一株高產(chǎn)油柵藻sdec-13及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微藻生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一株高產(chǎn)油柵藻SDEC-13及其培養(yǎng)方法 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 能源短缺和二氧化碳過(guò)度排放是當(dāng)今世界兩大突出的環(huán)境問(wèn)題。
[0003] 隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，初級(jí)能源消耗量持續(xù)增加，能源缺口逐年擴(kuò)大，同時(shí)由 于化石燃料的燃燒，過(guò)多的二氧化碳排放到大氣中導(dǎo)致全球溫室效應(yīng)。作為一種可再生能 源，生物柴油有同時(shí)解決這兩個(gè)問(wèn)題的潛力。藻類(lèi)是一種非常高效的生產(chǎn)生物柴油的原料。 它的優(yōu)勢(shì)有：1、生長(zhǎng)速率快，一般十幾天就能收獲；2、可以在無(wú)法種植糧食的廢水中進(jìn)行 培養(yǎng)，不占用耕地面積；3、畝產(chǎn)量可以達(dá)到傳統(tǒng)生物柴油原料玉米的172倍；4、由于高生長(zhǎng) 速率，其具有更高的二氧化碳固定效率。利用微藻生產(chǎn)生物柴油必須保證充足的碳源和氮 源，由此造成的高培養(yǎng)成本是制約微藻生物柴油規(guī)模生產(chǎn)的主要因素。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)能源微藻油脂的高效積累及生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)外就富油微藻篩選，高密度、高油脂 含量微藻的培養(yǎng)等方面進(jìn)行了研宄。目前針對(duì)提高油脂含量的研宄主要集中在微藻的最優(yōu) 生長(zhǎng)條件上，包括光照強(qiáng)度、光質(zhì)、pH值、培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）、溫度等影響產(chǎn)油藻類(lèi)的生長(zhǎng) 因子、以及反應(yīng)器設(shè)計(jì)和營(yíng)養(yǎng)方式等方面。目前利用廢物培養(yǎng)微藻以降低培養(yǎng)成本成為當(dāng) 前能源微藻資源開(kāi)發(fā)研宄中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
[0005] 熱電廠廢氣中含有大量的二氧化碳和一氧化氮，如果能利用電廠廢氣養(yǎng)藻，不僅 可以降低微藻生物柴油的生產(chǎn)成本，還可以處理電廠廢氣。二氧化碳是微藻能夠有效利用 的無(wú)機(jī)碳源，廢氣中的一氧化氮容易被氧化成二氧化氮，二氧化氮易溶于水且生成硝酸根， 可以無(wú)機(jī)氮源供微藻利用。但是高濃度的二氧化碳和氮氧化物對(duì)藻類(lèi)有一定的毒性，而不 同的藻種呈現(xiàn)不同的耐受性。據(jù)報(bào)道有些球藻和柵藻能夠在濃度30% (v/v)以上的二氧化 碳環(huán)境快速生長(zhǎng)，小球藻對(duì)〇. 2%的一氧化氮具有耐受性。因此篩選能夠耐受這些煙氣的藻 種是使用電廠廢氣養(yǎng)藻的首要而關(guān)鍵的一步。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中用于生產(chǎn)微藻油脂的優(yōu)良藻株不足和培養(yǎng)成 本高的問(wèn)題，提供一株高產(chǎn)油柵藻及其利用工業(yè)廢氣的培養(yǎng)方法，即在自然水體采集水樣， 分離純化獲得一種具有油脂含量較高（27% )、易開(kāi)放培養(yǎng)的產(chǎn)油微藻，并建立培養(yǎng)方法。
[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 一株高產(chǎn)油柵藻SDEC-13,為ScenedesmusquadricaudaSDEC-13,其保藏編號(hào)為 CCTCCNO:M2014498,保藏日期為2014年10月19日，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心。柵藻SDEC-13富含優(yōu)質(zhì)油脂，油脂含量可達(dá)到細(xì)胞干重的30. 75%，脂肪酸中飽和脂肪 酸可達(dá)到82. 87%，可作為生物柴油原料。十六烷值（57)高于歐洲標(biāo)準(zhǔn)（51)和碘值（83. 36g I2/l〇〇g)決定了以該株微藻為原料制備的生物柴油具有很好的氧化安定性。
[0009] 所述的高產(chǎn)油柵藻SDEC-13,其核苷酸序列包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種上述的高產(chǎn)油柵藻SDEC-13培養(yǎng)基，其成份和用量 為NaN032.5g L'l^HPC^O.OTSg L'MgSC^.THW 0.075g L'CaCL.〗％。0.025g L' KH2P040. 175g I71，NaCl 0? 025g I71，土壤提取液40ml L' FeCl3 ? 6H200. 005g L' Fe-EDTA lml I71，H3B032. 86mg ? I71，MnCl2 ? 4H20 1. 86mg ? I71，ZnS04 ? 7H20 0? 22mg ? I71， Na2Mo04 ? 2H20 0? 39mg ? I71，CuS04 ? 5H20 0? 08mg ? I71，Co (N03) 2 ? 6H20 0? 05mg ? I71，初始pH 值在7?7. 5之間，接種后的藻細(xì)胞密度為0. 35?0. 40 X 106celIs. mL-1。
[0011] 所述土壤提取液的制備方法為：稱(chēng)取200g富含腐殖質(zhì)的土壤，加入1L純凈水；持 續(xù)煮沸l(wèi)h后靜止3h，重復(fù)三次；過(guò)濾即得。
[0012] 上述的高產(chǎn)油柵藻SDEC-13培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于，所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)高產(chǎn) 油柵藻SDEC-13,得到高產(chǎn)油柵藻SDEC-13藻粉。所述高產(chǎn)油柵藻SDEC-13藻粉的飽和脂肪 酸含量為82. 87%，十六烷值為57,碘值為83. 36gI2/100g。
[0013] 本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)上述高產(chǎn)油柵藻SDEC-13的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0014]a)將高產(chǎn)油柵藻SDEC-13培養(yǎng)于添加BG11的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25±1°C，全 光照，光照強(qiáng)度2000-3000Lux，培養(yǎng)7天；
[0015] b)將所得藻細(xì)胞轉(zhuǎn)移至SE培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，曝氣氣液比為0.1-0. 2vvm，氣 體為空氣、含有15% C02的空氣或含有15%〇)2和0.2% NO的空氣，培養(yǎng)溫度為25±1°C， 全光照，光照強(qiáng)度2000-3000LUX，待高產(chǎn)油柵藻SDEC-13生長(zhǎng)到穩(wěn)定期離心、干燥即得到培 養(yǎng)后高產(chǎn)油柵藻SDEC-13藻粉。上述的百分?jǐn)?shù)皆為體積百分?jǐn)?shù)。
[0016] 上述的高產(chǎn)油柵藻SDEC-13在處理污水和/或廢氣中的用途。所述處理為凈化。
[0017] 進(jìn)一步地，所述污水為工業(yè)廢水或城市生活污水，所述廢氣為工業(yè)廢氣。
[0018] 上述的高產(chǎn)油柵藻SDEC-13在制備生物柴油和/或油脂中的用途。
[0019] 本發(fā)明由于采取以上技術(shù)方案，其具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0020] 1、本發(fā)明提供的藻種可以利用廢氣中高濃度co2從而降低培養(yǎng)成本。本發(fā)明柵 藻富含優(yōu)質(zhì)油脂，總油脂含量可達(dá)干重的27. 2%，脂肪酸中飽和脂肪酸含量最高可達(dá)到 82. 87%，脂肪酸成分中，碳鏈長(zhǎng)度為16-18的脂肪酸含量可達(dá)98%以上，適合作為生產(chǎn)生 物柴油的原料。
[0021] 2、本發(fā)明提供的柵藻SDEC-13能夠耐受高濃的二氧化碳和有毒氣體一氧化氮。因 此柵藻SDEC-13能夠利用工業(yè)廢氣中的二氧化碳進(jìn)行培養(yǎng)，降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明提供的 柵藻SDEC-13含油量豐富，所含生物柴油品質(zhì)高，重力學(xué)粘度、比重、十六烷值等生物柴油 指標(biāo)均符合國(guó)家和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為柵藻SDEC-13的光學(xué)顯微鏡照片和掃描電鏡照片。
[0023] 圖2為基于18SrRNA部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
[0024] 圖3為不同曝氣成分條件下，柵藻SDEC-13的生物量隨時(shí)間的變化。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)的方法和條件進(jìn)行選 擇。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 藻種的獲得和鑒定
[0028] 一、樣品采集
[0029] 2012年11月從山東省濟(jì)南市山東建筑大學(xué)人工湖采集富含微生物的水樣。
[0030] 二、柵藻SDEC-13的分離純化和篩選
[0031] 水樣經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)后，在顯微鏡下對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將水樣稀釋 至其中的藻細(xì)胞濃度約為1個(gè)/50微升。在無(wú)菌環(huán)境下，向96孔板的每個(gè)孔中加入50微 升水樣，再加入200微升BG11培養(yǎng)液，BG11培養(yǎng)基成分為：NaN03l. 5g/L，K2HP040 . 04g/ L,MgS04?7H20 0. 075g/L,CaCl2 ? 2H20 0. 036g/L,Citricacid0. 006g/L,Ferricammonium citrate0. 006g/L,EDTANa0.OOlg/L,NaC030. 02g/L,A5tracemetalsolution1ml/ L.TheA5tracemetalsolutionwascomposedofH3B032. 86g/L,MnCl2 ? 4H20 1. 86g/ L,ZnS04 *7H20 0. 22g/L,Na2Mo04 *2H200. 39g/L,CuS04 *5H20 0. 08g/L,Co(N03)2 *6H20 0. 05g/ L。將96孔板放在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，大約十余天后96孔板的孔內(nèi)生長(zhǎng)出藻類(lèi)群落。 在無(wú)菌環(huán)境中將96孔板中的藻分別轉(zhuǎn)移至裝有10mLBG11培養(yǎng)基的試管中，繼續(xù)在培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)至試管中藻液變綠。然后對(duì)試管中藻液在顯微鏡下進(jìn)行鏡鑒，將純的藻種進(jìn)行保 存。
[0032] 將這些純的藻種分別進(jìn)行曝氣培養(yǎng)，選出生長(zhǎng)狀況較好同時(shí)油脂含量較高的一株 為目標(biāo)藻種。命名為SDEC-13。
[0033] 三、柵藻SDEC-13的鑒定
[0034] 1、柵藻SDEC-13的形態(tài)學(xué)鑒定
[0035] 使用光學(xué)顯微鏡（CX31，OLYMPUS,Japan)在放大四百倍條件下觀察柵藻SDEC-13 的藻細(xì)胞特征。藻細(xì)胞具有典型的柵藻細(xì)胞形態(tài)特征，細(xì)胞呈長(zhǎng)圓形，單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)度約為 5?10微米。通常以兩個(gè)或四個(gè)的細(xì)胞群體狀態(tài)存在，四個(gè)角都長(zhǎng)有脊刺，圖1為柵藻 SDEC-13的光學(xué)顯微鏡照片和掃描電鏡照片。
[0036] 2、柵藻SDEC-13的分子生物學(xué)鑒定
[0037] 離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞，使用DNeasyPlantMiniKit試劑盒提取基因組 總DNA，對(duì)其進(jìn)行18SrDNA擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為50yL，其中包括TaqPCRMasterMix 25 1^，0嫩樣品11^，上游引物（1〇1^)2 1^，下游引物（1〇1^)2 1^，(1(11120 2〇1^。？0?擴(kuò) 增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性lmin;94°C變性lmin，55°C復(fù)性lmin，72°C延伸1. 5min，重復(fù)30個(gè) 循環(huán)；72°C延伸10min。
[0038]上下游引物分別為：CTGGTTGATCCTGCCAG(18S-F)和 TTGATCCTTCTGCAGGTTCA(18S-R)。
[0039] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為18S rDNA的部分序列，長(zhǎng)度為1046bp測(cè)序結(jié)果如SEQIDNo. 1所示。
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