專利名稱：：抗病毒抗性突變的檢測和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大體上涉及對特定試劑表現(xiàn)出減少的敏感性和/或表現(xiàn)出與免疫反應(yīng)試劑的減少的相互作用活性的病毒變體。更特別地，本發(fā)明針對乙型肝炎病毒(HBV)變體，其對核苷或核苷酸類似物表現(xiàn)出完全的或部分的抗性，和/或表現(xiàn)出與針對病毒表面成分的抗體的減少的相互作用活性，包括對這些抗體的減少的敏感性。這里也考慮疫苗和診斷性化驗。
背景技術(shù)：
：本說明書中所引用出版物的文獻(xiàn)目錄細(xì)節(jié)也收集于本說明書的末尾。本說明書所引用的任何現(xiàn)有技術(shù)不是也不應(yīng)該被認(rèn)為是承認(rèn)或以任何形式來建議該現(xiàn)有技術(shù)為任何國家的公知常識。乙型肝炎病毒(HBV)能引起衰竭性疾病(debilitatingdisease)病況并可導(dǎo)致急性肝臟衰竭。HBV是DNA病毒，其通過RNA中間體進(jìn)行復(fù)制且在其復(fù)制策略中采用逆轉(zhuǎn)錄(Summers和Mason,Ce〃29:403-415,1982)。HBV基因組為具有部分雙鏈DNA結(jié)構(gòu)的復(fù)雜本態(tài)，部分雙鏈DNA結(jié)構(gòu)具有編碼表面、核心、聚合酶和X基因的交迭讀碼框。在圖1中顯示HBV基因組的復(fù)雜本態(tài)。聚合酶由四個功能區(qū)組成末端蛋白(TP)、間隔體(spacer)、逆轉(zhuǎn)錄酶(rt)和核糖核酸酶(RNAse)。HBV的聚合酶基因與被膜(envel叩e)基因交迭，聚合酶基因的催化結(jié)構(gòu)域也能影響核苷酸和所形成的被膜蛋白的氨基酸序列，反之亦然。特別地，HBV的中和結(jié)構(gòu)域的遺傳序列(稱為"a"決定簇，發(fā)現(xiàn)其處于HBsAg內(nèi)，位于99至169位氨基酸之間)，實際上與病毒聚合酶蛋白的主要催化區(qū)域特別是A和B結(jié)構(gòu)域交迭。HBV的DNA聚合酶的存在已引起建議，即核苷或核苷酸類似物可作為有效的抗病毒試劑。如今所測試的核苷或核苷酸類似物的例子為噴昔洛韋(pendclcwir)及其口服形式(FCV)[VereHodge,j"http://v/ra/C/zewC/ze附o^r67-84,1993;Boyd等人，j"riv/ra/C/^/wC/^wof//^32:358-363,1987;Kruger等人，",219A,1994;Main等人，J.Wra/鄉(xiāng)"船丄.211-215,1996]，拉米夫定(Lamivudine)[(-)-卩-2'-脫氧-3'-硫代胞苷];(3TC或LMV)[Severini等人，爿w/z'w/crc^/a/^gewts'C/^/'"C力er3義'430-435,1995;Dienstag等人，yVew￡>7g/an<iJAfeJ1657-1661,1995]。己經(jīng)進(jìn)入臨床試驗的新的核苷或核苷酸類似物包括嘧啶恩曲他濱(Emtricitabine)[(-)-P-L-2'-3'-雙脫氧-5-氟-3'-硫代胞苷；FTC]，其為3TC的5-氟衍生物和克來夫定(Clevudine)[l-(2-氟-5-甲基-p-L-arabino-furanosyl)尿嘧啶；L-FMAU]，其為一種胸苷類似物。(3-L胸苷類似物(LdT)最近已獲得FDA通過，其他的類似化合物包括卩-L-2'-脫氧胞苷(LdC)和卩-L-2'-脫氧腺苷(LdA)[Standring等人,爿"ft'vzVC/wmC/^附oAe/:，0/;USw;p/丄'/"-2巧。像3TC—樣，這些是帶有非天然的"L"構(gòu)型的嘧啶衍生物。幾個嘌呤衍生物也已進(jìn)入臨床試驗；它們包括恩替卡韋(Entecavir)(BMS-200,475;ETV)，其為碳環(huán)形脫氧鳥苷類似物；二氨基嘌呤二氧戊垸(diaminopurinedioxalone)(DAPD)，其為二氧戊烷鳥嘌呤(dioxolaneguanine)[(-)-p-D-2-氨基嘌呤二氧戊烷；DXG]的可用口服前藥，和阿德福韋酯(Adefovirdipivoxil)，其為非環(huán)化單磷酸脫氧腺苷核苷或核苷酸類似物阿德福韋(Adefovir)(9-[膦?；?甲氧基乙基]-腺嘌呤；PMEA)的口服前藥。其他的臨床前和臨床試驗中的藥物包括FLG[Medivir]、ACH-126,443(L-d4C)[Arc謹(jǐn)onPharmaceuticals]、ICN2001-3(ICN)和Racivir(RCV)[Ph纖assett]。雖然這些試劑高效地抑制HBV的DNA合成，在長期抗病毒化療中需要出現(xiàn)抗性的HBV突變體。在接受延長的LMV治療的病人中，在rt結(jié)構(gòu)域中聚合酶內(nèi)在rtM204I/V+/-rtL180M以及其他的突變中選擇重要抗性突變。用于聚合酶突變的命名法與Stuyver等人2001(見上)所建議的一致。LMV是已經(jīng)被批準(zhǔn)用于抵抗慢性HBV感染的核苷或核苷酸類似物丄MV是HBV復(fù)制的特別有力的抑制劑，在原位肝移植(OLT)之后的慢性感染病人的血清中通過抑制病毒DNA的合成來減少HBV的DNA效價。LMV單一治療似乎不能長期控制HBV的復(fù)制。這是由于HBV的LMV抗性株的出現(xiàn)在單一治療中似乎是幾乎不可避免的。阿德福韋酯(ADV;舊稱bis-pomPMEA)是非環(huán)化單磷酸脫氧腺苷類似物阿德福韋(Adefovir)(舊稱PMEA)的可口服前藥(圖2)。ADV也是HBV復(fù)制的有力抑制劑，已被FDA通過可用于抵抗慢性HBV感染。阿德福韋酯與本類中的其他試劑不用的是它是核苷酸類似物:(相對于核苷類似物)，因此在藥物激活中越過第一次磷酸化反應(yīng)。這個歩驟通常是限速性的。已證明阿德福韋酯對野生型和拉米夫定抗性HBV株都有臨床活性，目前在臨床III期試驗(Gilson等人JWra///印a/16:387-395,1999;Perrillo等人，i/印flto/ogy32:129-134，2000;Peters等人，rra朋p/朋toriw6S:1912-1914,1999;Benhamou等人，丄朋c"35S..718-723,2001)。在II期研究中，阿德福韋酯每日30mg的劑量在病毒血癥中在12周之內(nèi)引起平均4logio的減少(Heathcote等人，i/印ato/ogy25/A620,1998)。ADV是取代的非環(huán)化單磷酸核苷。這類化合物也包括富馬酸泰諾福韋酯(tenofovirdis叩roxilfumarate)(也稱為泰諾福韋DF或泰諾福韋或(TFV)或9-R-(2-膦酰基甲氧基丙基)腺嘌呤(PMPA)，被Gileadsciences標(biāo)為替諾福韋(Viread"。TFV具有同時針對HBV禾卩HIV的抗病毒活性(Ying等人，/Wra///印W70:161-165,2000;Ying等人，乂Wra///e;"f.7(7):79-83,2000,Suo等人，J所o/27，人27250-27258.1998)。FTC具有針對HBV和HIV的活性(Frikc等人，^油'm/cra6Jgw"CfemW/^37,2285-2292,1993)。LdT、LdC和LdA具有針對HBV的活性(Stanching等人，見上)。核苷或核苷酸類似物治療可作為單一治療或組合治療(其中使用兩個或兩個以上核苷或核苷酸類似物)來使用。核苷或核苷酸類似物也可與其他的抗病毒試劑例如干擾素或乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)組合來使用。業(yè)界有監(jiān)視核苷/核苷酸類似物或抗體抗性的HBV株的出現(xiàn)的需要，和發(fā)展診斷程序來檢測這些抗性病毒和/或使用它們來篩選和/或發(fā)展或設(shè)計具有特性(該特性能使其用作抗病毒試劑)的試劑的需要。這些抗性株的缺陷型形式或由其而來的抗原性成分也被建議用于發(fā)展治療性疫苗組合物，如針對病毒表面成分的抗體。
發(fā)明內(nèi)容在本說明書的通篇，除非上下文需要，否則詞語"包含(comprise)"或變體例如"包含(comprises)"或"包含(comprising)"將被理解為意味著包括所述元素或整體或者元素或整體的組，但是不排除任何其他元素或整體或者元素或整體的組。核苷酸和氨基酸序列由序列標(biāo)識符編號(SEQIDNO:)來指稱。SEQIDNO:在數(shù)字上對應(yīng)于序列標(biāo)識符<400>1(SEQIDNO:l),<400>2(SEQIDNO:2)等。在表1中提供序列標(biāo)識符總結(jié)。在權(quán)利要求后提供序列表。氨基酸序列中的特定突變在這里由"X叫nXaa2"代表，其中Xaai是突變前的原始氨基酸殘基，n是殘基號碼，Xaa2是突變的氨基酸?？s寫"Xaa"可以是三字符或單字符(即"X")代碼。"XaamXaa2"前面的"rt"意思是"逆轉(zhuǎn)錄酶"。"s"意思是被膜(envelope)基因。HBV的DNA聚合酶的氨基酸殘基這樣編號基序TyrMetAspAsp(YMDD)中的蛋氨酸殘基編號為204號殘基(Stuyver等人，份，to/ogy33:751-757,2001)。乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸殘基根據(jù)Norder等人UGe".Wra/.7(341-1348,1993)來編號。單字符和三字符縮寫均用于定義氨基酸殘基并于在表2中總結(jié)。在接受包括核苷和核苷酸類似物(包括TFV禾Q/或LMV，或者LMV和/或ADV和/或ETV)的抗病毒試劑治療的慢性HBV感染病人中鑒定HBV變體的選擇。因此，考慮HBVrt變體，其對抗病毒試劑為抗性或?qū)共《驹噭┍憩F(xiàn)出減少的敏感性，所述抗病毒試劑包括核苷和核苷酸類似物，包括ADV、LMV、TFV、ETV或FTC或LdT;ADV禾BLMV;ADV禾卩TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC禾口LMV;ETV禾口ADV;ETV禾口LMV;ETV禾口FTC;ETV禾口TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV禾口TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他的抗HBV試劑或其組合。表面抗原也發(fā)生相應(yīng)的突變。對這些HBV變體的鑒定是重要的，可用于發(fā)展化驗方法來監(jiān)視ADV、LMV、FTC、TFV、LdT禾口/或ETV抗性禾口/或?qū)ζ渌塑栈蚝塑账犷愃莆锘蚱渌目笻BV試劑或其組合的抗性，以及篩選可用作替代性治療試劑的試劑。這里所提及的"抗HBV試劑"包括抑制或干擾病毒的復(fù)制、維持、感染、組裝或釋放的核苷和核苷酸類似物以及免疫反應(yīng)試劑(例如針對HBV表面成分的抗體)和化學(xué)的、蛋白質(zhì)的和核酸試劑。對這樣的HBV變體的檢測對于管理治療程序(包括選擇合適的用于治療HBV感染的試劑)來說是特別重要的。本發(fā)明這個方面的方法部分預(yù)期監(jiān)視(在核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合存在的情況下)個體中HBV載量的增加的發(fā)展。臨床醫(yī)生然后可以調(diào)整已存在的治療程序或者相應(yīng)地選擇合適的治療程序。相應(yīng)地，一個方面針對于分離的乙型肝炎病毒(HBV)變體，其中所述變體包含編碼DNA聚合酶的基因中的核苷酸突變，這導(dǎo)致對于所述DNA聚合酶來說至少一個氨基酸的增加、取代和/或缺失，且其中所述變體對一種或多種核苷或核苷酸類似物表現(xiàn)出減少的敏感性，所述核苷或核苷酸類似物選自ADV、LMV、TFV、ETV、LdT或FTC;ADV禾口LMV;ADV禾口TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC禾卩LMV;ETV禾卩ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV禾口TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV禾PETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合。HBV變體在由一個或多個的HBVDNA聚合酶的F和G結(jié)構(gòu)域和A至E結(jié)構(gòu)域所定義的區(qū)域中，在其基因組的交迭開放讀碼框中包含突變。另一個方面提供分離的HBV變體，在S基因中包含核苷酸突變，這導(dǎo)致對于表面抗原來說至少一個氨基酸的增加、取代和/或缺失，且該變體對一種或多種核苷或核苷酸類似物表現(xiàn)出減少的敏感性，所述核苷或核苷酸類似物選自ADV、LMV、TFV、ETV或LdT或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC禾nADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV禾卩ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV禾nTFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV禾口FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合。rt區(qū)域的有用的突變包括，在一個具體實施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W,在另一個具體實施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一個具體實施方式中包括rtQ2l5S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一個具體實施方式中包括rtNll8S、rtRl20R、rtTl84A和rtY257H，或另一個具體實施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtl233T/1、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一個具體實施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtl254I/F，或另一個具體實施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一個具體實施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一個具體實施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一個具體實施方式中包括rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtl253V，或其組合或等價的突變。特別有用的突變?yōu)樵诿艽a子180、184和204處的共同突變，例如rtL180M和rtT184S和rtM204V，或在密碼子85、180、184、202、204和236處的共同突變，例如rtS85T、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V和rtN236I/D/V。這里考慮的替代的有用的突變包括rtP170H、rtT184A、rtY221H/Y、rtl233T/1、rtT240N/T、rtK241R、rtR242K/R、rtW243R/W、rtl253V、rtl254I/F、rtS256R/S、rtW257G/W、rtY257H或在密碼子239處的突變。在這里建議rtN236T區(qū)域的位于推定的三磷酸結(jié)合位點處的突變對于針對ADV和/或TFV和/或其他核苷或核苷酸的治療來說是重要的。除密碼子236外重要的密碼子包括高度保守的密碼子239和密碼子240、241、242和243。在一個特別的具體實施方式中，提供分離的乙型肝炎病毒(HBV)變體，其中所述變體在編碼DNA聚合酶的基因處包含核苷酸突變，突變導(dǎo)致對所述DNA聚合酶來說至少一個氨基酸的增加、取代和/或缺失，其中突變選自(i)密碼子239、240、241、242禾口/或243處的突變;(ii)導(dǎo)致N236I/D/V取代的突變；(iii)導(dǎo)致S246H/P/Y/S取代的突變；(iv)導(dǎo)致P170H取代的突變；(v)導(dǎo)致I253V取代的突變；(vi)兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V或rtN236I/D/V;(vii)兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1或rtS246H/P/Y/S;或(viii)兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V或rtl253V;其中HBV變體對核苷或核苷酸類似物表現(xiàn)出減少的敏感性。S基因內(nèi)的有用的突變包括，在一個具體實施方式中包括sI92T/1、sL175F和sI195M，在另一個具體實施方式中包括sS207R，或另一個具體實施方式中包括sI110V和sP120Q,或另一個具體實施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一個具體實施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一個具體實施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一個具體實施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL1621和sU95M或其組合或等價的突變。特別有用的突變?yōu)閟I110V、sP120Q、sF134L/F、sL1621、sL173F、sL175F、sL176V和sP178P/L。進(jìn)一步考慮到確定HBV針對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV和ADV;ETV和LMV;ETV禾口FTC;ETV禾口TFV;ADV禾口LMV禾口TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合而表現(xiàn)出減少的敏感性的潛力的方法，該方法為從HBV中分離DNA或相應(yīng)的mRNA并篩選編碼HBV的DNA聚合酶的核苷酸序列中的突變，該突變導(dǎo)致在DNA聚合酶的任何一個或多個的F和G結(jié)構(gòu)域和A至E結(jié)構(gòu)域或其臨近區(qū)域內(nèi)的至少一個氨基酸的增加、取代和/或缺失并和針對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV禾卩LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV禾口ADV;ETV禾口LMV;ETV和FTC;ETV禾口TFV;ADV禾口LMV禾口TFV;或ADV禾nFTC禾nTFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV禾卩ETV禾QTFV;ETV禾卩LMV禾卩TFV;ADV禾卩LMV禾QFTC;ADV禾卩FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合的減少的敏感性相關(guān)聯(lián)。這樣的突變的存在是對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV禾QTFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC禾tlLMV;ETV禾口ADV;ETV禾QLMV;ETV和FTC;ETV禾QTFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合的可能的抗性的指征。同時提供組合物，其包含HBV變體以及藥物學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑，所述HBV變體對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC禾卩ADV;FTC禾口TFV;FTC和LMV;ETV和ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合或來自HBV變體的HBV表面抗原或其重組或衍生形式或其化學(xué)等價物呈抗性。另一個方面提供前述組合物或HBV變體在制備用于治療和/或預(yù)防乙型肝炎病毒感染的藥物中的用途，所述HBV變體包含編碼DNA聚合酶的基因中的核苷酸突變，這導(dǎo)致對于DNA聚合酶來說至少一個氨基酸的增加、取代和/或缺失并且導(dǎo)致對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC禾卩ADV;FTC和TFV;FTC禾。LMV;ETV禾nADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合的減少的敏感性。同時考慮確定HBV株是否對核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑表現(xiàn)出減少的敏感性的方法，該方法通過從HBV中分離DNA或相應(yīng)的mRNA并篩選編碼HBV的DNA聚合酶的核苷酸序列中的突變，其中rt區(qū)域中存在以下突變在一個具體實施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W,在另一個具體實施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一個具體實施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一個具體實施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一個具體實施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtl233T/1、rtT240N/T、rtK241R禾卩rtH248N，或另一個具體實施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtl254I/F，或另一個具體實施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一個具體實施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一個具體實施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一個具體實施方式中包括rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtl253V，或其組合或等價的一個或多個其他突變，這些突變的存在可作為對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV禾口TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV禾卩ADV;ETV禾口LMV;ETV禾卩FTC;ETV禾卩TFV;ADV禾卩LMV禾卩TFV;或ADV禾卩FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合表現(xiàn)出減少的敏感性的變體的指征。另一個方法包括篩選編碼被膜基因的核苷酸序列中的突變，其中在s基因中存在以下突變在一個具體實施方式中包括sI92T/1、sL175F和sI195M，在另一個具體實施方式中包括sS207R，或另一個具體實施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一個具體實施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一個具體實施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一個具體實施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一個具體實施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL1621和sI195M或其組合或等價的一個或多個其他的突變，這些突變的存在可作為對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或ETC;ADV禾卩LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC禾nLMV;ETV禾卩ADV;ETV和LMV;ETV禾QFTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV禾BLMV禾nFTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合表現(xiàn)出減少的敏感性的變體的指征。在一個特別的具體實施方式中，變體為分離的形式，以致除了體液中天然發(fā)生的步驟以外，它們已經(jīng)進(jìn)行了至少一個純化步驟?；蛘撸凅w可保持在分離的體液中或者可以是DNA形式。本發(fā)明也考慮到感染的分子克隆，其包含來自HBV變體的基因組或其部分。對細(xì)胞、細(xì)胞裂解物、培養(yǎng)物上清液和體液中的HBV或其成分的檢測可以是任何常規(guī)的方法，包括任何基于核酸的檢測方法，例如，通過核酸雜交技術(shù)或通過一個或多個聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。術(shù)語"體液"包括任何源自血液、淋巴、組織或器官系統(tǒng)的液體，包括血清、全血、活組織檢査(biopsy)和活組織檢查液、器官移植和器官懸液例如肝懸液。另一個方面針對HBV變體，其與來自參考或野生型HBV的表面抗原相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中針對參考或野生型HBV的表面抗原而產(chǎn)生的抗體相對于該HBV變體表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜(immunologicalprofile)。一種改變的圖譜包括中和HBV的能力減少。更特別地，HBV變體的表面抗原相對于經(jīng)預(yù)處理的HBV表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中該HBV抗體通過核苷或核苷酸類似物或其他的HBVDNA聚合酶的抗HBV試劑來選擇。本發(fā)明的這個方面的HBV變體也可包含核苷酸序列，該核苷酸序列相對于經(jīng)預(yù)處理的HBV，包含單個或多個核苷酸取代、增加和/或去除。進(jìn)一歩考慮的是用于檢測表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜的HBV變體的方法，所述方法包括從暴露于核苷或核苷酸類似物或類似物組合的個體中分離HBV，核苷或核苷酸類似物或類似物組合選自ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV和ADV;ETV禾卩LMV;ETV禾卩FTC;ETV禾卩TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合，然后將所述HBV與一組一種或多種針對表面抗原的抗體接觸并篩選任何結(jié)合親和力或結(jié)合頻譜上的變化。在一個相關(guān)的方面，提供檢測表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜的HBV變體的方法，所述方法包括從暴露于核苷或核苷酸類似物的個體中分離血清樣品，核苷或核苷酸類似物選自ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV禾QLMV;ADV和TFV;LMV禾QTFV;FTC禾QADV;FTC和TFV;FTC禾PLMV;ETV禾tlADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合，然后將該血清與一組HBV表面抗原或其抗體結(jié)合片段接觸并篩選任何結(jié)合親和力或結(jié)合頻譜上的變化。對應(yīng)于HBV變體，提供分離的HBsAg或其重組形式或其衍生物或其化學(xué)等價物。通常，HBsAg或其重組或衍生物形式或其化學(xué)等價物相對于來自參考HBV的HBsAg來說，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列，且其中針對參考HBV的抗體對攜帶所述HBsAg變體的HBV表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜。在一個具體實施方式中，該改變的免疫學(xué)圖譜包含中和HBV變體的能力減少。另一個方面考慮檢測對HBV表現(xiàn)出抑制活性的試劑的方法，該方法為產(chǎn)生遺傳構(gòu)建體，其在質(zhì)粒載體中包含復(fù)制能力有效量的來自HBV的基因組，然后用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前、中和/或后將待測試劑與所述細(xì)胞接觸，將細(xì)胞在足以允許HBV復(fù)制的條件下培養(yǎng)足以允許HBV復(fù)制的時間，如果對所述試劑呈抗性，則表達(dá)遺傳序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；將細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)物上清液置于病毒或病毒成分檢測器，以確定在該試劑存在的情況下，病毒是否已經(jīng)復(fù)制、表達(dá)遺傳材料和/或組裝和/或被釋放。在一個優(yōu)選的具體實施方式中，質(zhì)粒載體為桿狀病毒屬載體且該方法包含產(chǎn)生遺傳構(gòu)建體，其包含復(fù)制能力有效量的來自HBV的基因組(包含于或融合至能有效感染細(xì)胞的數(shù)量的桿狀病毒屬的基因組)，然后用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，在感染前、中和/或后將待測試劑與該細(xì)胞接觸，將細(xì)胞在足以允許HBV復(fù)制的條件下培養(yǎng)足以允許HBV復(fù)制的時間，如果對所述試劑呈抗性，則表達(dá)遺傳序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；然后將細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)物上清液置于病毒或病毒成分檢測器，以確定在該試劑存在的情況下，病毒是否己經(jīng)復(fù)制、表達(dá)遺傳材料和/或組裝和/或被釋放。與這些方法相關(guān)，質(zhì)粒載體可包括編碼部分或全部其他病毒載體例如桿狀病毒屬載體或腺病毒載體)的基因(參見Ren和Nassal,乂腸/.7柳1104-1116,2001。在一個替代的具體實施方式中，方法包含產(chǎn)生持續(xù)細(xì)胞系，其包含復(fù)制能力有效量的HBV基因組的有感染性的拷貝(以使所述感染性HBV基因組被穩(wěn)定地整合進(jìn)入所述持續(xù)細(xì)胞系，例如但不限于，2.2.15或AD細(xì)胞系)，將待測試劑與細(xì)胞接觸，將細(xì)胞在足以允許HBV復(fù)制的條件下培養(yǎng)足以允許HBV復(fù)制的時間，如果對所述試劑呈抗性，則表達(dá)遺傳序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；然后將細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)物上清液置于病毒或病毒成分檢測器，以確定在該試劑存在的情況下，病毒是否已經(jīng)復(fù)制、表達(dá)遺傳材料和/或組裝和/或被釋放。在一個替代的具體實施方式中，考慮用于檢測試劑的方法，該試劑在體外聚合酶測試中對HBV聚合酶表現(xiàn)出抑'制活性。HBV聚合酶活性可使用已建立的方法來檢領(lǐng)KGaillard等人，J油'冊'cra6Jge"teC/zemo^^4;:1005-1013,2002;Xiong等人，i/印flto/ogv,2SC6力1669-73,1998)。HBV聚合酶可以是野生型或參考HBV聚合酶或突變的HBV聚合酶。對病毒變體的鑒定使得能夠生產(chǎn)包含特別的重組病毒成分例如聚合酶或被膜基因PreSl、PreS2，編碼L、M、S蛋白的S的疫苗，以及包含缺陷型HBV變體的治療性疫苗。也可使用合理的藥物設(shè)計來鑒定或產(chǎn)生治療性分子，其能夠與聚合酶或被膜基因PreSl、PreS2，編碼L、M、S蛋白的S或HBV的其他成分進(jìn)行相互作用。這樣的藥物也可具有診斷性潛力。而且，缺陷型HBV變體也可用作治療性組合物以產(chǎn)生針對同樣的、類似的或同源病毒的免疫反應(yīng)?；蛘撸槍BV變體或其表面成分而產(chǎn)生的抗體可用于個體的被動免疫以抵抗HBV變體或類似的或同源病毒所引起的感染。而且，本發(fā)明考慮試劑(例如核苷或核苷酸類似物、RNAi或siRNA分子(源自DNA的或合成的)、反義或正義寡核苷酸、化學(xué)的或蛋白質(zhì)的分子)，其具有下調(diào)HBV成分活性的能力并抑制復(fù)制、保持、感染、組裝或釋放。在表3中提供本說明書所用的縮寫總結(jié)。在表1中提供本說明書所用的序列標(biāo)識符的總結(jié)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>SEQUENCEIDNO:描述14抗性HBV病人C的被膜基因的推定氨基酸序列15來自抗性HBV病人D的聚合酶的催化區(qū)域的核苷酸序列16抗性HBV病人D的聚合酶的催化區(qū)域的推定氨基酸序列17抗性HBV病人D的被膜基因的推定氨基酸序列18來自抗性HBV病人E的聚合酶的催化區(qū)域的核苷酸序列19抗性HBV病人E的聚合酶的催化區(qū)域的推定氨基酸序列20抗性HBV病人E的被膜基因的推定氨基酸序列21來自抗性HBV病人F的聚合酶的催化區(qū)域的核苷酸序列22抗性HBV病人F的聚合酶的催化區(qū)域的推定氨基酸序列23來自抗性HBV病人F的被膜基因的推定氨基酸序列24來自抗性HBV病人G的聚合酶的催化區(qū)域的核苷酸序列25抗性HBV病人G的聚合酶的催化區(qū)域的推定氨基酸序列26來自抗性HBV病人G的被膜基因的推定氨基酸序列表2賓基,銀，単字,浙三字存氨基酸三字符縮寫單字符縮寫丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬酰胺AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酰胺GinQ谷氨酸GluE甘氨酸GlyG組氨酸HisH異亮氨酸lieI亮氨酸LeuL賴氨酸LysK蛋氨酸MetM18<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>_指定為逆轉(zhuǎn)錄酶的第204號殘基圖1是圖表性示意圖，顯示部分雙鏈的DNAHBV基因組，該HBV基因組顯示出編碼表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X基因的交迭開放讀碼框。圖2是ADV的化學(xué)結(jié)構(gòu)的圖表性示意圖。圖3是泰諾福韋的化學(xué)結(jié)構(gòu)的圖表性示意圖。圖4為顯示來自病人A的樣品中編碼聚合酶基因的催化區(qū)域的HBV核苷酸序列的比較的示意圖。圖5為顯示來自病人A的樣品中聚合酶基因的催化區(qū)域的推定氨基酸序列的比較的示意圖。圖6為顯示來自病人A的樣品中被膜基因推定氨基酸序列的比較的示意圖。圖7為顯示來自病人B的樣品中編碼聚合酶基因的催化區(qū)域的HBV核苷酸序列的比較的示意圖。圖8為顯示來自病人B的樣品中聚合酶基因的催化區(qū)域的推定氨基酸序列的比較的示意圖。圖9為顯示來自病人B的樣品中被膜基因推定氨基酸序列的比較的示意圖。圖10為來自病人C的樣品中編碼聚合酶基因的催化區(qū)域的HBV核苷酸序列的示意圖。圖11為來自病人C的樣品中聚合酶基因的催化區(qū)域的推定氨基酸序列的示意圖。圖12為來自病人C的樣品中被膜基因推定氨基酸序列的示意圖。圖13為來自病人D的樣品中編碼聚合酶基因的催化區(qū)域的HBV核苷酸序列的示意圖。圖14為來自病人D的樣品中聚合酶基因的催化區(qū)域的推定氨基酸序列的示意圖。圖15為來自病人D的樣品中被膜基因推定氨基酸序列的示意圖。圖16為來自病人E的樣品中編碼聚合酶基因的催化區(qū)域的HBV核苷酸序列的示意圖。圖17為來自病人E的樣品中聚合酶基因的催化區(qū)域的推定氨基酸序列的示意圖。圖18為來自病人E的樣品中被膜基因推定氨基酸序列的示意圖。圖19為來自病人F的樣品中編碼聚合酶基因的催化區(qū)域的HBV核苷酸序列的示意圖。圖20為來自病人F的樣品中聚合酶基因的催化區(qū)域的推定氨基酸序列的示意圖。圖21為來自病人F的樣品中被膜基因推定氨基酸序列的示意圖。圖22為來自病人G的樣品中編碼聚合酶基因的催化區(qū)域的HBV核苷酸序列的示意圖。圖23為來自病人G的樣品中聚合酶基因的催化區(qū)域的推定氨基酸序列的示意圖。圖24為來自病人G的樣品中被膜基因推定氨基酸序列的示意圖。圖25為來自病人H的樣品中編碼聚合酶基因的催化區(qū)域的HBV核苷酸序列的示意圖。圖26為來自病人H的樣品中聚合酶基因的催化區(qū)域的推定氨基酸序列的示意圖。圖27為來自病人H的樣品中被膜基因推定氨基酸序列的示意圖。圖28為來自病人I的樣品中編碼聚合酶基因的催化區(qū)域的HBV核苷酸序列的示意圖。圖29為來自病人I的樣品中聚合酶基因的催化區(qū)域的推定氨基酸序列的示意圖。圖30為來自病人I的樣品中被膜基因推定氨基酸序列的示意圖。發(fā)明詳述本發(fā)明部分預(yù)期，在病人接受ADV或LMV或ETV或更特別地，ADV和LMV或TFV和LMV，或ETV和任選的一種或多種核苷類似物或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑例如TFV、LdT或FTC治療之后，對核苷或核苷酸類似物呈抗性的HBV變體的鑒定和分離。特別地，經(jīng)ADV或ADV和LMV或ETV治療的病人產(chǎn)生X寸ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV禾卩LMV;ADV禾QTFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV和ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV禾口FTC禾QLMV;ADV禾nLMV禾QETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合表現(xiàn)出降低的或減少的敏感性的HBV變體。這里對于ADV禾口/或LMV禾口/或FTC禾口/或TFV禾口/或ETV的敏感性相關(guān)聯(lián)而引用的"降低的"或"減少的"包括并包含對核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑呈全部或?qū)嵸|(zhì)上的抗性以及部分的抗性，并包括(核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑存在的情況下)比野生型更高的復(fù)制速率或復(fù)制效率。在一個方面，通過治療中病毒載量(viralload)而方便地測定，或者，在治療中HBVDNA病毒載量沒有比預(yù)處理的HBVDNA水平實質(zhì)地降低(即，對治療無反應(yīng))。相應(yīng)地，一個方面考慮到分離的乙型肝炎病毒(HBV)變體，其中所述變體包含編碼DNA聚合酶的基因中的核苷酸突變，該突變導(dǎo)致對于所述DNA聚合酶來說至少一個氨基酸的增加、取代和/或缺失，且其中所述變體對一種或多種核苷或核苷酸類似物表現(xiàn)出減少的敏感性，所述核苷或核苷酸類似物選自ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC禾口TFV;FTC禾口LMV;ETV禾口ADV;ETV和LMV;ETV禾口FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合。另一個方面提供確定HBV針對核苷或核苷酸類似物(選自ADV、LMV、TFV、LdT、FTC和ETV或其組合或任選的其他核苷或核苷酸類似物)而表現(xiàn)出減少的敏感性的潛力的方法，所述方法包含從所述HBV中分離DNA或相應(yīng)的mRNA并篩選編碼HBV的DNA聚合酶的核苷酸序列中的突變，該突變導(dǎo)致在所述DNA聚合酶的任何一個或多個的F和G結(jié)構(gòu)域和A至E結(jié)構(gòu)域或其臨近區(qū)域內(nèi)的至少一個氨基酸的增加、取代和/或缺失并和針對一個或多個的ADV、LMV、TFV、FTC的抗性或〗咸少的敏感性相關(guān)，和/或其中這樣的突變的存在是對所述一個或多個的ADV、LMV、TFV、LdT、FTC禾口/或ETV的可能的抗性的指征。另一個方面提供分離的乙型肝炎病毒(HBV)變體，其中所述變體在編碼DNA聚合酶的基因處包含核苷酸突變，該突變導(dǎo)致對所述DNA聚合酶的至少一個氨基酸的增加、取代和/或缺失，其中突變選自(i)密碼子239、240、241、242和/或243處的突變;(ii)導(dǎo)致N236I/D/V取代的突變；(iii)導(dǎo)致S246H/P/Y/S取代的突變；(iv)導(dǎo)致P170H取代的突變(v)導(dǎo)致I253V取代的突變；(vi)兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V或rtN236I/D/V;(vii)兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1或rtS246H/P/Y/S;或(viii)兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V或rtl253V;其中HBV變體對核苷或核苷酸類似物表現(xiàn)出減少的敏感性。除非另有指明，本公開不限于成分的特定制劑、生產(chǎn)方法、給藥方案(dosageregimen)等，因為這些可變。也應(yīng)理解，這里所用的術(shù)語只是為了描述特定的具22體實施方式而不是為了限定。必須注意，除非上下文另外清楚說明，否則如本說明書所用的單數(shù)形式"a"、"an"和"the"包括復(fù)數(shù)方面。因此，例如，提及"核苷或核苷酸類似物"包括單一的類似物，以及兩個或兩個以上類似物；提及"HBV變體"包括提及兩個或兩個以上HBV變體；提及"本發(fā)明"包括提及本發(fā)明的單個或多個方面；等等。術(shù)語"類似物"、"化合物"、"活性試劑"、"藥理學(xué)上活性試劑"、"藥物(medicament)"、"活性的"和"藥物(drug)"在這里可相互替換地使用，用來指稱誘導(dǎo)所需效應(yīng)(例如抑制病毒復(fù)制、感染、維持、組裝和/或酶例如HBVDNA聚合酶的功能)的化學(xué)化合物。該術(shù)語也包括這里特別提及的那些活性試劑的藥學(xué)上和藥理學(xué)上的活性成分，包括但不限于鹽、酯、酰胺、前藥、活性代謝物、類似物等。當(dāng)使用術(shù)語"類似物"、"化合物"、"活性試劑"、"藥理學(xué)上活性試劑"、"藥物(medicament)"、"活性的"和"藥物(drug)"時，則應(yīng)該理解為包括活性試劑本身以及藥學(xué)上可接受的，藥理學(xué)上活性的鹽、酯、酰胺、前藥、代謝物、類似物等。因此，考慮可用于抑制病毒復(fù)制、感染、維持、組裝和/或酶例如HBVDNA聚合酶的功能的化合物。提及"類似物"、"化合物"、"活性試劑"、"藥理學(xué)上活性試劑"、"藥物(medicament)"、"活性的"禾Q"藥物(drug)"例如ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC禾卩TFV;FTC和LMV;ETV和ADV;ETV禾卩LMV;ETV禾QFTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合。"組合"也包括兩部分的或兩部分以上的例如多部分的抗HBV治療性組合物，其中分別提供試劑并分別給藥或分配，或者在分配之前混合在一起。如這里所用的術(shù)語試劑的"有效量"和"治療上有效量"意思是足以提供所需的治療性的或生理學(xué)上的效應(yīng)(抑制病毒復(fù)制、感染、維持、組裝和/或酶例如HBVDNA聚合酶的功能)的該試劑的量。此外，試劑的"有效的HBV抑制性的量"或"有效的癥狀改善性的量"是足以直接或間接抑制復(fù)制、感染、維持、組裝和/或酶例如HBVDNA聚合酶的功能的該試劑的量。不需要的效應(yīng)，例如副作用，有時候與所需要的治療性效應(yīng)一起表現(xiàn)；因此，從業(yè)者在確定什么是合適的"有效量"時對潛在的益處相對于潛在的風(fēng)險進(jìn)行平衡。所需的精確數(shù)量將在個體中有差異，取決于物種、年齡和個體的通常的狀況、給藥方式等。因此，不可能指定精確的"有效量"。但是，在任何個人情況下合適的"有效量"可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員只使用常規(guī)實驗來確定。"藥學(xué)上可接受的"載體、賦形劑或稀釋劑意思是由材料組成的藥學(xué)載體，該材料不是生物學(xué)或其他方面所不需要的，即該材料可與所選活性試劑一起向個體使用而不引起任何或?qū)嵸|(zhì)上的不利反應(yīng)。載體可包括賦形劑和其他的添加劑例如稀釋劑、去垢劑、著色劑、加濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、防腐劑等。類似地，如這里所提供的"藥理學(xué)上可接受的"鹽、S旨、酰胺、前藥或化合物的衍生物為不是生物學(xué)或其他方面所不需要的鹽、S旨、酰胺、前藥或衍生物。如這里所用的術(shù)語"治療(treating)"和"治療(treatment)"是指相對于HBV感染減輕癥狀的嚴(yán)重程度和/或頻率、消除癥狀和/或其起因、預(yù)防癥狀和/或其起因的發(fā)生以及改善或補(bǔ)救損傷。因此，例如，"治療"病人包括預(yù)防HBV感染以及通過抑制HBV復(fù)制、感染、維持、組裝和/或酶例如HBVDNA聚合酶的功能來治療臨床上有HBV癥狀的個體。因此，例如，本方法中的"治療"患有HBV感染或者具有發(fā)展傾向的病人的方法包括預(yù)防HBV感染以及治療HBV感染或其癥狀。在任何情況下，本發(fā)明考慮到HBV感染的治療或預(yù)防。如這里所用的"病人"是指動物，優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為靈長類包括低等靈長類，再更優(yōu)選為可從本發(fā)明的制劑和方法受益的人。不論是人類還是非人類動物，病人均可被稱為個體(individual)、個體(subject)、動物、宿主或接受者。本發(fā)明的化合物和方法在人類醫(yī)藥、獸醫(yī)醫(yī)藥以及一般的、家養(yǎng)或野生動物管理上具有用途。為了方便起見，"動物"包括鳥類種例如家禽鳥類(包括鴨、雞、火雞和鵝)，鳥舍中的鳥(aviarybird)或獵鳥(gamebird)。非人類動物中的病狀可能不是天然發(fā)生的HBV感染但是HBV樣感染可被誘導(dǎo)。如上所述，優(yōu)選的動物為人、非人類靈長類例如絨猴、狒狒、猩猩、低等靈長類例如tupia、家畜動物、實驗室試驗動物、寵物或被俘的野生動物。人是最優(yōu)選的目標(biāo)。但是，也可使用非人類動物模型。實驗室試驗動物的例子包括小鼠、大鼠、兔子、天竺鼠和倉鼠。兔子和嚙齒動物例如大鼠和小鼠提供方便的試驗系統(tǒng)或動物模型(如靈長類和低等靈長類)。也考慮家畜動物包括綿羊、母牛、豬、山羊、馬和驢。非哺乳動物例如鳥類種、斑馬魚、兩棲類(包括蟾蜍)和果蠅(Dmwp/H'/a)種例如黑腹果蠅(Z>o)p/n7"騰/"朋g必to')。除了活體動物模型，試驗系統(tǒng)也可包含組織培養(yǎng)系統(tǒng)。"抗HBV試劑"包括核苷或核苷酸類似物、蛋白、化學(xué)化合物、RNA或DNA或RNAi或siRNA寡聚核苷酸(源自DNA的或合成的)。在一個特別的具體實施方式中，減少的敏感性為ETV相關(guān)。或者，減少的敏感性為ADV或LMV相關(guān)?；蛘?，減少的敏感性為TFV相關(guān)?；蛘撸瑴p少的敏感性為FTC相關(guān)?；蛘?，減少的敏感性為ETV和人選的ADV和LMV相關(guān)?；蛘撸瑴p少的敏感性為ADV和TFV和任選的ETV相關(guān)。或者，減少的敏感性為LMV和TFV和任選的ETV相關(guān)?；蛘?，減少的敏感性為ADV和FTC和任選的ETV24相關(guān)?；蛘撸瑴p少的敏感性為FTC和TFV和任選的ETV相關(guān)?；蛘?，減少的敏感性為FTC和LMV和任選的ETV相關(guān)?；蛘?，減少的敏感性為ADV和LMV和TFV和任選的ETV相關(guān)?；蛘?，減少的敏感性為ADV和TFV和FTC和任選的ETV相關(guān)。或者，減少的敏感性為LMV和TFV和FTC和任選的ETV相關(guān)。或者，減少的敏感性為ADV和LMV和FTC和任選的ETV相關(guān)?；蛘撸瑴p少的敏感性為ADV和FTC和TFV和LMV和任選的ETV相關(guān)。這里提及的"抗HBV試劑"包括核苷或核苷酸類似物以及免疫反應(yīng)試劑(例如針對HBV表面成分的抗體)和抑制或干擾病毒的復(fù)制、維持、感染、組裝或釋放的化學(xué)的、蛋白質(zhì)的和核酸試劑。這里提及的"核酸"包括提及正義或反義分子、RNA或DNA、寡聚核苷酸和RNAi和siRNA分子和含有同樣物質(zhì)的復(fù)合體。除了編碼DNA聚合酶的基因中的突變之外，由于HBV基因組的交迭本性(圖1)，在編碼S的基因、編碼表面抗原(HBsAg)的基因也可發(fā)生相應(yīng)的突變，這導(dǎo)致免疫反應(yīng)試劑(例如抗體和免疫細(xì)胞)與HBsAg的相互作用活性減少。免疫反應(yīng)試劑與病毒表面成分的相互作用活性減少通常包括識別或?qū)嵸|(zhì)上識別病毒表面成分的免疫記憶的缺失。因此本發(fā)明延伸至HBV變體，其對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV禾口LMV;ADV禾口TFV;LMV和TFV;FTC禾口ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV禾口ADV;ETV禾口LMV;ETV禾QFTC;ETV禾口TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV禾口FTC禾BLMV禾BTFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV禾卩ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合表現(xiàn)出減少的敏感性或者表現(xiàn)出免疫反應(yīng)試劑對HBsAg減少的相互作用活性，其中該變體選作以下ADV和/或LMV組合或順序治療。本方面中的術(shù)語"順序"意思是ADV緊接著LMV禾口/或TFV禾口/或ETV禾口/或FTC，LMV緊接著ADV禾口/或TFV禾口/或FTC禾口/或ETV，或者ETV緊接著一個或多個的ADV、FTC、LMV禾口/或TFV，或ETV、ADV、LMV和/或TFV禾口/或FTC中每個的多個順序施藥。因此病毒變體可攜帶只存在于DNA聚合酶基因中的或者同時存在于DNA聚合酶基因和S基因中的突變。術(shù)語"突變"被理解為其最寬的意義并包括多個突變。這里考慮HBVDNA聚合酶中的任何結(jié)構(gòu)域特別是結(jié)構(gòu)域F和G，以及結(jié)構(gòu)域A至E中的突變，提供引起對ADV禾口/或LMV禾口/或TFV禾口/或ETV禾口/或FTC和/或LdT或其組合的突變。在本說明書中，特別提及DNA聚合酶的保守區(qū)域，其由結(jié)構(gòu)域A至E所定義。區(qū)域A至E由澳大利亞專利號734831中的通式II中的氨基酸序列所定義。特別的，突變導(dǎo)致HBVDNA聚合酶的任意一個或多個的結(jié)構(gòu)域F和G中，以及結(jié)構(gòu)域A至E或其臨近區(qū)域中的氨基酸序列改變。另一個方面提供HBV變體，其在基因組中交迭的開放讀碼框中包含突變，其中所述突變位于由HBVDNA聚合酶的一個或多個的結(jié)構(gòu)域F和G，以及結(jié)構(gòu)域A至E所定義的區(qū)域，且其中所述變體對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV禾卩LMV;ADV禾卩TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV和ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV和LMV禾口TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV禾PLMV禾卩ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合表現(xiàn)出減少的敏感性。另一個方面考慮到HBV變體，其包含編碼HBsAg的核苷酸序列中的突變，突變導(dǎo)致對于所述HBsAg來說至少一個氨基酸的增加、取代和/或缺失，其中所述變體對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC禾口ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV禾口ADV;ETV禾口LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合表現(xiàn)出減少的敏感性。更特別地，提供HBV變體，其與來自參考或野生型HBV的表面抗原相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中針對參考或野生型表面抗原產(chǎn)生的抗體表現(xiàn)出減少的中和所述HBV變體的能力，所述變體通過將個體暴露于ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV禾口ADV;ETV禾口LMV;ETV禾口FTC;ETV和TFV;ADV禾口LMV禾口TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV禾QLMV和ETV、ADV和ETV禾HTFV;ETV禾口LMV禾卩TFV;ADV和LMV和FTC;ADV禾卩FTC禾口LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合進(jìn)行選擇。術(shù)語"組合治療"意思是ADV、LMV、FTC、LdT、TFV禾口/或ETV在相同組合物中共同使用或在分開的組合物中同時使用。術(shù)語"順序治療"意思是兩個試劑在彼此使用幾秒鐘、幾分鐘、幾小時、幾天或幾周內(nèi)之內(nèi)以任意順序使用。順序治療也包括用ADV、LMV、FTC、TFV、LdT或ETV中的一個或另一個完成—個治療過程，然后用ADV、LMV、FTC、TFV、LdT或ETV中的另一個完成第二個或第三個或順序治療過程。相應(yīng)地，另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于ADV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于LMV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于FTC治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于TFV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于ETV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于LdT治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個27氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于ADV和LMV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于ADV和TFV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于ADV和ETV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于LMV和TFV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于LMV和ETV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于ADV和FTC治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于TFV和FTC治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于TFV和ETV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于FTC和LMV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于FTC和ETV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于ADV、LMV和TFV和/或ETV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于ADV、LMV和TFV禾P/或ETV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于ADV、LMV和FTC和/或ETV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于FTC、LMV和TFV和/或ETV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于ADV、FTC和TFV和/或ETV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。另一個方面考慮到HBV變體，其與預(yù)處理HBV相比，包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV變體的表面抗原與預(yù)處理HBV相比，表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，其中所述HBV變體通過將個體暴露于ADV、LMV、FTC和TFV禾P/或ETV治療或一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的治療來進(jìn)行選擇。特別地，變體為分離的形式，以致除了體液中天然發(fā)生的歩驟以外，它們己經(jīng)進(jìn)行了至少一個純化歩驟。或者，變體可保持在分離的體液中或者可以是DNA形式。本發(fā)明也考慮包含來自HBV變體的基因組或其部分的感染性分子克隆。而且，本發(fā)明提供來自HBV變體的分離的成分，例如但不限于分離的HBsAg。相應(yīng)地，本發(fā)明提供分離的HBsAg或其重組或衍生物形式或其化學(xué)等價物，所述HBsAg來自通過將個體暴露于一個或多個的ADV、LMV、FTC、TFV禾[l/或ETV或任選的一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑而進(jìn)行選擇的HBV變體。更特別地，提供分離的HBsAg變體或其重組或衍生物形式或其化學(xué)等價物，且其中所述HBsAg或其重組或衍生物形式或其化學(xué)等價物相對于來自參考HBV的HBsAg表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，所述HBsAg來自通過將個體暴露于一個或多個的ADV、LMV、FTC、TFV和/或ETV或任選的一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑而進(jìn)行選擇的HBV變體。更特別地，提供分離的HBsAg變體或其重組或衍生物形式或其化學(xué)等價物，且其中所述HBsAg或其重組或衍生物形式或其化學(xué)等價物相對于來自參考HBV的HBsAg來說包含具有單個或多個氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列，且其中針對參考HBV產(chǎn)生的中和抗體對攜帶所述HBsAg變體的HBV表現(xiàn)出無中和活性或減少的中和活性，所述HBsAg來自通過將個體暴露于一個或多個的ADV、LMV、FTC、TFV禾Q/或ETV或任選的一個或多個的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑而進(jìn)行選擇的HBV變體。HBVDNA聚合酶中的特別的突變包括變體，其選自在ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV禾QTFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV和ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV禾口FTC禾nETV禾卩TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合之后具有HBV復(fù)發(fā)的病人?？稍谝浦渤绦?例如骨髓移植30(BMT)或OLT)中、之后或之前，或者在被診斷為肝炎的病人接受治療之后標(biāo)明核苷或核苷類似物或其他抗HBV試劑。在選擇變體之后，病毒載量以類似于預(yù)處理的水平獲得或在治療中增加。rt區(qū)域中有用的突變包括，在一個具體實施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W,在另一個具體實施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一'個具體實施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、禾nrtW243R/W，或另一個具體實施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一個具體實施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtl233T/1、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一個具體實施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtl254I/F，或另一個具體實施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一個具體實施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一個具體實施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一個具體實施方式中包括rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtl253V，或其組合或等價的突變。特別有用的突變?yōu)樵诿艽a子180、184和204處的共同突變，例如rtL180M和rtT184S和rtM204V，在密碼子85、180、184、202、204和236處的共同突變，例如rtS85T、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V和rtN236I/D/V。這里考慮的替代的有用的突變包括rtP170H、rtT184A、rtY221H/Y、rtl233T/1、rtT240N/T、rtK241R、rtR242K/R、rtW243R/W、rtl253V、rtl254I/F、rtS256R/S、rtW257G/W、rtY257H或在密碼子239處的突變。"共同突變"意思是變體包含在所有提及的密碼子處的突變。本發(fā)明特別針對在密碼子180、184和204處的共同突變以及在密碼子85、180、184、202、204和236處的共同突變，但不延伸至只在密碼子180和204處的雙突變。這樣的HBV變體被提議為對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV禾口ADV;ETV禾口LMV;ETV禾口FTC;ETV禾口TFV;ADV禾口LMV禾口TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC禾BLMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合表現(xiàn)出減少的敏感性。應(yīng)該注意，氨基酸位置命名系統(tǒng)是基于將YMDD基序中的蛋氨酸殘基指定為密碼子rtM204。這個編號系統(tǒng)與澳大利亞專利號734831中的不同，澳大利亞專利號734831中聚合酶基因內(nèi)的YMDD基序中的蛋氨酸殘基被指定為密碼子550。由此，rtL180M和rtM204V分別對應(yīng)于澳大利亞專利號734831中的L526M和M550V。相應(yīng)的突變也可發(fā)生于被膜基因里例如一個或多個的PreSl、PreS2和S。ADV和其他非環(huán)化磷酸核苷的另一個潛在的作用模式為免疫刺激(Calio等人，J油'Wra/i"2丄77-89,1994)。一些突變導(dǎo)致HBV變體中所檢測到的被膜基因中的改變，這可能與免疫逃逸(immuneescape)相關(guān)。這些變化包括，在一個具體實施方式中包括sI92T/1、sL175F和sI195M，在另一個具體實施方式中包括sS207R，或另一個具體實施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一個具體實施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F禾nsY225H/Y，或另一個具體實施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sD33D/E、sC69St叩、sC76St叩、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一個具體實施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一個具體實施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL1621和sI195M或其組合或等價的突變。特別有用的突變?yōu)閟I110V、sP120Q、sF134L/F、sL1621、sL173F、sL175F、sL176V和sP178P/L。這里對變體的鑒定允許產(chǎn)生一系列測試來檢測這樣的突變。對這樣的突變的檢測對于鑒定抗性變體以確定化療的合適形式和/或監(jiān)視疫苗接種程序或發(fā)展新的或改良的疫苗制備物來說是重要的。另一個方面考慮確定HBV針對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV禾口ADV;ETV禾口LMV;ETV禾口FTC;ETV禾卩TFV;ADV禾口LMV禾口TFV;或ADV禾BFTC禾PTFV;TFV禾BFTC禾卩LMV;ADV禾口LMV禾QETV、ADV禾口ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑而表現(xiàn)出減少的敏感性的潛力的方法，所述方法包含從所述HBV中分離DNA或相應(yīng)的mRNA并篩選編碼HBV的DNA聚合酶的核苷酸序列中的突變，該突變導(dǎo)致在DNA聚合酶的任何一個或多個的F和G結(jié)構(gòu)域和A至E結(jié)構(gòu)域或其臨近區(qū)域內(nèi)的至少一個氨基酸的增力口、取代和/或缺失并和針對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV禾。TFV;LMV和TFV;FTC禾卩ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV和ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的抗性或減少的敏感性相關(guān)聯(lián)，其中這樣的突變的存在是對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV禾tlTFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC禾口TFV;FTC禾口LMV;ETV禾卩ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑的可能的抗性的指征。相應(yīng)地，另一個方面提供確定HBV針對核苷或核苷酸類似物(選自ADV、LMV、TFV、LdT、FTC和ETV或任選的其他核苷或核苷酸類似物)而表現(xiàn)出減少的敏感性的潛力的方法，所述方法包含從所述HBV中分離DNA或相應(yīng)的mRNA并篩選編碼HBV的DNA聚合酶的核苷酸序列中的突變，該突變導(dǎo)致在所述DNA聚合酶的任何一個或多個的F結(jié)構(gòu)域和A至E結(jié)構(gòu)域或其臨近區(qū)域內(nèi)的至少一個氨基酸的增加、取代和/或缺失并和針對一個或多個的ADV、LMV、TFV、LdT、FTC和/或ETV的抗性或減少的敏感性相關(guān)聯(lián)，其中這樣的突變的存在是對所述一個或多個的ADV、LMV、TFV、LdT、FTC禾Q/或ETV的可能的抗性的指征。特別地，測試檢測一個或多個的如下突變在一個具體實施方式中包括，rtS256R/S禾口rtW257G/W,在另一個具體實施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一個具體實施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、禾口rtW243R/W,或另一個具體實施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一個具體實施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtl233T/1、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一個具體實施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtl254I/F，或另一個具體實施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一個具體實施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一個具體實施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一個具體實施方式中包括rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtl253V，或其組合或等價的突變，為變體的指征，其中所述變體對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV禾口LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC禾口TFV;FTC和LMV;ETV禾BADV;ETV和LMV;ETV禾口FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV禾口LMV禾卩TFV;ADV禾QFTC禾nETV禾口TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合表現(xiàn)出減少的敏感性。相應(yīng)地，另一個方面產(chǎn)生確定HBV株是否對核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑表現(xiàn)出減少的敏感性的方法，所述方法通過從所述HBV中分離DNA或相應(yīng)的mRNA并篩選編碼HBV的DNA聚合酶和/或S基因的相應(yīng)區(qū)域中的核苷酸序列的突變，其中選自如下突變的存在為變體的指征在一個具體實施方式中包括sI92T/1、sL175F和sI195M,在另一個具體實施方式中包括sS207R，或另一個具體實施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一個具體實施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一個具體實施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sD33D/E、sC69St叩、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一個具體實施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一個具體實施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL1621和sI195M或其組合或等價的突變，在一個具體實施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W,在另一個具體實施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S禾口rtN238T,或另一個具體實施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、禾flrtW243R/W，或另一個具體實施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A禾nrtY257H，或另一個具體實施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtl233T/1、rtT240N/T、rtK241R禾卩rtH248N，或另一個具體實施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtl254I/F，或另一個具體實施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一個具體實施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一個具體實施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一個具體實施方式中包括rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtl253V，或其組合或等價的突變，其中所述變體對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC禾口LMV;ETV和ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV禾卩LMV禾卩TFV;或ADV禾口FTC禾口TFV;TFV禾口FTC禾口LMV;ADV禾QLMV禾PETV、ADV禾卩ETV禾口TFV;ETV禾卩LMV禾QTFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合表現(xiàn)出減少的敏感性。另一個方面產(chǎn)生確定HBV株是否對核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑表現(xiàn)出減少的敏感性的方法，所述方法通過從所述HBV中分離DNA或相應(yīng)的mRNA并篩選編碼HBV的DNA聚合酶和/或S基因的相應(yīng)區(qū)域中的核苷酸序列的突變，其中選自如下突變的存在為變體的指征在一個具體實施方式中包括sI92T/1、sL175F禾QsI195M，在另一個具體實施方式中包括sS207R，或另一個具體實施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一個具體實施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一個具體實施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一個具體實施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一個具體實施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL1621和sI195M或其組合或等價的突變，在一個具體實施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W,在另一個具體實施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S禾BrtN238T，或另一個具體實施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、禾PrtW243R/W，或另一個具體實施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A禾QrtY257H，或另一個具體實施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtl233T/1、rtT240N/T、rtK241R禾tlrtH248N，或另一個具體實施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH2〗6H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W禾nrtl254I/F，或另一個具體實施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V禾口rtN236T，或另一個具體實施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一個具體實施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一個具體實施方式中包括rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtl253V，或其組合或等價的突變，其中所述變體對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC禾卩LMV;ETV和ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV禾口LMV禾卩TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV禾卩FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合表現(xiàn)出減少的敏感性.對細(xì)胞、細(xì)胞裂解物、培養(yǎng)物上清液和體液中的HBV或其成分的檢測可以是任何常規(guī)的方法，包括任何基于核酸的檢測方法，例如，通過核酸雜交技術(shù)或通過一個或多個聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。術(shù)語"體液"包括任何源自血液、淋巴、組織或器官系統(tǒng)的液體，包括血清、全血、活組織檢查(biopsy)和活組織檢查液、器官移植和器官懸液例如肝懸液。本發(fā)明還包括使用不同形式的所述基于核酸的檢測方法，包括，尤其，限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP)、單鏈多態(tài)性(single-strandchainpolymorphism'SSCP)、擴(kuò)增及錯配檢測(amplificationandmismatchdetection,AMD)、散布重復(fù)序列聚合酉每鏈反應(yīng)(interspersedrepetitivesequencepolymerasechainreaction,IRS-PCR)、反向聚合酶鏈反應(yīng)(inversepolymerasechainreaction,iPCR)禾口逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)。其他形式的檢領(lǐng)U包括Northern雜交、Southern雜交、PCR測序、抗體程序例如ELISA、Western雜交和免疫組化。特別有用的檢測包括固定化的寡聚核苷酸或寡肽介導(dǎo)的檢測系統(tǒng)所需的反應(yīng)試劑和化合物。一個特別有用的核酸檢測系統(tǒng)是反向雜交技術(shù)(reversehybridizationtechnique)。在這個技術(shù)中，使用生物素或其他配體標(biāo)記的引物來擴(kuò)增來自HBV樣品的DNA以產(chǎn)生標(biāo)記的擴(kuò)增子(amplificon)。然后使用固定在固體支持物例如硝化纖維薄膜上的寡聚核苷酸通過雜交來捕獲經(jīng)擴(kuò)增的DNA。通過生物素或配體來鑒定特定的核算片段。通常，經(jīng)標(biāo)記的引物對于特定的待測核苷酸變異是特異性的。只有當(dāng)待測變異存在時擴(kuò)增才會發(fā)生。反向雜交檢測有很多形式，均為本發(fā)明所包括。這里考慮的另一個方面提供檢測HBV變體的方法，該HBV變體表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，所述方法包含從個體中分離HBV，該個體暴露于選自以下的核苷或核背酸類似物ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV禾卩LMV;ADV禾口TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC禾tlLMV;ETV和ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合，然后將所述HBV與一組一種或多種針對表面抗原的抗體接觸并篩選任何結(jié)合親和力或結(jié)合頻譜上的變化。在一個相關(guān)的具體實施方式中，考慮檢測HBV變體的方法，該HBV變體表現(xiàn)出改變的免疫學(xué)圖譜，所述方法包含從個體中分離血清樣品，該個體暴露于選自以下的核苷或核苷酸類似物ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV禾口LMV;ADV禾QTFV;LMV和TFV;FTC禾卩ADV;FTC禾卩TFV;FTC和LMV;ETV禾卩ADV;ETV禾卩LMV;ETV禾卩FTC;ETV禾卩TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV禾口LMV禾口TFV;ADV禾口LMV禾卩FTC;ADV禾口FTC禾口LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合，然后將血清與一組HBV表面抗原或其抗體結(jié)合片段接觸并篩選任何結(jié)合親和力或結(jié)合頻譜上的變化。檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中的HBV復(fù)制是特別有用的。這個方面和其他方面應(yīng)特別服從微陣列分析(microarmyanalysis)以鑒定下調(diào)HBV的基因組序列或轉(zhuǎn)錄子的寡聚核苷酸(包括正義和反義分子、RNAi或siRNA分子或DNA或RNA結(jié)合分子)。微陣列分析也可用于鑒定HBV基因組中的特別的突變，例如位于HBVDNA聚合酶編碼區(qū)域內(nèi)或者HBsAg編碼區(qū)域內(nèi)的。另一個方面考慮檢測對HBV表現(xiàn)出抑制活性的試劑的方法，該方法通過產(chǎn)生遺傳構(gòu)建體，其在質(zhì)粒載體中包含復(fù)制能力有效量的來自HBV的基因組，然后用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞；在轉(zhuǎn)染前、中和/或后將待測試劑與所述細(xì)胞接觸；將細(xì)胞在足以允許HBV復(fù)制的條件下培養(yǎng)足以允許HBV復(fù)制的時間，如果對所述試劑呈抗性，則表達(dá)遺傳序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；和然后將細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)物上清液置于病毒或病毒成分檢測器，以確定在該試劑存在的情況下，病毒是否己經(jīng)復(fù)制、表達(dá)遺傳材料和/或組裝和/或被釋放。在一個特別的具體實施方式中，質(zhì)粒載體可包括編碼部分或全部其他病毒載體例如桿狀病毒屬載體或腺病毒載體(參見Ren和Nassal,2001，見上)的基因，方法包含產(chǎn)生遺傳構(gòu)建體，其包含復(fù)制能力有效量的來自HBV的基因組(包含于或融合至能有效感染細(xì)胞的數(shù)量的桿狀病毒屬的基因組)，然后用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞；在感染前、中和/或后將待測試劑與該細(xì)胞接觸；將細(xì)胞在足以允許HBV復(fù)制的條件下培養(yǎng)足以允許HBV復(fù)制的時間，如果對所述試劑呈抗性，則表達(dá)遺傳序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；和然后將細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)物上清液置于病毒或病毒成分檢測器，以確定在該試劑存在的情況下，病毒是否已經(jīng)復(fù)制、表達(dá)遺傳材料和/或組裝和/或被釋放。在一個替代的具體實施方式中，方法包含產(chǎn)生持續(xù)細(xì)胞系，其包含復(fù)制能力有效量的HBV基因組的有感染性的拷貝(這樣的話所述感染性HBV基因組被穩(wěn)定地整合進(jìn)入所述持續(xù)細(xì)胞系，例如但不限于，2.2.15或AD細(xì)胞系)；將待測試劑與細(xì)胞接觸；將細(xì)胞在足以允許HBV復(fù)制的條件下培養(yǎng)足以允許HBV復(fù)制的時間，如果對所述試劑呈抗性，則表達(dá)遺傳序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；和然后將細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)物上清液置于病毒或病毒成分檢測器，以確定在該試劑存在的情況下，病毒是否已經(jīng)復(fù)制、表達(dá)遺傳材料和/或組裝和/或被釋放。以上提及的方法在鑒定或發(fā)展針對HBV變體的試劑方面是特別有用的，所述HBV變體為例如那些攜帶以下突變的在一個具體實施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W,在另一個具體實施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一個具體實施方式中包括rtQ215S、rtR242K7R、和rtW243R/W，或另一個具體實施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一個具體實施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtl233T/1、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一個具體實施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtl254I/F，或另一個具體實施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一個具體實施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一個具體實施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一個具體實施方式中包括rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtl253V,或其組合或等價的突變；在一個具體實施方式中包括sI92T/1、sL175F和sI195M，在另一個具體實施方式中包括sS207R，或另一個具體實施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一個具體實施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一個具體實施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F禾BsI195M，或另一個具體實施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一個具體實施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL1621和sI195M或其組合或等價的突變。相應(yīng)地，另一個方面考慮確定HBV株是否對核苷或核苷酸類似物或其他潛在的抗HBV試劑表現(xiàn)出減少的敏感性的方法，所述方法通過從所述HBV中分離DNA或相應(yīng)的mRNA并篩選被膜基因或DNA聚合酶的核苷酸序列的突變，所述突變選自在一個具體實施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W,在另一個具體實施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一個具體實施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一個具體實施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A禾卩rtY257H，或另一個具體實施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtl233T/1、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一個具體實施方式中包括rtL180M、rtA18〗V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtl254I/F，或另一個具體實施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一個具體實施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一個具體實施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、HI233T/I和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一個具體實施方式中包括rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtl253V，或其組合或等價的突變；在另一個具體實施方式中，在一個具體實施方式中包括sI92T/1、sL175F和sI195M，在另一個具體實施方式中包括sS207R，或另一個具體實施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一個具體實施方式中包括sF80S、s函I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一個具體實施方式中包括sF134L/F和sL173F,或另一個具體實施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F禾卩sI195M，或另一個具體實施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一個具體實施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL1621和sI195M或其組合或等價的突變和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合。檢測DNA聚合酶的氨基酸變體可通過一系列氨基酸檢測技術(shù)方便地實現(xiàn)。當(dāng)HBV變體包含氨基酸變化時，則這樣的分離體被認(rèn)為是具有改變的DNA聚合酶活性的推定HBV變體。這里還考慮抑制對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV禾PLMV;ADV禾QTFV;LMV和TFV;FTC禾tlADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV和ADV;ETV和LMV;ETV禾卩FTC;ETV禾tlTFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合呈抗性的HBV變體。如果臨床醫(yī)生考慮ADV、LMV、FTC、TFV、LdT禾口/或ETV禾口/或任選的其他核苷或核苷酸類似物例如TFV的長期治療，這些試劑是特別有用的。該試劑可以是DNA或RNA或蛋白質(zhì)的或非蛋白質(zhì)的化學(xué)分子。也考慮從天然產(chǎn)物(例如植物、珊瑚和微生物)篩選作為有用的掩蔽劑(maskingagent)的潛在來源，如組合文庫或化學(xué)文庫的篩選。該試劑可以是分離的形式或作為藥物組合物或制劑的形式，可代替核苷或核苷酸類似物、與核苷或核苷酸類似物順序使用或同時使用。此外，考慮合理的藥物設(shè)計包括解決例如HBVDNA聚合酶的晶體或NMR結(jié)構(gòu)，設(shè)計能結(jié)合至酶的活性位點的試劑。這個方法也可適合于其他的HBV成分。相應(yīng)地，另一個方面考慮檢測對HBV表現(xiàn)出抑制活性的試劑的方法，所述HBV対ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV禾口LMV;ADV禾口TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC禾QTFV;FTC和LMV;ETV和ADV;ETV禾卩LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合表現(xiàn)出抗性或減少的敏感性，所述方法包含產(chǎn)生遺傳構(gòu)建體，其在質(zhì)粒載體中包含復(fù)制能力有效量的來自HBV的基因組，然后用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞；在轉(zhuǎn)染前、中和/或后將待測試劑與所述細(xì)胞接觸；將細(xì)胞在足以允許HBV復(fù)制的條件下培養(yǎng)足以允許HBV復(fù)制的時間，如果對所述試劑呈抗性，則表達(dá)遺傳序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；和將細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)物上清液置于病毒或病毒成分檢測器，以確定在所述試劑存在的情況下，病毒是否己經(jīng)復(fù)制、表達(dá)遺傳材料和/或組裝和/或被釋放。另一個方面考慮檢測對HBV表現(xiàn)出抑制活性的試劑的方法，所述HBV對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC禾卩ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV禾卩ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV禾卩TFV;ADV禾口LMV禾卩TFV;或ADV禾口FTC禾口TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合表現(xiàn)出抗性或減少的敏感性，所述方法包含產(chǎn)生遺傳構(gòu)建體，其包含復(fù)制能力有效量的來自HBV的基因組(包含于或融合至能有效感染細(xì)胞的數(shù)量的桿狀病毒屬的基因組)，然后用所述構(gòu)建體感染所述細(xì)胞；在感染前、中和/或后將待測試劑與所述細(xì)胞接觸；將細(xì)胞在足以允許HBV復(fù)制的條件下培養(yǎng)足以允許HBV復(fù)制的時間，如果40對所述試劑呈抗性，則表達(dá)遺傳序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；和將細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)物上清液置于病毒或病毒成分檢測器，以確定在該試劑存在的情況下，病毒是否已經(jīng)復(fù)制、表達(dá)遺傳材料和/或組裝和/或被釋放。特別地，HBV基因組被穩(wěn)定地整合入細(xì)胞的基因組。有用的細(xì)胞包括2.2.15細(xì)胞(Price等人，Proc.A^/.爿cac/.5W.U&4S6〈Z"8541-8544，1989)或AD細(xì)胞(也稱為HepAD32細(xì)胞或HepAD79細(xì)胞[Ying等人，2000，見上])。雖然桿狀病毒載體在實踐本方法時是特別有用的，但是也可使用一系列其他載體例如但不限于腺病毒載體。這里也考慮攜帶遺傳構(gòu)建體(包含全部或部分的HBV基因組或其基因或基因的一部分)的細(xì)胞系(例如2.2.15或AD細(xì)胞)。也提供本HBV變體用于篩選抗病毒試劑的用途。這些抗病毒試劑抑制病毒。術(shù)語"抑制"包括對抗或者防止感染、復(fù)制、組裝和/或釋放或任何中間歩驟。特別的抗病毒試劑包括核苷或核苷酸類似物或抗HBV試劑以及非核苷分子。而且，也考慮合理的藥物設(shè)計以鑒定或產(chǎn)生化學(xué)分子，所述化學(xué)分子模擬特定的核苷或者與特定的核苷酸序列或特定的核苷酸相互作用。組合化學(xué)和雙雜交篩選是能夠用于鑒定潛在的治療性或預(yù)防性試劑的一些技術(shù)中的一些。在一個實施例中，使用聚合酶或表面抗原的晶體結(jié)構(gòu)或NMR結(jié)構(gòu)來合理地設(shè)計小化學(xué)分子，其可能與功能和/或抗原性所需分子的主要區(qū)域相互作用。這樣的試劑可用作聚合酶活性的抑制劑和/或可改變表面抗原的表位。由于和來自HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶的相似性，已經(jīng)制備HBV聚合酶的幾個模式(Das等人，■/K/ra/.75(70六4771-4779,2001;Bartholomeusz等人，/"&n;/ra/ogy￥0^-6」.'337-3421997;Allen等人，i/e/^o/ogy27陶:1670-1677,1998)。HBV聚合酶的模式可被用于新試劑(可有效抵抗編碼抗性突變以及野生型病毒的HBV)的合理藥物設(shè)計。所設(shè)計的合理藥物可基于對已存在的抗病毒試劑(例如那些用于選擇編碼與抗性相關(guān)突變的HBV的試劑)的修飾。也可使用病毒或表達(dá)編碼突變的HBV基因組材料的克隆來篩選新的抗病毒試劑。在一個替代的具體實施方式中，考慮用于檢測試劑的方法，該試劑在體外聚合酶測試中對HBV聚合酶表現(xiàn)出抑制活性。HBV聚合酶活性可使用己建立的方法來檢測(Gaillard等人，2002，見上；Xiong等人，1998，見上)。如上所述，微陣列技術(shù)也是有用的鑒定能夠與確定的HBV內(nèi)部或外部成分相互作用的試劑的方法。例如，HBVDNA聚合酶或其攜帶不同氨基酸變體的肽片段的陣列可用于篩選能夠結(jié)合至或者與這些分子相互作用的試劑。這是確定HBV變體之間不同的結(jié)合樣式的方便的方法。也可使用抗體陣列來篩選改變的HBsAg分子。微陣列也可用于蛋白質(zhì)組分析以鑒定具有與HBV成分相互作用能力的分子例如抗體、干擾素或細(xì)胞因子。DNA和RNA分子的微陣列也可用于鑒定HBV基因組或其轉(zhuǎn)錄子上的遺傳區(qū)域的正義和反義分子。以上方法在鑒定HBV的抑制劑方面是特別有用的，所述HBV對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC禾QLMV;ETV和ADV;ETV和LMV;ETV禾BFTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合呈抗性或表現(xiàn)出減少的敏感性。因此本發(fā)明延伸至抑制劑的組合物。抑制劑也可以是抗體形式或用于共抑制或誘導(dǎo)RNAi的遺傳分子形式例如核酶、反義分子和/或正義分子，或其他的核苷或核苷酸類似物或其他的抗HBV試劑或已知類似物的衍生物。提及RNAi包括提及短的干擾RNA(siRNA)，所有的RNAi類型的分子可以是源自DNA的或合成的。術(shù)語"組合物"包括"藥物組合物"或制劑。以下將抑制劑稱為"活性成分"或"活性化合物"，可選自以上所列抑制劑。組合物可包括HBV的抗原性成分，缺陷型HBV變體或經(jīng)天然產(chǎn)物篩選或合理藥物設(shè)計(包括組合化學(xué))而鑒定的試劑。藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包被、抗細(xì)菌和抗真菌試劑、等壓和吸附延遲試劑等。這樣的用于藥學(xué)上活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑在本領(lǐng)域是熟知的。除了與活性成分不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑之外，考慮其在治療性組合物中的應(yīng)用。也可在組合物中引入補(bǔ)充性活性成分。藥物組合物也可包括遺傳分子例如能夠轉(zhuǎn)染耙細(xì)胞的載體，其中該載體攜帶能夠編碼天冬氨酰蛋白酶抑制劑的核酸分子。載體可以是例如病毒載體。適合于注射用途的藥學(xué)形式包括無菌水溶液(其中水可溶)和用于無菌注射溶液的臨時制備的無菌粉末。它在生產(chǎn)和貯存條件下必須穩(wěn)定，且必須能抗微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用而保藏。載體可以是溶劑或稀釋介質(zhì)，其包含例如水、乙醇、多羥基化合物(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)、其合適的混合物和植物油?？赏ㄟ^使用例如superfactant來保持正確的流動性?？赏ㄟ^各種抗細(xì)菌和抗真菌試劑例如對羥基本甲酸酯(paraben)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等來防止微生物的作用。在很多情況下，優(yōu)選為包括等壓試劑，例如糖或氯化鈉。注射性組合物的延長的吸附可通過在組合物中使用延遲吸附試劑(例如單硬脂酸鋁和凝膠)來實現(xiàn)。無菌注射溶液通過將合適溶劑中的所需數(shù)量的活性化合物引入活性成分和任選的其他所需要的活性成分，然后進(jìn)行過濾殺菌或其他合適的殺菌方法來制備。在用于無菌注射溶液的制備物的無菌粉末的情況下，合適的制備方法包括真空干燥和凍干技術(shù)，其產(chǎn)生活性成分的粉末加任何其他的所需成分。當(dāng)活性成分被合適地保護(hù)時，可通過口服來使用，例如使用惰性稀釋藥或使用可同化的可食用的載體，或者可包含于硬殼或軟殼凝膠膠囊，或可壓縮成藥片。對于口服的治療性施藥，活性成分可引入賦形劑，以可攝取的藥片、口腔藥片、片劑、膠囊、西也劑(elbdr)、懸浮液、糖漿、干膠片等形式使用。這樣的組合物和制備物應(yīng)含有至少1%重量的活性化合物。組合物和制備物的百分比當(dāng)然可以改變，可方便地介于單位重量的大約5%至大約80%。這樣的治療上有用的組合物中的活性化合物的量為可獲得合適的劑量。根據(jù)本發(fā)明所述的優(yōu)選的組合物或制備物制成口服劑量單位，含有介于大約0.1照至200mg的活性化合物。替代的劑量包括從大約1嗎至大約100mg和從大約10嗎至大約500mg。這些劑量可以是每個個體或者每千克體重。施藥可以是每小時、每天、每周、每月或每年。藥片、片劑、藥丸、膠囊等也可含有下列的成分?？杉尤胝澈蟿├缦鹉z、阿拉伯樹膠、玉米淀粉或凝膠；賦形劑例如磷酸二鈣；崩解劑例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、褐藻酸等；潤滑劑例如硬脂酸鎂；以及甜味劑例如蔗糖、乳糖或糖精或芳香劑例如薄荷油、鹿蹄草油或櫻桃芳香。當(dāng)劑量單元形式為膠囊時，除了以上類型的材料外，它可含有液態(tài)載體。各種其他材料可以包被而存在或者改變劑量單元的物理形式。例如藥片、藥丸或膠囊可以蟲漆(shellac)、糖或二者同時包被。糖漿或西也劑可含有活性化合物、作為甜味劑的庶糖，作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯(methylparaben)和對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben),色素和芳香劑。當(dāng)然，用于制備任何計量單元形式的任何材料必須是藥學(xué)上純的和在所用的量上為實質(zhì)上無毒性的。而且，可將活性化合物引入緩釋制備物和制劑。如上所述，本發(fā)明還延伸至來自如這里所述的HBV變體的分離的HBsAg。更特別地，本發(fā)明提供HBsAg或其重組形式或其衍生物或化學(xué)等價物。分離的表面成分和(更特別的)分離的表面抗原或其重組、衍生物或化學(xué)等價物可用于發(fā)展生物組合物例如疫苗制劑。另一個方面提供包含HBV變體和一個或多個藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑的組合物，該HBV變體對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV禾[]TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC禾口TFV;FTC禾PLMV;ETV和ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或來自所述HBV變體的HBV表面抗原或其重組或衍生物形式或其化學(xué)等價物呈抗性。這樣的組合物可認(rèn)為是治療性組合物，可用于產(chǎn)生免疫反應(yīng)包括體液反應(yīng)。通常，HBV變體為"缺陷型"，其本身不能在個體中引起持續(xù)的感染。如上所述，可產(chǎn)生針對突變HBV試劑產(chǎn)生抗體并用于針對這些病毒感染的被動或直接疫苗接種。抗體可在人或非人類動物中產(chǎn)生。如果是后者，則非人類抗體在使用前需要去免疫或更明確地，人源化。去免疫可包括例如從鼠科或非人類動物的抗HBV抗體的可變區(qū)移植補(bǔ)體決定區(qū)(CDR)至人的共有抗體結(jié)合片段(Fab)多肽?；蛘?，抗體的可變區(qū)內(nèi)的決定表位的氨基酸可被突變以致表位不能再被人類MHCII復(fù)合體所識別。在核酶、反義或共抑制(RNAi)或siRNA或其復(fù)合物的范圍內(nèi)涉及到抑制，這是為了便利地在轉(zhuǎn)錄后基因沉默?？墒褂肈NA或RNA或者可應(yīng)用包含對HBV的mRNA特異性的RNAi或其化學(xué)類似物的復(fù)合物。所用這樣的分子可被引入藥物組合物。在另一個具體實施方式中，提供生物組合物，其包含HBV變體或HBsAg或來自所述HBV變體的L、M或S蛋白或其重組或衍生物形式或其化學(xué)等價物。通常，如果使用HBV，它首先被削弱。生物組合物通常還包含一個或多個藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。生物組合物可包含來自一個HBV變體的HBsAg或類似分子或者組合物為來自一系列ADV陽禾口/或LMV-禾口/或FTC-LdT-禾口/或TFV抗性HBV變體的HbsAg或L、M或S蛋白或類似分子的雞尾酒。當(dāng)組合物包含HBV時，可適用類似的包含物。還提供缺陷型HBV變體在制備用于接種個體來抵抗HBV株(其具有特別的核苷酸序列或編碼特別的聚合酶或表面抗原或L、M或S蛋白)感染的治療性疫苗中的用途。合適的候選疫苗的例子為HBV變體的缺陷型形式，其包含選自以下的突變在一個具體實施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W,在另一個具體實施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一個具體實施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一個具體實施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A禾QrtY257H,或另一個具體實施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtl233T/1、rtT240N/T、rtK241R禾[]rtH248N，或另一個具體實施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtl254I/F，或另一個具體實施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一個具體實施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一個具體實施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一個具體實施方式中包括rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtl253V，或其組合或等價的突變；在一個具體實施方式中包括sI92T/1、sL175F和sI195M，在另一個具體實施方式中包括sS207R，或另一個具體實施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一個具體實施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一個具體實施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一個具體實施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s2]0R/S和sY225H/Y，最后在另一個具體實施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL1621和sI195M或其組合或等價的突變。例如在一個具體實施方式中，HBV變體可通過其聚合酶內(nèi)對核苷或核苷酸類似物引起抗性或減少的敏感性的特別的突變來進(jìn)行鑒定。然后可將這種變體突變以使其成為缺陷型，即削弱或不能引起感染。然后這樣的缺陷型的、核苷或核苷酸類似物抗性的病毒可用作治療性疫苗以抵抗在聚合酶里具有相同突變的的劇毒性病毒。本發(fā)明延伸至用于檢測HBV變體的試劑盒，所述HBV變體對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC禾口TFV;FTC禾口LMV;ETV禾口ADV;ETV禾口LMV;ETV禾口FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合呈抗性。這樣的試劑盒可含有例如來自PCR或其他核酸雜交技術(shù)的反應(yīng)試劑或用于基于免疫的檢測技術(shù)的反應(yīng)試劑。特別有用的檢測包括固定化寡核苷酸或寡肽介導(dǎo)的監(jiān)測系統(tǒng)所需的反應(yīng)試劑和成分。另一個方面考慮確定HBV針對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV和LMV;ADV和TFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC和LMV;ETV和ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV和TFV;ADV和LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV禾PTFV;ETV禾口LMV禾QTFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV禾口TFV;ETV禾QFTC禾nLMV禾口TFV;ADV禾QETV禾口LMV禾HTFV;ADV禾口FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合而表現(xiàn)出減少的敏感性的潛力的方法，所述方法包含從所述HBV中分離DNA或相應(yīng)的niRNA并篩選編碼HBV的DNA聚合酶的核苷酸序列中的突變，該突變導(dǎo)致在所述DNA聚合酶的任何一個或多個的F和G結(jié)構(gòu)域和A至E結(jié)構(gòu)域或其臨近區(qū)域內(nèi)的至少45一個氨基酸的增加、取代和/或缺失并和針對ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV禾口LMV;ADV和TFV;LMV禾口TFV;FTC禾卩ADV;FTC禾口TFV;FTC禾口LMV;ETV禾口ADV;ETV和LMV;ETV禾口FTC;ETV和TFV;ADV禾口LMV和TFV;或ADV和FTC和TFV;TFV和FTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV禾口ETV禾口TFV;ETV禾CILMV禾卩TFV;ADV禾口LMV禾UFTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV和ETV和LMV和TFV;ADV和FTC和ETV和TFV;ADV和FTC和LMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合的抗性或減少的敏感性相關(guān)聯(lián)，其中這樣的突變的存在是對所述ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC;ADV禾nLMV;ADV禾HTFV;LMV和TFV;FTC和ADV;FTC和TFV;FTC禾卩LMV;ETV禾口ADV;ETV和LMV;ETV和FTC;ETV禾tlTFV;ADV和LMV和TFV;或ADV禾卩FTC禾nTFV;TFV禾QFTC和LMV;ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV;ETV和LMV和TFV;ADV和LMV和FTC;ADV和FTC和LMV和TFV;ETV和FTC和LMV和TFV;ADV禾卩ETV禾卩LMV禾卩TFV;ADV禾口FTC禾卩ETV禾卩TFV;ADV禾卩FTC禾tlLMV和ETV;或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任選的其他核苷或核苷酸類似物或其他抗HBV試劑或其組合的可能的抗性的指征。評價潛在的病毒變體對于選擇合適的治療性程序來說是重要的。這樣的評價可合適地通過帶有軟件的計算機(jī)程序的幫助來促進(jìn)，所述軟件還特別加入與病毒變體相關(guān)的至少兩個特征的輸入代碼以提供對應(yīng)于病毒變體針對特別的化學(xué)化合物或免疫試劑的抗性或敏感性的數(shù)值。該數(shù)值可選自(a)針對特別的化合物或免疫試劑的減少的敏感性表現(xiàn)出抗性的能力；(b)來自野生型HBV的改變的DNA聚合酶；(c)來自野生型HBV的改變的表面抗原；或(d)病人的發(fā)病率或恢復(fù)潛力。因此，根據(jù)本發(fā)明，這樣特點的數(shù)值被存儲于機(jī)器可讀貯存介質(zhì)，該介質(zhì)能夠處理數(shù)據(jù)以提供特別的病毒變體或包含特別病毒變體的生物樣品的數(shù)值。因此，在另一個方面，考慮計算機(jī)程序產(chǎn)品以評估病毒變體或包含病毒變體的生物樣品的可能的有用性，以確定個體中合適的治療程序(圖15)，所述產(chǎn)品包含(1)作為至少兩個特征的輸入代碼而接收的代碼，所述特征為與病毒試劑或包含病毒試劑的生物樣品相關(guān)，其中所述特征選自(a)針對特別的化合物或免疫試劑的減少的敏感性表現(xiàn)出抗性的能力；(b)來自野生型HBV的改變的DNA聚合酶；(c)來自野生型HBV的改變的表面抗原；或(d)病人的發(fā)病率或恢復(fù)潛力；(2)將所述輸入代碼加入的代碼，以提供對應(yīng)于所述病毒變體或生物學(xué)樣品的總和；和(3)存儲代碼的計算機(jī)可讀性介質(zhì)。在一個相關(guān)的方面，提供計算機(jī)以評估個體中病毒變體或包含病毒變體的生物樣品的可能的有用性，其中所述計算機(jī)包含(l)機(jī)器可讀的數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)，其包含由機(jī)器可讀數(shù)據(jù)編碼的數(shù)據(jù)存儲材料，其中所述機(jī)器可讀數(shù)據(jù)包含與所述病毒變體或生物樣品相關(guān)的至少兩個特點的輸入代碼；其中所述特點選自(a)針對特別的化合物或免疫試劑的減少的敏感性表現(xiàn)出抗性的能力；(b)來自野生型HBV的改變的DNA聚合酶；(c)來自野生型HBV的改變的表面抗原；或(d)病人的發(fā)病率或恢復(fù)潛力；(2)用于儲存處理所述機(jī)器可讀數(shù)據(jù)的指令的工作內(nèi)存；(3)中央處理器，其與所述工作內(nèi)存和所述機(jī)器可讀數(shù)據(jù)的貯存介質(zhì)相連，用于處理所述機(jī)器可讀數(shù)據(jù)以提供對應(yīng)于所述化合物數(shù)值的所述輸入代碼的總和；和(4)與所述中央處理器相連的輸出硬件，用于接收所述數(shù)值。本發(fā)明考慮任何一般的或特別目的的計算機(jī)系統(tǒng)，包括處理器，處理器同時與內(nèi)存和至少一個輸入/輸出設(shè)備進(jìn)行電子通訊。圖15顯示通常合適的計算機(jī)系統(tǒng)。這樣的系統(tǒng)可包括但不限于，個人電腦、工作站或主機(jī)。處理器可以是一般目的的處理器或微處理器或特別處理器，其執(zhí)行位于RAM內(nèi)存中的程序。程序可置于來自貯存設(shè)備的RAM，例如磁盤或預(yù)編程的ROM內(nèi)存。在一個具體實施方式中RAM內(nèi)存同時用于數(shù)據(jù)存儲和程序執(zhí)行。計算機(jī)系統(tǒng)也包含一種系統(tǒng)，其中處理器和內(nèi)存位于不同物理實體，但通過網(wǎng)絡(luò)的方式進(jìn)行電子通訊。在一個替代的具體實施方式中，程序篩選以下突變在一個具體實施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W,在另一個具體實施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一個具體實施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一個具體實施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一個具體實施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtl233T/1、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一個具體實施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtl254I/F，或另一個具體實施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一個具體實施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一個具體實施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一個具體實施方式中包括rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtl253V，或其組合或等價的突變；在一個具體實施方式中包括sI92T/1、sL175F和sI195M，在另一個具體實施方式中包括sS207R，或另一個具體實施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一個具體實施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一個具體實施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一個具體實施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一個具體實施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y,最后在另一個具體實施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL1621和sI195M或其組合或等價的突變。本發(fā)明由以下非限定性實施例進(jìn)一歩描述。實施例實施例l朋r游贈基鵬HBV的交迭基因組顯示于圖1。編碼DNA聚合酶(P)的基因與病毒被膜基因Pre-Sl和Pre-S2交迭，并與X和核心(C)基因部分交迭。HBV被膜包含小的、中的和大的HBV表面抗原。大的蛋白成分被稱為HBV表面抗原(HBsAg)并由S基因序列所編碼。Pre-Sl和Pre-S2基因序列編碼其他的被膜成分。-實施例2鼓游Z,游似淑朋「"旭齡#病人A:在TFV和LMV治療中，通過測序檢測到獨(dú)特的的HBV突變(表4)。這個病人在治療中病毒突破(virologicalbreakthrough)中選擇獨(dú)特的rtS256R/S和rtW257G/W突變(表4，圖4、5和6)。這些變化不改變交迭讀碼框中的HBsAg，因為它們位于HBsAg讀碼框的終止密碼子之后。病人B:在TFV和LMV治療中，通過測序檢測到獨(dú)特的HBV突變(表5和圖7、8禾卩9)。HBVDNA聚合酶的rt區(qū)域的獨(dú)特變化包括rtL180M+rtM204V，其以前曾被證明與密碼子184處的突變(rtT184S)和rtH9D和rtN238T協(xié)力而與LMV抗性相關(guān)。以前曾注意到在rt內(nèi)密碼子184處的變化與ETV+/-LMV抗性有關(guān)(Tenney等人，J""附/cra6C/zemoAw4SfP力3498-507,2004)但未報道與TFV+LMV抗性和治療中的病毒突破有關(guān)。TFV和LMV治療中HBsAg的變化包括sI92T/1、sL175F和sI195M。后兩個變化分別對應(yīng)于聚合酶中rtT184S和rtM204V。病人C:在表6和圖10、11、12中列出在LMV和TFV治療中的HBV突變。HBVDNA聚合酶的rt區(qū)域的獨(dú)特變化包括rtR242K/R、W243R/W和rtQ215S。LMV和TFV治療中HBsAg的變化包括sS207R。病人D:在表7和圖13、14、15中列出在LMV和TFV治療中的HBV突變。HBVDNA聚合酶的rt區(qū)域的獨(dú)特變化包括rtT184A和rtY257H，其他的變化包括rtN118S和rtR102E。LMV和TFV治療中HBsAg的變化包括sI110V和sP120Q。實施例3拔^^毒治#^^^乂浙/化「"7\^1游分橋用核苷(核苷酸)類似物治療慢性乙型肝炎病毒的病人可導(dǎo)致對編碼突變(該突變與對抗病毒試劑的減少的敏感性相關(guān))的HBV變體的選擇。對ADV的抗性與位于rtN236T的推定的三磷酸結(jié)合位點處的突變相關(guān)(Angus等人，Garfroe"/era/og."5(2力292-297,2003)。因此在這個區(qū)域的通過ADV或其他抗病毒治療而選擇的其他突變對于ADV和/或其他核苷(核苷酸)治療的抗病毒抗性來說是重要的。重要的密碼子包括239(其為高度保守的)、240、241、242和243。除了在rtN236T處的突變，其他的突變可增加抗性和/或復(fù)制。一個這樣的突變位于密碼子221。病人E:在表8和圖16、17和18中列出LMV治療中HBV的突變。HBVDNA聚合酶的rt區(qū)域的獨(dú)特變化包括rtT240N/T和rtK241R。其他重要的變化包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtl233T。LMV治療中HBsAg的變化包括sF80S、s體I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y。病人F:在表9和圖19、20和21中列出LMV治療中HBV的突變。HBVDNA聚合酶的rt區(qū)域的獨(dú)特變化包括rtR242R/K和rtW243G/W。其他重要的變化包括rtL180M、rtA181T、rtH216H/P和rtE218D/E，所有其他的變化見表9。LMV治療中HBsAg的變化和靠近"a"決定簇的變化包括sF134L/F和sL173F(所有其他的變化見表9)。病人G:在表10和圖22、23和24中列出LMV治療中HBV的突變。HBVDNA聚合酶的rt區(qū)域的獨(dú)特變化包括rtY221H/Y。其他重要的獨(dú)特變化包括rtV214A、rtA181A/V和rtN236T(所有其他的變化見表9)。LMV治療中HBsAg的變化和靠近"a"決定簇的變化包括sL173F(所有其他的變化見表9)。病人H:病人H曾經(jīng)經(jīng)過一些核苷/核苷酸類似物治療，并單獨(dú)對LMV、然后是ETV，然后是ADV呈抗性。然后以LMV和ADV和ETV的組合來治療該病人，現(xiàn)在對所有這些試劑呈抗性。在圖25、26和27中列出治療中HBV的突變。這個病人選擇以下突變的獨(dú)特的組合rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V和rtN236I/D/V。這包括已知的LMV抗性突變(位于rtL180M和rtM204V)也包括已知的ETV抗性突變(位于rtL180M、rtT184G、rtS2021和rtM204V)。這個病人在密碼子236處在rtN236I/D/V選擇獨(dú)特突變(其以前未被報道與ADV抗性相關(guān))。所有這些突變可能對于組合的ADV、LMV和ETV抗性突變來說是重要的。49HBsAg的變化包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M。病人I:病人I曾經(jīng)經(jīng)過LMV然后是ADV治療，這個病人現(xiàn)在由TFV和LMV進(jìn)行治療，并選擇與對這些試劑呈減少的敏感性相關(guān)的突變。在圖28、29和30中列出TDF和LMV治療中HBV的突變。。這包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1和rtS246H/P/Y/S的突變。特別地，從這個病人TFV治療前分離的HBV中以前未檢測到rtl233T/1的突變。HBsAg的變化包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y。病人J:病人J曾經(jīng)經(jīng)過LMV治療，并選擇與LMV抗性相關(guān)的突變，這包括聚合酶突變(rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtl253V)以及被膜突變(sL20F、sI42L、sV144D、sL1621和sI195M)。接下來這個病人以ADV進(jìn)行治療而沒有反應(yīng)，然后以ETV治療還是沒反應(yīng)。這建議這個病人可以在LMV治療中選擇可以影響接下來的抗病毒無反應(yīng)或?qū)DV然后是ETV的初級抗性的突變。特別地，在rtl253V和rtP170H的突變對于針對ADV然后是ETV的初級抗性來說是重要的。實施例4瘋毒絲游淑使用市面有售的免疫檢測(AbbottLaboratories,NorthChicago,IL,USA)測定乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、抗HBe和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)特異性IgG和IgM。使用捕獲雜交測試，根據(jù)生產(chǎn)商的說明(DigeneHybridCaptureII,DigeneDiagnosticsInc.,Beltsville,MD)測定乙型肝炎病毒DNA水平。生產(chǎn)商指明的檢測臨床樣品中HBV病毒血癥的切斷(cut-off)為0.7xl06拷貝/ml或2.5pg/ml[Hendricks等人，乂mJC""PaAoZ川4:537-46,1995]。也可使用其他商售試劑盒來對HBVDNA水平進(jìn)行定量，例如CobasamplificationHBVmonitorkit(Roche)。實施例5朋F層J游從100pi血清中提取HBVDNA,如Aye等人乂//epa/o/.26:1148-1153,1997所述。用Geneworks,Adelaide,Australia合成寡聚核苷酸。HBV聚合酶基因的擴(kuò)增由Aye等人1997如上所描述。使用來自MOBIOLaboratoriesInc(LaJolla,CA)的PCR純化柱對特定的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后使用BigDyeterminatorCyclesequencingReadyReactionKit(PerkinElmer,CetusNorwalk,CT)直接進(jìn)行測序。PCR引物用作測序引物，OS15'-GCCTCATTTTGTGGGTCACCATA-3'(nt1408-1430)[SEQIDNO:l]，TTA35'-AAATTCGCAGTCCCCAAA-3'(nt2128-2145)[SEQIDN0:2]，JM5'-TTGGGGTGGAGCCCTCAGGCT-3'(ntl676-1696)[SEQIDNO:3]，TTA45'陽GAAAATTGGTAACAGCGG-3'(nt2615-2632)[SEQIDNO:4]，OS25'TCTCTGACATACTTTCCAAT3'(nt2798-2817)[SEQIDNO:5]，以對PCR產(chǎn)物的中間區(qū)域進(jìn)行測序。實施例6離裙絲"則ADV(以前為Bis-pomPMEA)為HBV復(fù)制的有力抑制劑。在圖2中顯示ADV的結(jié)構(gòu)，其合成由Benzaria等人，J她t/C/z綴，4958-4965，1996所描述。實施例7泰諾裙夯(TWTFV(以前為Bis-pomPMPA)為HBV復(fù)制的有力抑制劑。在圖3中顯示泰i若福韋的結(jié)構(gòu)，其合成由Srinivas禾口Fridland,力"ri附/cro6C7ze附W/zer.42f^):1484-1487,1998所描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到，這里所描述的本發(fā)明可進(jìn)行除那些所特別描述之外的改變和修改。應(yīng)該理解本發(fā)明包括所有這些改變和修改。本發(fā)明也個別地或聯(lián)合地包括本說明書中所提及或指明的個別的或全體的所有的步驟、特點、組合物和化合物，以及任何兩個或兩個以上所述步驟或特點的任何和所有組合。表4敘FF認(rèn)F微憤澄辦游癡X4細(xì)BF覆合磨微贗麟變(lU/ml)ALT(IU/ml)1142524G'型APCR-vePCR-ve聚合酶#野生型1.79E+07AS256R/SW257G/w<formula>formulaseeoriginaldocumentpage52</formula>表6(IU/ml)1.70E+09敘FK/L鮮治^^,趁,游贏C艦BK覆絲微搬效聚合酶#ALT(IU/ml)71552.82E+05G，型DDDV19術(shù)Q215P/SV19箭Q215P/SQ215SR242K/RW243R/WHBsAG#W182VWS207RW182VWS207RS207R敘FK觀MF浙術(shù)澄辦游瘋乂贈朋F臘蘼微顏,,(IU/ml)ALT(IU/ml)G'型D表8聚合酶#N118SR120RT184AY257HHBsAG#11術(shù)P120Q,這F澄#頓微/鄉(xiāng)癡乂E游朋F康絲微搬效(IU/ml)ALT(IU/ml)G'型D聚合酶#HBsAG#F122V/FF80SS135丫I208I/LH2湖/PS210KL229M/LF220L/FI233T/IY225H/YT2棚/TK241R53表9^丄MK辦頓藩鄉(xiāng)似F游朋F秉絲微搬效(IU/ml)ALT(IU/ml)G'型聚合酶#HBsAG#BN124DF134L/FS135AL173FS143T/SI208I/LL180MS210T/SA181VH216H/PE218D/EH238DR242K/RW243G/WI254l/f表IO^ADF澄#^,澄游裔乂G游i^F覆會艨浙凝^^^資(IU/ml)1.98E+061.42E+051.61E+042.00E+03ALT(IU/ml)467G'型BB聚合酶#L115MM204IV214AM250IPCR-vePCR-vePCR-veN53DL115MA181A/VV214AY221H/YN236THBsAG#W196SC76YL173L/F參考文獻(xiàn)Allen等人，//印"to/ogy27(^.1670-1677,1998Angus等人，"50:292-297,2003Aye等人，J.//印Wo/.26:1148-1153,1997Bartholomeusz等人，/"tor/ra/ogyW(5-6」:337-3421997Benhamou等人，丄朋c"718-723,2001Benzaria等人，Jikfet/C/^附.3義.4958-4965,1996Boyd等人，顛'w'ra/C/ze附C7ze腳^:358-363,1987Calio等人，爿油'w'r"/ifey.23:77-89,1994Das等人，J.Wra/.75"6>」:4771-4779,2001Dienstag等人，Wew￡"g/a"dJ7kfed"3:1657-1661,1995Frick等人，j""'冊.cra6.^ge"^C7ze附oA^37:2285-2292,1993Gaillard等人，爿""附/cra6C7/e附oA^:1005-〗013,2002Gilson等人，/Wra/Z/epW6:387-395,1999Heathcote等人，他戸油gy2&A620,1998Hendricks等人，爿附J"C/z'"PaAo〃似:537-46，1995Kruger等人，//epato/ogy22:219A,1994Main等人，Wra/f/ep油',/s3:211-215,1996Norder等人，乂G饑Mra/.74:341-1348,1993Perrillo等人，//epato/ogy32:129-134,2000Peters等人，rra"sp/""torio"6&1912-1914,1999Price等人，iVoc.iVa,/.Jc"d5W.M(2/力8541-8544,1989Ren和Nassal,/Wra/.75(3」:1104-1116,2001Severini等人，爿油7m'cra6/""ge她C7ze,//^39:430-435,1995Srinivas禾口Fridland,^""附/craZ)爿genhC7zemo/^er.1484-1487,1998Stuyver等人，i/epato/ogy3丄751-757,2001Summers和Mason,Q〃29:403-415,1982Suo等人，J5/。/C/ze附.27J02;:2725O-27258.1998Te皿ey等人，^W/附/cra6」ge/^yC/zemW/z^4S:3498-507,2004VereHodge,Jw/w>a/C7zewC7ze附o/7zer4:67-84,1993Xiong等人，i/epflto/ogy.2S0」:1669-1673,1998Ying等人，/Mra///epa/.7(7力79-83,2000Ying等人，Wra/鄉(xiāng)a/.7(2」:161畫165,2000權(quán)利要求1、一種分離的乙型肝炎病毒(HBV)變體，其中所述變體在編碼DNA聚合酶的基因內(nèi)包含核苷酸突變，該突變導(dǎo)致對所述DNA聚合酶來說至少一個氨基酸的增加、取代和/或缺失，其中該突變選自(i)密碼子239、240、241、242和/或243處的突變；(ii)導(dǎo)致N236I/D/V取代的突變；(iii)導(dǎo)致S246H/P/Y/S取代的突變；(iv)導(dǎo)致P170H取代的突變；(v)導(dǎo)致I253V取代的突變；(vi)兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V或rtN236I/D/V；(vii)兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtI233T/I或rtS246H/P/Y/S；或(viii)兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtI29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V或rtI253V；其中HBV變體對核苷或核苷酸類似物表現(xiàn)出減少的敏感性。2、如權(quán)利要求1所述的HBV變體，其中變體對選自ADV、LMV、TFV、ETV、FTC或LdT的核苷或核苷酸類似物表現(xiàn)出減少的敏感性。3、如權(quán)利要求1所述的HBV變體，其中變體包含密碼子239、240、241、242和/或243處的突變。4、如權(quán)利要求2所述的HBV變體，其中變體包含導(dǎo)致N236I/D/V取代的突變。5、如權(quán)利要求2所述的HBV變體，其中變體包含導(dǎo)致S246H/P/Y/S取代的突變。6、如權(quán)利要求2所述的HBV變體，其中變體包含導(dǎo)致P170H取代的突變。7、如權(quán)利要求2所述的HBV變體，其中變體包含導(dǎo)致I253V取代的突變。8、如權(quán)利要求2所述的HBV變體，其中變體包含兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V或rtN236I/D/V。9、如權(quán)利要求2所述的HBV變體，其中變體包含兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1或rtS246H/P/Y/S。10、如權(quán)利要求2所述的HBV變體，其中變體包含兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V或rtl253V。11、一種確定HBV變體對核苷或核苷酸類似物表現(xiàn)出減少的敏感性的潛力的方法，所述方法包含從所述HBV中分離DNA或相應(yīng)的mRNA;禾口篩選編碼HBV的DNA聚合酶的核苷酸序列中的突變，該突變導(dǎo)致所述DNA聚合酶的rt中的氨基酸取代，該突變選自(i)密碼子239、240、241、242和/或243處的突變;(ii)導(dǎo)致N236I/D/V取代的突變；(iii)導(dǎo)致S246H/P/Y/S取代的突變；(iv)導(dǎo)致P170H取代的突變；(v)導(dǎo)致I253V取代的突變；(vi)rtR242K/R和rtW243G/W取代的共同突變；(vii)rtS256R/S和rtW257G/W取代的共同突變；(viii)兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V或rtN236I/D/V;(vii)兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1或rtS246H/P/Y/S;或(ix)兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V或rtl253V;(x)兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W或rtl254I/F，其中這樣的突變的存在為對核苷或核苷酸類似物抗性的指征。12、如權(quán)利要求11所述的方法，其中核苷或核苷酸類似物選自ADV、LMV、TFV、ETV、FTC或LdT。13、如權(quán)利要求12所述的方法，其中變體包含密碼子239、240、241、242和/或243處的突變。14、如權(quán)利要求12所述的方法，其中變體包含導(dǎo)致N236I/D/V取代的突變。15、如權(quán)利要求12所述的方法，其中變體包含導(dǎo)致S246H/P/Y/S取代的突變。16、如權(quán)利要求12所述的方法，其中變體包含導(dǎo)致P170H取代的突變。17、如權(quán)利要求12所述的方法，其中變體包含導(dǎo)致I253V取代的突變。18、如權(quán)利要求12所述的方法，其中變體包含rtR242K/R和rtW243G/W取代的共同突變。19、如權(quán)利要求12所述的方法，其中變體包含rtS256R/SandrtW257G/W取代的共同突變。20、如權(quán)利要求12所述的方法，其中變體包含兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V或rtN236I/D/V。21、如權(quán)利要求12所述的方法，其中變體包含兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1或rtS246H/P/Y/S。22、如權(quán)利要求12所述的方法，其中變體包含兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V或rtl253V。23、一種檢測對HBV變體表現(xiàn)出抑制活性的試劑的方法，所述HBV變體對一個或多個核苷或核苷酸類似物或免疫反應(yīng)試劑表現(xiàn)出抗性或減少的敏感性，所述方法包含產(chǎn)生遺傳構(gòu)建體，其包含復(fù)制能力有效量的來自包含于質(zhì)粒載體的所述HBV的基因組，然后用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞；在感染前、中和/或后將待測試劑與所述細(xì)胞接觸；將細(xì)胞在足以允許HBV復(fù)制的條件下培養(yǎng)足以允許HBV復(fù)制的時間，如果對所述試劑呈抗性，則表達(dá)遺傳序列和/或組裝和/或釋放病毒或病毒樣顆粒；和將細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)物上清液置于病毒或病毒成分檢測器中以確定在所述試劑存在的情況下，病毒是否已經(jīng)復(fù)制、表達(dá)遺傳材料和/或組裝和/或被釋放。24、如權(quán)利要求23所述的方法，其中HBV變體對選自ADV、LMV、TFV、ETV、FTC或LdT的核苷或核苷酸類似物表現(xiàn)出減少的敏感性。。25、如權(quán)利要求24所述的方法，其中變體包含在密碼子239、240、241、242和/或243處的突變。26、如權(quán)利要求25所述的方法，其中變體包含導(dǎo)致N236I/D/V取代的突變。27、如權(quán)利要求25所述的方法，其寧變體包含導(dǎo)致S246H/P/Y/S取代的突變。28、如權(quán)利要求25所述的方法，其中變體包含導(dǎo)致P170H取代的突變。29、如權(quán)利要求25所述的方法，其中變體包含導(dǎo)致I253V取代的突變。30、如權(quán)利要求25所述的方法，其中變體包含rtR242K/R和rtW243G/W取代的共同突變；31、如權(quán)利要求25所述的方法，其中變體包含rtS256R/SandrtW257G/W取代的共同突變；32、如權(quán)利要求25所述的方法，其中變體包含兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS2021、rtM204V或rtN236I/D/V。33、如權(quán)利要求25所述的方法，其中變體包含兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtl233T/1或rtS246H/P/Y/S。34、如權(quán)利要求25所述的方法，其中變體包含兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtl29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V或rtl253V。35、如權(quán)利要求25所述的方法，其中變體包含兩個或兩個以上選自以下的取代的共同突變rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W或rtl254I/h36、一種分離的HBV變體，其中所述變體包含選自以下的表面抗原sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F、sI195M、sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S、sY225H/Y、sL20F、sI42L、sV144D、sL1621或sI195M。37、一種確定HBV變體對核苷或核苷酸類似物表現(xiàn)出減少的敏感性的潛力的方法，所述方法包含從所述HBV中分離DNA或相應(yīng)的mRNA;和篩選編碼HBV表面抗原的核苷酸序列中的突變，該突變導(dǎo)致選自下列的突變sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F、sI195M、sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S、sY225H/Y、sL20F、sI42L、sV144D、sL1621或sI195M。全文摘要本發(fā)明大體上涉及對特定試劑表現(xiàn)出減少的敏感性和/或表現(xiàn)出與免疫反應(yīng)試劑的減少的相互作用活性的病毒變體。更特別地，本發(fā)明針對乙型肝炎病毒(HBV)變體，其對核苷或核苷酸類似物表現(xiàn)出完全的或部分的抗性，和/或表現(xiàn)出與針對病毒表面成分的抗體的減少的相互作用活性，包括對這些抗體的減少的敏感性。這里也考慮疫苗和診斷性化驗。文檔編號C12N15/51GK101548014SQ200780023810公開日2009年9月30日申請日期2007年6月4日優(yōu)先權(quán)日2006年6月6日發(fā)明者A·I·巴托洛梅烏茲,A·艾爾斯,H·蒂利曼,J·J·薩薩德茲,L·K·W·然,P·W·安格斯,P·德斯蒙德,S·洛卡尼,S·萊溫,T·博克,W·西弗茨申請人:墨爾本保健公司;奧斯丁保健公司;阿爾弗雷德保健公司;南方保健公司;圣文森特醫(yī)院墨爾本有限公司