囊小室11的直徑為8mm、高度為0.2mm;所述氣體通道16的尺寸為 45mmX3mm;所述氣體通道18的尺寸為25mmX3mm;所述氣體通道17的尺寸為3mmX4mm;戶斤 述LAMP反應(yīng)室15的直徑為7. 5mm、高度為0? 2mm;所述裝有恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液的小室21的下 半部分的直徑為6_、高度為0. 2mm;所述裝有引物的小室22的下半部分的直徑為3_、高 度為0. 2mm;所述裝有BstDNA聚合酶的小室23的下半部分的直徑為2mm、高度為0. 2mm。
[0020] 優(yōu)選地，每一個(gè)LAMP系統(tǒng)中：所述氣體通道16和所述氣體通道18彼此平行。
[0021] 優(yōu)選地，每一個(gè)LAMP系統(tǒng)中：所述氣體通道16和所述氣體通道17相互垂直；所述 氣體通道17和所述氣體通道18相互垂直。
[0022] 每一個(gè)LAMP系統(tǒng)中：所述裝有恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液的小室21中含有下列混合液 19yL(所示濃度均為終濃度）：Tris-HCL20mM、KCL10mM、MgS048mM、（NH4) 2S0410mM、 TritonX-1000. 1%、甜菜堿 0? 8M、dNTPs每種 1. 4mM、MnCL20. 5mM、鈣黃綠素 25yM。
[0023] 三個(gè)所述LAMP系統(tǒng)中：兩個(gè)所述裝有引物的小室22中各含有引物4yL，所述引 物序列如下所示：
[0024]SEQIDNO. 1 :5' -GCAGGGTCTTCTCTGTTTCA-3'（終濃度0.4yM);
[0025]SEQIDNO. 2 :5' -TCAGGAAAATGCTGGCTGAC-3'（終濃度0?4yM);
[0026]SEQIDNO. 3 :5' -TTCACCAGTACGTTCCTGGCTG-AACTACTTGGAGGACCGTCG-3'（終濃度 1. 6yM)；
[0027]SEQIDNO. 4 :5' -GTGCCAAACTGCTGGGTGCGGA-CCACCTCCTTACTTTGCCTC-3'（終濃度 1. 6yM);含有上述引物序列的小室22的LAMP系統(tǒng)一個(gè)作為樣本LAMP系統(tǒng)，一個(gè)作為陰性 對(duì)照LAMP系統(tǒng)。
[0028] 另外一個(gè)LAMP系統(tǒng)中：所述裝有引物的小室22中含有陽(yáng)性對(duì)照DNA的擴(kuò)增引物 4yL(購(gòu)自榮研生物科技有限公司，貨號(hào)為slp204)，上述LAMP系統(tǒng)作為陽(yáng)性對(duì)照LAMP系 統(tǒng)。
[0029] 每一個(gè)LAMP系統(tǒng)中：裝有BstDNA聚合酶的小室23中含有1yLBstDNA聚合酶 (8U) 〇
[0030] 所述樣本入口 181和廢液出口 182可以是任何形狀。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中， 樣本入口 181和廢液出口 182橫截面是圓形，直徑是0. 75mm。
[0031] 本發(fā)明使用氯化錳和鈣黃綠素作為顯色劑，顯色原理在于：首先，鈣黃綠素的熒光 被體系中的錳離子淬滅，基因擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂置換出鈣黃綠素結(jié)合的錳 離子，產(chǎn)生鈣黃綠素鎂，發(fā)出肉眼可見的綠色熒光。
[0032] 本發(fā)明還提供了上述微流控芯片的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：
[0033] (1)制備具有上述微流控芯片上的微通道和微結(jié)構(gòu)的SU-8陽(yáng)模；
[0034] (2)以步驟（1)制備的SU-8陽(yáng)模為模板，以PDMS為原料復(fù)制，然后將上下層PDMS 封接。
[0035] 步驟（1)的具體操作方法如下：首先，用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件Freehand設(shè)計(jì) 微流控芯片的微通道與微結(jié)構(gòu)；其次，將Freehand繪制的芯片構(gòu)道圖打印在SU-8膠 (Microchem，型號(hào)為2075)作為掩模，采用標(biāo)準(zhǔn)光刻工藝制作模具，獲得SU-8陽(yáng)模。
[0036]Su-8光刻技術(shù)：新型的化學(xué)增幅型負(fù)像SU-8光刻膠克服了普通光刻膠采用UV光 刻深寬比不足的問題，十分適合于制備高深寬比微結(jié)構(gòu)，因此SU-8膠是一種負(fù)性、環(huán)氧樹 脂型、近紫外線光刻膠。它在近紫外光（365nm-400nm)范圍內(nèi)光吸收度很低，且整個(gè)光刻膠 層所獲得的曝光量均勻一致，可得到具有垂直側(cè)壁和高深寬比的厚膜圖形；它還具有良好 的力學(xué)性能、抗化學(xué)腐蝕性和熱穩(wěn)定性；SU-8在受到紫外輻射后發(fā)生交聯(lián)，是一種化學(xué)擴(kuò) 大負(fù)性膠，可以形成臺(tái)階等結(jié)構(gòu)復(fù)雜的圖形；且SU-8膠不導(dǎo)電，在電鍍時(shí)可以直接作為絕 緣體使用。由于它具有較多優(yōu)點(diǎn)，SU-8膠正被逐漸應(yīng)用于MFMS、芯片封裝和微加工等領(lǐng)域。 直接采用SU-8光刻膠來(lái)制備深寬比高的微結(jié)構(gòu)與微零件是微加工領(lǐng)域的一項(xiàng)新技術(shù)。
[0037] 步驟⑵的具體操作方法如下：
[0038]a、將PDMS(DowCorning，貨號(hào)為0007883528)和固化劑按質(zhì)量比10 :1混勻，在真 空干燥箱中抽氣，傾倒在模具表面，80°C烘烤lh后取出；
[0039] b、冷卻后緩慢將PDMS在模板上撕下，在PDMS基片相應(yīng)位置鉆出進(jìn)樣孔、廢液孔， 然后切割成合適的大小；
[0040] c、將上下兩層PDMS基片放入等離子清洗機(jī)真空轟擊lmin，然后迅速在下層PDMS 基片裝載各個(gè)反應(yīng)試劑和玻璃粉，然后迅速將兩層PDMS對(duì)齊，進(jìn)行不可逆的結(jié)合；
[0041] d、用夾子夾住反應(yīng)試劑儲(chǔ)存小室周邊通道，避免樣品的混合。
[0042] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，驗(yàn)證制備的微流控芯片的效果采用如下方法：
[0043] (1)細(xì)胞收集與裂解
[0044] 取匯合度為80% -90%的H1975 (該細(xì)胞基因組上EGFP基因21號(hào)外顯子存在T>C 的點(diǎn)突變）和陰性對(duì)照人類肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549各一瓶，用PBS沖洗后，分別加入1. 5mL的 DNAiso試劑（Takara)，輕輕搖晃細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
[0045] (2)樣本DNA上EGFP基因21號(hào)外顯子點(diǎn)突變T>C的檢測(cè)
[0046] a、用注射器將含有細(xì)胞碎片的裂解液吸出，注入制備的微流控芯片中，靜置數(shù)分 鐘，使細(xì)胞裂解釋放的核酸吸附到玻璃粉表面，然后用注射器在樣本入口處注入空氣，使混 合液通過(guò)廢液出口排除；
[0047]b、打開儲(chǔ)存LAMP反應(yīng)試劑小室兩邊的夾子，擠壓氣囊，使所有LAMP反應(yīng)試劑進(jìn)入 LAMP反應(yīng)室；用夾子夾住反應(yīng)室周邊的通道，使反應(yīng)與外界空氣隔離，防止空氣污染；
[0048] c、將微流控芯片放入65°C恒溫裝置中，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；
[0049] d、25-30min后，觀察擴(kuò)增后反應(yīng)液的顏色。突變的細(xì)胞系H1975裂解擴(kuò)增反應(yīng)后 為綠色，未突變的細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞裂解擴(kuò)增反應(yīng)后依然為黃色。
[0050] 本發(fā)明還提供了即時(shí)檢測(cè)EGFR突變的方法，所述方法如下所示：
[0051] (1)制備含有DNA的裂解液；
[0052] (2)將步驟⑴制備的裂解液注入微流控芯片的LAMP反應(yīng)室15中，提取DNA;
[0053] (3)去除儲(chǔ)存反應(yīng)試劑的小室周圍的夾子，將所述反應(yīng)試劑分別送入微流控芯片 的LAMP反應(yīng)室中；
[0054] (4)將經(jīng)過(guò)步驟（3)處理的微流控芯片放入65°C恒溫裝置中，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；
[0055] (5)判斷擴(kuò)增后反應(yīng)液的顏色，如果反應(yīng)液呈綠色，則檢測(cè)樣本DNA上EGFR基因 21號(hào)外顯子存在T>C的突變；如果反應(yīng)液呈黃色，則檢測(cè)樣本DNA上EGFR基因21號(hào)外顯 子不存在T>C的突變。
[0056] 本發(fā)明還提供了上述微流控芯片在檢測(cè)未知樣本EGFR基因21號(hào)外顯子上T>C點(diǎn) 突變中的應(yīng)用。
[0057] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0058] (1)本發(fā)明的微流控芯片使用玻璃粉一步法提取純化樣本DNA，避免了使用離心 機(jī)經(jīng)過(guò)多步洗脫的復(fù)雜程序；本發(fā)明的微流控芯片采用即時(shí)檢測(cè)的反應(yīng)系統(tǒng)，避免了使用 PCR儀經(jīng)過(guò)不同溫度反應(yīng)的循環(huán)過(guò)程；本發(fā)明的微流控芯片操作方便、簡(jiǎn)單、快速。
[0059] (2)本發(fā)明的微流控芯片集核酸提取、LAMP擴(kuò)增、即時(shí)檢測(cè)為一體，方便了實(shí)驗(yàn)操 作，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
[0060] (3)本發(fā)明的微流控芯片將LAMP反應(yīng)試劑分類放置于不同的儲(chǔ)存小室中，避免了 試劑之間的污染。
[0061] (4)本發(fā)明的微流控芯片設(shè)置了三個(gè)平行系統(tǒng)，可以同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照 組、陽(yáng)性對(duì)照組的檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0062] 圖1顯示本發(fā)明的微流控芯片整體結(jié)構(gòu)的側(cè)視圖；
[0063] 圖2顯示本發(fā)明的微流控芯片整體結(jié)構(gòu)的俯視圖；
[0064] 圖3顯示本發(fā)明的微流控芯片的上層結(jié)構(gòu)；
[0065] 圖4顯示本發(fā)明的微流控芯片的下層結(jié)構(gòu)；
[0066] 圖5顯示本發(fā)明的微流控芯片中微柱的結(jié)構(gòu)；
[0067] 圖6顯示本發(fā)明的微流控芯片中微縫的結(jié)構(gòu)；
[0068] 其中，1:上層基片；11:氣囊小室；111:微柱；16、17、18:氣體通道；19:微縫； 181 :樣本入口；182 :廢液出口；2 :下層基片；21 :裝有恒溫?cái)U(kuò)增緩沖液的小室；22 :裝有引 物的小室；23 :裝有BstDNA聚合酶的小室。
【具體實(shí)施方式】
[0069] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0070] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照制造廠商所建議的條件。
[0071] 下列實(shí)施例中未注明來(lái)源的實(shí)驗(yàn)試劑，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0072] 實(shí)施例1一種微流控芯片
[0073] 微流控芯片是由上層基片1和下層基片2鍵合而成的一個(gè)密閉整體；微流控芯片 上設(shè)有三個(gè)相同且彼此獨(dú)立的L