一種即時(shí)檢測(cè)egfr突變的微流控芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種即時(shí)檢測(cè)EGFR突變的微流控芯片。本發(fā) 明的微流控芯片集核酸提取、LAMP擴(kuò)增、即時(shí)檢測(cè)為一體。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的發(fā)病率第一、死亡率第一的惡性腫瘤。大量研宄顯 示表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)作為受體酪氨酸超家族 成員在多種惡性腫瘤中表達(dá)。配體與EGFR結(jié)合誘導(dǎo)形成二聚體，使構(gòu)象發(fā)生變化活化酪氨 酸激酶及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，產(chǎn)生細(xì)胞增殖、侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及抗凋亡等效應(yīng)。臨床研宄顯示，EGFR激 酶結(jié)構(gòu)域的活化突變與藥物敏感性相關(guān)，使得僅10%?30 %患者對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制 劑敏感，所以，檢測(cè)EGFR基因突變有助于預(yù)測(cè)患者對(duì)藥物的敏感性，篩查對(duì)靶向藥敏感的 人群，從而提高療效，實(shí)現(xiàn)對(duì)患者的靶向個(gè)體化治療。
[0003] 肺癌的個(gè)體化治療模式迫切需要一種能在患者旁邊實(shí)現(xiàn)快速臨床檢測(cè)一一即時(shí) 檢驗(yàn)（P0CT)的裝置。研宄發(fā)現(xiàn)，EGFR酪氨酸激酶的突變主要發(fā)生在18-21外顯子，其中19 和21號(hào)外顯子突變覆蓋突變的90%。目前對(duì)EGFR突變的檢測(cè)步驟包括標(biāo)本獲得、DNA抽 提、EGFR突變檢測(cè)和結(jié)果分析。檢測(cè)的方法包括：DNA測(cè)序、ARMS及其它如DHPLC等。
[0004] 隨著等溫?cái)U(kuò)增核酸技術(shù)（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、解旋酶依賴的擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增等）的興 起，為EGFR突變的P0CT檢測(cè)帶來(lái)了新的契機(jī)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)技術(shù)是2000年開 始興起的一個(gè)相對(duì)新的恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)，它最突出的特點(diǎn)是高特異性、高敏感性、快速和 高產(chǎn)出率。LAMP是在60-65°C執(zhí)行的擴(kuò)增技術(shù)，主要反應(yīng)物是具有鏈置換活性的BstDNA 聚合酶和四條引物。一般在LAMP管中LAMP的陽(yáng)性結(jié)果可通過(guò)濁度增加、發(fā)綠色熒光或者 通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)。因此LAMP技術(shù)用于實(shí)時(shí)檢測(cè)（P0CT)方面的突出優(yōu)勢(shì)是不需要 熱循環(huán)儀器和結(jié)果的肉眼可視化。
[0005] 世界衛(wèi)生組織（WHO)做出了一系列適用于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的一般診斷檢測(cè)方法 的方針，簡(jiǎn)稱ASSURED:負(fù)擔(dān)得起（affordable)、靈敏（sensitive)、特異（specific)、容易 使用（user-friendly)、快速穩(wěn)定（rapidandrobust)、無(wú)需設(shè)備（equipmentfree)和可 傳送給終端使用者（deliverabletoendusers)。但是，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)依賴精確的 溫度循環(huán)裝置，此缺點(diǎn)導(dǎo)致PCR不便于成為P0CT檢測(cè)方法。后來(lái)，以恒溫?cái)U(kuò)增核酸為基礎(chǔ) 的方法被證實(shí)有卓越的靈敏性和特異性但不算是負(fù)擔(dān)得起、擴(kuò)增速度較慢和需要較大的能 量供應(yīng)。在資源缺乏地區(qū)，微小化、無(wú)需大型儀器的LAMP系統(tǒng)在廉價(jià)實(shí)時(shí)檢測(cè)（P0CT)方面 顯示出了巨大的潛力。目前，微型LAMP系統(tǒng)在無(wú)需大型儀器（無(wú)需電泳儀等大型儀器）和 操作方面還沒(méi)有完全符合WHO所提出的標(biāo)準(zhǔn)。因此，目前在臨床檢測(cè)基因突變P0CT化方面 有強(qiáng)烈的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種能夠即時(shí)檢測(cè)EGFR突變的 微流控芯片。本發(fā)明的微流控芯片使得細(xì)胞或組織DNA的提取、擴(kuò)增、目的序列基因突變的 檢測(cè)在一個(gè)微流控芯片中得以簡(jiǎn)便、快速、高效、無(wú)污染地實(shí)現(xiàn)。
[0007] 本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0008] 一種即時(shí)檢測(cè)EGFR突變的微流控芯片，所述微流控芯片是由上層基片1和下層基 片2鍵合而成的一個(gè)密閉整體；所述微流控芯片上設(shè)有三個(gè)相同且彼此獨(dú)立的LAMP系統(tǒng)； 每一個(gè)所述LAMP系統(tǒng)包括一個(gè)氣囊小室11、一個(gè)裝有恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液的小室21、一個(gè)裝有 引物的小室22、一個(gè)裝有BstDNA聚合酶的小室23、一個(gè)LAMP反應(yīng)室15、一條氣體通道16、 一條氣體通道17、一條氣體通道18 ;所述氣囊小室11的上半部分，所述裝有恒溫?cái)U(kuò)增緩沖 液的小室21的上半部分、所述裝有引物的小室22的上半部分、所述裝有BstDNA聚合酶的 小室23的上半部分、所述LAMP反應(yīng)室15的上半部分、所述氣體通道16、所述氣體通道17、 所述氣體通道18位于所述上層基片1上，且所述氣體通道16的一端與所述氣囊小室11的 上半部分連通，所述裝有恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液的小室21的上半部分、所述裝有引物的小室22的 上半部分、所述裝有BstDNA聚合酶的小室23的上半部分依次排列于所述氣體通道16上且 與所述氣體通道16連通；所述氣體通道16的另一端與所述氣體通道17的一端連通，所述 氣體通道17的另一端與所述LAMP反應(yīng)室15的上半部分連通，所述氣體通道18穿過(guò)所述 LAMP反應(yīng)室15的上半部分并與之連通；所述氣體通道18的一端設(shè)有樣本入口 181，另一端 設(shè)有廢液出口 182,所述氣體通道17、所述氣體通道18與所述LAMP反應(yīng)室15的連接處設(shè) 有微縫19 ;所述氣囊小室11的下半部分、所述裝有恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液的小室21的下半部分、 所述裝有引物的小室22的下半部分、所述裝有BstDNA聚合酶的小室23的下半部分、所述 LAMP反應(yīng)室15的下半部分位于所述下層基片2上，所述氣囊小室11、所述裝有恒溫?cái)U(kuò)增緩 沖液的小室21、所述裝有引物小室22、所述裝有BstDNA聚合酶的小室23、所述LAMP反應(yīng) 室15中設(shè)有微柱111，多個(gè)所述微柱111均勻分布，所述微柱111的高度小于所述氣囊小室 11的高度、小于所述裝有恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液的小室21的高度、小于所述裝有引物小室22的高 度、小于所述裝有BstDNA聚合酶的小室23的高度、小于所述LAMP反應(yīng)室15的高度；所述 裝有恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液的小室21的上半部分直徑比下半部分多1_、所述裝有引物的小室22 的上半部分直徑比下半部分多1mm、所述裝有BstDNA聚合酶的小室23的上半部分直徑比 下半部分多1mm、所述LAMP反應(yīng)室15的下半部分與所述LAMP反應(yīng)室15的上半部分相對(duì) 應(yīng)；所述氣囊小室11的下半部分與所述氣囊小室11的上半部分相對(duì)應(yīng)。
[0009] 本發(fā)明的LAMP反應(yīng)室15的上半部分是設(shè)置在上層基片1上的凹槽結(jié)構(gòu)，LAMP反 應(yīng)室15的下半部分是設(shè)置在下層基片2上的凹槽結(jié)構(gòu)，上下凹槽結(jié)構(gòu)契合形成一個(gè)可以進(jìn) 行LAMP反應(yīng)的空間。所述凹槽結(jié)構(gòu)可以是任何形狀。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述凹 槽結(jié)構(gòu)的橫截面是圓形。
[0010] 本發(fā)明的氣體通道16、17、18是設(shè)置在上層基片1上的溝槽，所述溝槽的橫截面可 以是任何形狀。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述溝槽結(jié)構(gòu)的橫截面是半圓形。
[0011] 本發(fā)明的氣囊小室11的上半部分是設(shè)置在上層基片1上的凹槽結(jié)構(gòu)，氣囊小室 11的下半部分是設(shè)置在下層基片2上的凹槽結(jié)構(gòu)，上下凹槽結(jié)構(gòu)契合形成一個(gè)完整的氣囊 小室11。所述凹槽結(jié)構(gòu)可以是任何形狀。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述凹槽結(jié)構(gòu)的橫 截面是圓形。為了使25yL反應(yīng)體系順利進(jìn)入反應(yīng)室，需要使氣囊小室儲(chǔ)存氣體體積大于 25yL，根據(jù)相同高度及底面積的條件下，圓柱形體積最大的原理，發(fā)明人設(shè)計(jì)了此氣囊室， 根據(jù)計(jì)算，氣囊室體積為40. 192yL，滿足條件。
[0012] 本發(fā)明的裝有恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液的小室21、裝有引物的小室22、裝有BstDNA聚合 酶的小室23的上半部分是設(shè)置在上層基片1上的凹槽結(jié)構(gòu)，裝有恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液的小室 21、裝有引物的小室22、裝有BstDNA聚合酶的小室23的下半部分是設(shè)置在下層基片2上 的凹槽結(jié)構(gòu)，上下凹槽結(jié)構(gòu)契合形成一個(gè)可以進(jìn)行LAMP反應(yīng)的空間。所述凹槽結(jié)構(gòu)可以是 任何形狀。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述凹槽結(jié)構(gòu)的橫截面是圓形。
[0013] 構(gòu)成微流控芯片上下兩層基片的材料可以是PDMS(聚二甲基硅氧烷）、PMMA(聚 甲基丙烯酸甲酯）、PC(聚碳酸酯）、COC樹脂、ABS(丙烯腈-苯乙烯-丁二烯共聚物）、玻 璃、石英或銅。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述上層基片1和下層基片2的制備材料選用 PDMS〇
[0014] 本發(fā)明的氣囊小室11、裝有恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液的小室21、裝有引物的小室22、裝有 BstDNA聚合酶的小室23、LAMP反應(yīng)室15的內(nèi)部設(shè)置的微柱111目的是用于防止氣囊塌 陷，多個(gè)所述微柱111均勻分布。所述微柱111可以是任何形狀。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案 中，所述微柱111的形狀是正立方體。優(yōu)選地，所述氣囊小室11中設(shè)有9個(gè)微柱，裝有恒溫 擴(kuò)增緩沖液的小室21中設(shè)有5個(gè)微柱，裝有引物的小室22中設(shè)有3個(gè)微柱；裝有BstDNA 聚合酶的小室23中設(shè)有1個(gè)微柱，LAMP反應(yīng)室15中設(shè)有9個(gè)微柱。
[0015] 優(yōu)選地，所述微柱的高度為80ym。
[0016] 本發(fā)明使用的玻璃粉（直徑為63-93ym)為EDC/NHS修飾的帶有羧基的玻璃粉 (購(gòu)自綿陽(yáng)光耀新材料有限責(zé)任公司），利于吸附細(xì)胞裂解后釋放的DNA。
[0017] 玻璃粉的修飾方法：取適量Si02微球，放置1. 5ml離心管中，用95%乙醇洗滌2 次，重懸于100UL95%乙醇中。加入2. 5%氨基硅烷400yL，振蕩充分，超聲片刻，振搖 30min(Invitrogenhulamixer80rpm)。用無(wú)水乙醇洗絳3次，重懸于100yL無(wú)水乙醇中。 用N.N-二甲基甲酰胺洗滌1次，重懸于100yLN.N-二甲基甲酰胺中。加入10 %丁二酸酐 (溶劑：N.N-二甲基甲酰胺），在隊(duì)中室溫反應(yīng)6h。用雙蒸水洗滌3次，重懸于lOOyL雙 蒸水中。
[0018] 為了防止吸附DNA的玻璃粉溢出LAMP反應(yīng)室15,氣體通道17、18和LAMP反應(yīng)室 15連通處設(shè)計(jì)微縫19。所述微縫19的微縫間隙為50ym。
[0019] 進(jìn)一步，所述氣