一種芽枝狀枝孢霉及木質(zhì)纖維素酶制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及一種芽枝狀枝孢霉及木質(zhì)纖維素酶制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 利用農(nóng)林廢棄物、能源植物等木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燃料乙醇，對緩解能源及 環(huán)境危機具有重要意義。目前，纖維素乙醇的高成本仍是限制其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用 的主要因素。其中，酶成本占總成本的50?60%，其次為能耗成本。單一種類的木質(zhì)纖維 素酶已無法滿足工業(yè)需求，需要多種木質(zhì)纖維素酶的協(xié)同作用，以實現(xiàn)在減少酶用量的同 時，提高對木質(zhì)纖維素原料的可發(fā)酵糖得率。然而，目前已報道木質(zhì)纖維素水解復(fù)合酶的糖 化效率仍不能滿足產(chǎn)業(yè)需要。
[0003] 木質(zhì)纖維素原料經(jīng)預(yù)處理后，殘留的木質(zhì)素及其衍生物對水解酶的酶活力及其對 木質(zhì)纖維素的水解程度具有強烈的抑制作用。向木質(zhì)纖維素水解復(fù)合酶體系中添加木質(zhì)素 酶，可減小木質(zhì)素及其衍生物對水解酶的抑制，進而提高酶解效率和糖得率。然而，現(xiàn)有商 品化木質(zhì)纖維素水解復(fù)合酶制劑中均未涉及木質(zhì)素酶，已報道文獻中也僅有幾例研宄涉及 木質(zhì)素酶中的漆酶，同時含有多種木質(zhì)素酶的水解復(fù)合酶體系未見報道。
[0004] 同時，已有木質(zhì)纖維素水解復(fù)合酶的酶解作用溫度范圍為35?65°C，適用于中低 溫條件下高效糖化木質(zhì)纖維素的水解復(fù)合酶匱乏，酶解溫度為30°C以下且含有木質(zhì)素酶的 木質(zhì)纖維素水解復(fù)合酶體系尚屬空白。構(gòu)建含有木質(zhì)素酶且適用于中低溫條件下的高效木 質(zhì)纖維素糖化酶系，可在提高糖得率的同時，縮減木質(zhì)纖維素原料糖化與發(fā)酵過程間的溫 差，增強工業(yè)可操作性，降低酶成本及能耗，推進纖維素乙醇大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化及應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的在于提供一種木質(zhì)素降解菌株。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種能夠在30°C以下進行糖化過程且含有木質(zhì)素 酶的木質(zhì)纖維素水解復(fù)合酶體系。
[0007] 本發(fā)明的第三個目的在于提供一種木質(zhì)纖維素酶制劑在木質(zhì)纖維素原料糖化中 的應(yīng)用。
[0008] 為了達到本發(fā)明的第一個目的，本發(fā)明提供了 一種木質(zhì)素降解菌株 (Cladosporiumcladosporioides)經(jīng)鑒定，種屬來源為芽枝狀枝孢霉，已于2014年9月 4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱為CGMCC，地址為北京 市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所，郵政編碼：100101)保藏編號為 CGMCCNo. 9587。
[0009] 請給出分離、篩選、鑒定過程如下：
[0010] 長白山森林土壤樣品經(jīng)鞣酸和AzureBlue平板篩選，獲得真菌菌株YCB，依據(jù) 其18SrRNA和ITSrRNA基因序列和GenBank中與之相似性較高的菌種序列以相鄰連 接法（NeighborJoining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示與之最相關(guān)的菌種為Cladosporium sp. (100 % )，菌株YCB屬于枝抱霉屬（Cladosporium)，且與菌株Cladosporium cladosporioides處于同一個分支，所以菌株YCB也屬于這個種，命名為Cladosporium cladosporioidesYCB〇
[0011] 本發(fā)明所提供的芽枝狀枝孢霉CGMCCNO. 9587的分類學(xué)性質(zhì)：
[0012] 真菌YCB能夠產(chǎn)生分生孢子，菌絲體呈灰綠色，菌絲有隔。依據(jù)其18SrRNA和 ITSrRNA基因序列和GenBank中與之相似性較高的菌種序列以相鄰連接法（Neighbor Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示與之最相關(guān)的菌種為Cladosporiumsp. (100%)，菌株 YCB屬于枝抱霉屬（Cladosporium)，且與菌株Cladosporiumcladosporioides處于同一個 分支，所以菌株YCB也屬于這個種，命名為CladosporiumcladosporioidesYCB。
[0013] 為達到本發(fā)明的第二個目的，本發(fā)明提供了一種木質(zhì)纖維素酶制劑，包括芽枝狀 枝孢霉CGMCCNo. 9587的發(fā)酵干粉和木聚糖酶；
[0014] 可選的，所述木聚糖酶選選自棒曲霉（Aspergillusclavatus)來源的木聚糖酶、 黑曲霉（Aspergillusniger)來源的木聚糖酶和里氏木霉（Trichodermareesei)來源的 木聚糖酶中的至少一種。
[0015] 可選的，所述發(fā)酵干粉是按照以下方法制備獲得的：
[0016] 在4?30°C條件下，將芽枝狀枝孢霉（CGMCCNo. 9587)按照1 %?10%的菌接種 量接種于營養(yǎng)液中培養(yǎng)3?5d獲得發(fā)酵液，利用濃度為40%?85%的（NH4) #04對發(fā)酵液 進行沉淀后透析，將透析獲得的產(chǎn)物干燥后獲得發(fā)酵干粉。
[0017] 可選的，以重量份計，相對于1重量份的發(fā)酵干粉，棒曲霉來源的木聚糖酶的用量 為2-6份，黑曲霉來源的木聚糖酶的用量為2-6份，里氏木霉來源的木聚糖酶的用量為2-6 份。
[0018] 本發(fā)明所提供的木質(zhì)纖維素酶制劑對木質(zhì)纖維素原料的糖轉(zhuǎn)化率高，由于該酶制 劑可以在中低溫條件下（4-30°C)使用，能夠縮減木質(zhì)纖維素原料糖化與發(fā)酵過程間的溫 差，增強工業(yè)可操作性，降低成本。
[0019] 為了達到本發(fā)明的第二個目的，本發(fā)明提供了木質(zhì)纖維素酶制劑在木質(zhì)纖維素原 料糖化中的應(yīng)用，包括以下步驟：所述的木質(zhì)纖維素酶制劑和木質(zhì)纖維素原料混勻獲得預(yù) 混合物，將所述預(yù)混合物與pH為2-6的緩沖液接觸混勻獲得酶解混合物，在4-30°C下對酶 解混合物進行糖化處理。
[0020] 可選的，糖化處理的溫度為4-15°C。
[0021] 可選的，所述木質(zhì)纖維素酶制劑和木質(zhì)纖維素原料的重量比為0. 15-1. 75 :1。
[0022] 可選的，相對于lg的預(yù)混合物，所述緩沖液的用量為50-1000mL，所述緩沖液為醋 酸鈉緩沖液、酒石酸鈉緩沖液或檸檬酸鈉緩沖液。
[0023] 利用本發(fā)明所提供的木質(zhì)纖維素酶制劑，能夠在較低的溫度下完成木質(zhì)纖維素原 料的糖化處理過程，對原料利用更加充分、糖得率高、能耗低、特別適合于纖維素乙醇發(fā)酵 生產(chǎn)領(lǐng)域的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
【具體實施方式】
[0024] 下面將通過【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。
[0025]芽枝狀枝抱霉（Cladosporiumcladosporioides)保藏編號為CGMCCNo. 9587。
[0026] 本發(fā)明提供了一種木質(zhì)纖維素酶制劑，包括所述芽枝狀枝孢霉CGMCCNo.9587的 發(fā)酵干粉和木聚糖酶；
[0027] 在本發(fā)明中，所述木聚糖酶可以由多種具有木聚糖分解能力的酶復(fù)配獲得，例 如，所述木聚糖酶可以選自棒曲霉（Aspergillusclavatus)來源的木聚糖酶、黑曲霉 (Aspergillusniger)來源的木聚糖酶和里氏木霉（Trichodermareesei)來源的木聚糖酶 中的至少一種。
[0028] 在本發(fā)明中，所述發(fā)酵干粉和木聚糖酶的重量比為1 :2_6 ;為了獲得最佳的木質(zhì) 素糖化效果，所述發(fā)酵干粉和木聚糖酶的重量比優(yōu)選為1 :3-5。
[0029] 在本發(fā)明所提供的方法中，以重量份計，相對于1重量份的發(fā)酵干粉，棒曲霉來源 的木聚糖酶的用量為2-6份，黑曲霉來源的木聚糖酶的用量為2-6份，里氏木霉來源的木聚 糖酶的用量為2-6份。
[0030] 所述發(fā)酵干粉中含有芽枝狀枝孢霉（CGMCCNo. 9587)所產(chǎn)生的纖維素酶、木聚糖 酶、木質(zhì)素酶和酯酶、漆酶、錳過氧化物酶和非錳依賴性過氧化物酶。
[0031] 其中，所述發(fā)酵干粉是按照以下步驟制備獲得的：
[0032] 在4?30°C條件下，將芽枝狀枝孢霉（CGMCCNo. 9587)按照1 %?10%的菌接種 量接種于營養(yǎng)液中培養(yǎng)3?5d獲得發(fā)酵液，利用濃度為40%?85%的（NH4) #04對發(fā)酵液 進行沉淀后透析，將透析獲得的產(chǎn)物干燥后獲得發(fā)酵干粉。
[0033] 其中，所述營養(yǎng)液是以土豆培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加其他輔料制備獲得的，所述 輔料選自玉米籽皮、麥麩、松木肩、甘蔗渣和豆粉中的至少一種。
[0034] 其中，所述土豆培養(yǎng)基具有本領(lǐng)域常規(guī)使用的組分，具體的，所述土豆培養(yǎng)基含有 20%土豆，2%蔗糖。
[0035] 其中，相對于100重量份的所述土豆培養(yǎng)基、玉米籽皮的添加量為10-50重量份、 麥麩的添加量為10-50重量份、松木肩的添加量為10-50重量份、甘蔗渣的添加量為10-50 重量份、ii粉的添加量為1〇_50重量份。
[0036] 在發(fā)酵過程結(jié)束后，利