵸|(zhì)性降低。
[0016] 本發(fā)明還包括確認P47蛋白、它們的抗體以及被認為抑制P47的藥劑可以有效作 為瘧疾傳播的疫苗或傳播阻斷劑。如本文所述，P47蛋白包括，但不限于，惡性瘧原蟲產(chǎn)生 的Pfs47和間日瘧原蟲產(chǎn)生的Pvs47。
[0017] 如實施例部分詳述，使用閃比亞按蚊的抗性株（無法殺死惡性瘧原蟲非洲株GB4、 NF54和3D7,但非常有效的殺死惡性瘧原蟲巴西7G8株）鑒定Pfs47為負責惡性瘧原蟲有 效傳播的蛋白?；赑fs47在傳播中的重要作用，事實證明通過各種方式破壞Pfs47的功 能可以是新的和有力的實質(zhì)性控制和降低瘧疾流行性的方式。
[0018] 因此，如下文詳細所述，本發(fā)明的一個實施方案包括疫苗及其施用，其中所述疫苗 是包含P47蛋白（或其免疫片段或變體）的藥物組合物；或包含針對P47蛋白（或其免疫 片段或變體）的抗體（或其片段）的藥物組合物。
[0019] 在其他實施方案中，利用P47的關鍵作用來開發(fā)用于在野外破壞P47功能的新藥 劑。在一個方面，用于鑒定新藥劑的測定法包含在感染惡性瘧原蟲的蚊子中篩選候選化合 物。在另一個方面，測定法涉及在細胞中篩選候選化合物，所述細胞中JNK信號轉(zhuǎn)導途徑已 經(jīng)被失活來鑒定可以恢復JNK信號轉(zhuǎn)導的藥劑。
[0020] 在其他實施方案中，本發(fā)明包括能夠表達抗體或其他藥劑（其可以破壞P47功能） 的轉(zhuǎn)基因和副轉(zhuǎn)基因（paratransgenic)蚊子。在副轉(zhuǎn)基因蚊子中，已經(jīng)將編碼抗體或其他 藥劑的基因插入定殖于腸微生物群的細菌的基因組中并表達和輸出，從而所述藥劑可以與 蚊子腸或其他器官中的P47相互作用。
[0021] 附圖簡述
[0022] 圖1顯示在抗性（R)蚊子中胃腸外和子代惡性瘧原蟲品系的存活，以及黑化表型 的數(shù)量性狀基因座（QTL)作圖。（A)R蚊子的中腸中的惡性瘧原蟲GB4和7G8寄生蟲。（B) 在R蚊子中GB4x 7G8遺傳雜交的胃腸外和子代品系的黑化表型。（C)黑化表型的基因組范 圍QTL分析的奇數(shù)對數(shù)分數(shù)（LOD)。紅色虛線，在P = 0. 05和P = 0. 40時的統(tǒng)計顯著性閾 值；箭頭，顯著QTL。
[0023] 圖2顯示連鎖群挑選、mRNA表達和編碼區(qū)域序列分析。（A)在從S或R蚊子解剖的 單個卵囊中，純合的非洲（AA ;水平線）巴西（BB ;垂直線）或雜合（AB，對角線虛線）標記物 沿著Chr. 13的基因型頻率。（黑色箭頭，R株中極端陰性選擇中的BB區(qū)域）。（B)GB4/7G8 惡性瘧原蟲動合子階段中候選基因的相對mRNA表達。深紅色斑點，在GB4和7G8之間具有 非同義單核苷酸多態(tài)性（SNP)的基因；箭頭，GB4-3D7和7G8-SL株之間共有的SNP。
[0024] 圖3顯示不同蚊子中NF54野生型（WT)或Pfs47敲除（KO)的表型。（A)R和S蚊 子中黑化（X軸）和活（y軸）KO寄生蟲的數(shù)目。每個點表示單個中腸。中值用水平線表示。 (B) TEP-I沉默對R蚊子中KO感染的影響。（C)沉默TEP-I對S蚊子中WT和KO感染的影 響。（D)利用Pf s47和Pf s25對WT和KO動合子的免疫熒光染色（比例尺=5 μ m)。（E)用 WT或KO寄生蟲感染（I =感染的）或飼喂未感染血液（C =對照）S雌蚊24h后，HPX2和 N0X5的中腸 mRNA表達，和使用ELISA的中腸硝化作用。
[0025] 圖4顯示利用巴西（7G8)和非洲（NF54)的Pfs47等位基因補充Pfs47敲除（KO) 寄生蟲的效果。在閃比亞按蚊R株中用（A)NF54或（B)7G8Pfs47等位基因補充的Pfs47K0 寄生蟲的感染性。
[0026] 圖5顯示，限定與惡性瘧原蟲（Pf)黑化表型有關的染色體13數(shù)量性狀基因座 (QTL)的標記物的圖示。Pf胃腸外（GB4等位基因，對角線；7G8等位基因，對角虛線）的微 衛(wèi)星（MS)標記物基因型，和具有鄰近最初QTL邊界的重組位點的3個子代品系（KA6、DAN和 WE2)。已知的標記物（基于所述雜交的公開連鎖圖）用它們的名稱表示（C13M63、C13M87 和TA56) (1)。新的MS標記物從基因組鑒定，并用于更準確的定位重組位點；它們的染色體 位置用Kb表示（頂行）。每個標記物等位基因的PCR產(chǎn)物大小用堿基對表示。用重組位點 標示的最終QTL邊界（1773. 4Kb和945. 68Kb)用箭頭（丨）指示，并限定一個172Kb區(qū)域。 用于基因分型的引物序列顯示于表1。
[0027] 圖6顯示沿著單個卵囊的染色體13的基因型，所述卵囊解剖自易感性⑶G3或抗 性（R) L3-5岡比亞按蚊（用GB4非洲（A等位基因）和7G8巴西（B等位基因）惡性瘧原蟲 株之間雜交的未克?。╱n-cloned)子代進行感染）的中腸。每個標記物的單個卵囊基因型 分別用不同的陰影模式表示：純合的非洲（AA，采用對角線），純合的巴西（BB，采用對角虛 線），和雜合的（AB，采用網(wǎng)格線）。每個標記物的基因型頻率在每個表的底部顯示。沿著染 色體13的26個標記物的染色體位置和引物顯示于表2。QTL邊界用箭頭指示。
[0028] 圖7顯示50個額外單個卵囊的基因型，所述卵囊解剖自抗性L3-5岡比亞按蚊，其 用GB4非洲和7G8巴西惡性瘧原蟲株之間雜交的未克隆子代進行感染。在強遺傳選擇條件 下，在染色體13的區(qū)域中完成基因分型。每個標記物的單個卵囊基因型用不同的陰影模式 表示：純合的非洲（AA，采用對角線），純合的巴西（BB，采用網(wǎng)格線），和雜合的（AB，采用對 角虛線）。沿著染色體13的標記物的染色體位置和引物顯示于表2。QTL邊界用箭頭指示。
[0029] 圖8顯示岡比亞按蚊抗性（R)株中Pfs48/45敲除（KO)的NF54惡性瘧原蟲寄生 蟲的表型。R蚊子中每個中腸的黑化（X軸）和活（y軸）Pfs48/45K