一株裂殖壺菌及粗甘油培養(yǎng)裂殖壺菌產(chǎn)油脂的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株裂殖壺菌及粗甘油培養(yǎng)裂殖壺菌產(chǎn)油 脂的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人口的與日俱增和工業(yè)的急劇發(fā)展，導(dǎo)致能源過(guò)度消耗，由此引起的環(huán)境的 污染、資源的過(guò)度消耗等都不得不迫使人類開始尋求可以替代石油的可再生清潔能源，于 是生物柴油（脂肪酸甲酯）因其環(huán)保性、可再生性、良好的可燃性吸引了人們的目光。為了 阻止全球變暖、減排溫室氣體，歐盟、巴西、加拿大等紛紛出臺(tái)政策鼓勵(lì)生產(chǎn)可再生、碳中性 的生物柴油。因此，近年來(lái)生物柴油迅猛發(fā)展，2010年就超過(guò)130. 3億升。我國(guó)生物柴油生 產(chǎn)雖然起步較晚，但依中石化、中石油和中海油《中長(zhǎng)期可再生能源發(fā)展規(guī)劃》，至2020年 發(fā)展到22. 7億升。
[0003] 生物柴油最主要的生產(chǎn)方法是用甲醇將脂肪酸三甘酯轉(zhuǎn)酯化，g卩脂肪酸三甘酯+3 甲醇=脂肪酸甲酯（生物柴油）+甘油。生物柴油與甘油的產(chǎn)出比約10 : 1，副產(chǎn)物含有 80%?88%的甘油以及甲醇、阜等，須精制才能應(yīng)用于化妝品、食品和醫(yī)藥等工業(yè)。但精制 成本很高，而且生物柴油生產(chǎn)快速發(fā)展所產(chǎn)出的粗甘油遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)精甘油的市場(chǎng)需求，造成 精甘油價(jià)格急劇下跌，粗甘油則幾乎成了工業(yè)垃圾，從而推高生物柴油的生產(chǎn)成本，且造成 嚴(yán)重的環(huán)境問題。推廣應(yīng)用生物柴油的最大阻礙是高昂的成本，因而當(dāng)前關(guān)于生物柴油研 宄的2個(gè)重要方面即為：（1)尋求更易得、更經(jīng)濟(jì)的新原料，（2)開發(fā)甘油的新用途。
[0004] 裂殖壺菌（Schizochytrium)是一類缺乏葉綠體故而不行光合作用的專性海生藻 狀真菌，因其生長(zhǎng)速率快，每天可以倍增7. 3?9. 4次，富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，一直來(lái) 被認(rèn)為工業(yè)化生產(chǎn)DHA的最適合菌種。Baily等高密度培養(yǎng)S.ATCC20888,在細(xì)胞增殖階 段維持溶氧水平在4% -8%、油脂積累階段低于1%，流加玉米糖漿以維持葡萄糖濃度低 于7g?L'用氨水進(jìn)行補(bǔ)氮和控制pH值，發(fā)酵90?100h，生物量達(dá)到200g?I71，生物量 中總脂肪酸和DHA含量分別為50%和20%，是已有報(bào)道中的極致（BailyRB，etal，US PatentUS6607900B2, 2003-08-19)。趙肖為等報(bào)道通過(guò)流加葡萄糖高密度培養(yǎng)裂殖壺 菌WZU6961生產(chǎn)DHA，得到的發(fā)酵液中生物量濃度92. 4?103. 2g?L-1，生物量中DHA含 量20. 9 %?21. 9 %，DHA生產(chǎn)率達(dá)到7. 2?8. 5g?I^cf1 (趙肖為等，中國(guó)專利，【申請(qǐng)?zhí)枴?201210338013. 0)。
[0005] 最近的研宄表明，生物柴油副產(chǎn)品粗甘油是裂殖壺菌生長(zhǎng)和積累油脂的理想碳 源；且因裂殖壺菌生長(zhǎng)速率快和油脂含量高，新近又成為生物柴油生產(chǎn)原料的開發(fā)目標(biāo)。
[0006]Chi等首先研宄了以粗甘油為碳源培養(yǎng)S. 1imacinum生產(chǎn)DHA的可能性，結(jié) 果表明，粗甘油可以獲得與葡萄糖相似的生長(zhǎng)速率和細(xì)胞密度，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和培 養(yǎng)條件，可以獲得22.lg.I71的生物量和tWg.L-1的DHA(ChiZY，etal，Process Biochemistry, 2007, 42:1537?1545)。Pyle等研宄了生物柴油副產(chǎn)物粗甘油所含雜質(zhì) 對(duì)S.limacinum的細(xì)胞組分和DHA積累的影響，粗甘油來(lái)自不同的生產(chǎn)商，但都含有甲 醇、皂和許多元素（包括鈣、磷、鉀、硅、鈉和鋅），甲醇和皂對(duì)DHA積累有負(fù)作用，但高壓滅 菌可以使甲醇蒸發(fā)，調(diào)節(jié)pH值可使皂沉淀，所獲得的生物量中含有45%?50%的脂肪、 14%?20%的蛋白質(zhì)、25%的碳水化合物和8%?13%的灰分（PyleD，etal,Journalof AgriculturalandFoodChemistry, 2008, 56(11) :3933 ?3939)。Chi等又以實(shí)驗(yàn)室級(jí) (laboratory-grade)甘油研宄了S.limacinum的細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂積累規(guī)律，高溶氧有利于 細(xì)胞生長(zhǎng)，不利于油脂積累，低溶氧是油脂積累的必需條件，因此不論生產(chǎn)油脂還是DHA，以 甘油為碳源培養(yǎng)S.limacinum應(yīng)在細(xì)胞增殖階段和油脂積累階段維持不同的溶氧水平，結(jié) 果獲得 37. 9g.L-1 的生物量和 6. 56g.L-1 的DHA(ChiZY，etal,AppliedMicrobiology andBiotechnology, 2009, 81:1141 ?1148)。Ethier等通過(guò)連續(xù)發(fā)酵研宄了S.limacinum 以生物柴油副產(chǎn)物粗甘油為碳源的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、底物利用效率和DHA積累情況，結(jié)果 表明，細(xì)胞生長(zhǎng)服從Monod方程，其最大比生長(zhǎng)速率和半飽和系數(shù)分別為0.692 ?cf1和 25. 87g?L'生長(zhǎng)得率系數(shù)為0. 283,維持系數(shù)為0. 222 ?cf1;產(chǎn)物中主要脂肪酸是棕櫚酸 和DHA，還有肉豆蔻酸、硬脂酸和DPA;進(jìn)料中粗甘油濃度低于90g?I71時(shí)，總脂肪酸和DHA 含量與其成正比關(guān)系；高于90g噸4時(shí)成反比關(guān)系，生物量和DHA生產(chǎn)率與間歇發(fā)酵相仿而 低于流加發(fā)酵（EthierS，etal,BioresourceTechnology, 2011，102:88 ?93)〇
[0007]Johnson等分別采用先提取油脂后轉(zhuǎn)酯化的二步法和直接轉(zhuǎn)酯化的一步法探索了 用S.limacinum生產(chǎn)生物柴油的可能性，干的生物量采用一步法所制備的生物柴油，其諸 如游離甘油、總甘油、酸值、皂含量、銅片腐蝕、閃點(diǎn)、粘度和懸浮微粒之類的指標(biāo)符合美國(guó) ASTM標(biāo)準(zhǔn)，但水分、沉淀物含量和硫含量等不合格，總體而言，S.limacinum適合于通過(guò)直 接轉(zhuǎn)醋化生產(chǎn)生物柴油（JohnsonMB，etal,EnergyandFuels, 2009, 23:5179 ?5183)〇 Vicente等進(jìn)一步將濕的生物量通過(guò)酸催化直接轉(zhuǎn)化為生物柴油，省略了油脂提取這一步 驟，從而使生產(chǎn)成本得以降低；而且油脂利用率提高，結(jié)構(gòu)性油脂也能轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯 (VicenteG，etal,EnergyFuels, 2010, 24 (5): 3173 ?3178)。DangDiemHongd等報(bào)道將 自S.mangroveiPQ6中提取的脂肪酸甲醋分離為飽和脂肪酸甲醋（SFAME)和不飽和脂肪酸 甲酯（UFAME)兩部分，其含量分別為70%和30%，其中飽和脂肪酸甲酯諸如15°C下比重、沸 點(diǎn)、水分、沉澄和40°C下動(dòng)態(tài)黏度等指標(biāo)符合越南生物柴油B100標(biāo)準(zhǔn)（DangDiemHongd,et al,JournalofBioscienceandBioengineering, 2013, 116 (2):180 ?185)〇
[0008] 油脂含量固然是微藻生產(chǎn)生物柴油的決定因素，其脂肪種類和脂肪酸組成甚至更 重要，因?yàn)橹苯雨P(guān)系到產(chǎn)品品質(zhì)的長(zhǎng)鏈飽和與不飽和脂肪酸在室溫下分別是固體和液體， 不飽和脂肪酸甲酯的流動(dòng)性使之適合于用作生物柴油，然而，多不飽和脂肪酸容易被氧化， 形成粘滯的聚合物和/或生成含有諸如環(huán)氧基、醛基之類的含氧脂肪酸（釋放的氧自由基 會(huì)腐蝕發(fā)動(dòng)機(jī)內(nèi)部結(jié)構(gòu)）。因此，調(diào)控脂肪酸組成對(duì)于保證微藻油生產(chǎn)的生物柴油的品質(zhì) 非常重要。如Chang等分離得到幾株裂殖壺菌和"橙黃壺菌"，其油脂富含飽和脂肪酸和單 不飽和脂肪酸，是生產(chǎn)具有更高氧化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性的生物柴油的適合原料（ChangKJ L，etal，AppliedMicrobiologyandBiotechnology, 2012,93:2215 ?2231)〇
[0009] 我國(guó)生產(chǎn)生物柴油的原料主要為餐廚廢油和廢棄動(dòng)物脂，與歐美主要以植物油 為原料相比，其副產(chǎn)物粗甘油因色澤、氣味以及其它微量組分的原因更加難以精制，以之 為碳源培養(yǎng)裂殖壺菌生產(chǎn)油脂，無(wú)論從環(huán)境保護(hù)還是生產(chǎn)成本來(lái)講，更具有現(xiàn)實(shí)意義；而 且因粗甘油雜質(zhì)更復(fù)雜，所以其積累的油脂更適宜于用于生產(chǎn)生物柴油。Liang等發(fā)現(xiàn) S.limacinumSR21以這種粗甘油為碳源進(jìn)行間歇發(fā)酵時(shí)生長(zhǎng)快速，由于底物抑制作用以 及所含甲醇，高濃度致使細(xì)胞生長(zhǎng)減緩；未處理和已處理粗甘油的最適濃度分別為25和 35g?L'所獲得的生物量分別為8. 3和13. 3g?I71;由35g? 的已處理粗甘油獲得的生 物量中含有 73. 3%的油脂（LiangY，etal,BioresourceTechnology, 2010, 101:6745 ? 6750)。該方面研宄目前剛剛起步，而國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一株裂殖壺 菌，該菌株為從采自浙江溫州樂清灣的紅樹林腐敗落葉上分離獲得的裂殖壺菌WZU6961，經(jīng) 紫外誘變育種而獲得的，編為Schizochytriumsp. 6961Y01。其特點(diǎn)為能以生物柴油副產(chǎn)品 粗甘油為碳源快速生長(zhǎng)和積累油脂，且其油脂組成更適宜用于生產(chǎn)生物柴油。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種粗甘油培養(yǎng)上述裂殖壺菌產(chǎn)油脂的方法。
[0012] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一株裂殖壺菌，該菌株為裂殖壺菌 (Schizochytriumsp. )6961Y01，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCCNO. 9043,保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)， 保藏起始日期為2014年04月14日。
[0013] 一種粗甘油培養(yǎng)上述裂殖壺菌產(chǎn)油脂的方法，包括如下步驟：
[0014] 1)將上述保藏菌株6961Y01接種于種子培養(yǎng)基中活化獲得活化菌，然后活化菌轉(zhuǎn) 接于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)得到種子；
[0015] 2)將步驟1)所得種子轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，離心得富含油脂的裂 殖壺菌菌體。
[0016] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，步驟1)中所述種子培養(yǎng)基的組成為粗甘油，玉米漿，礦物質(zhì)； 步驟2)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：粗甘油，玉米漿，礦物質(zhì)，復(fù)合維生素。
[0017] 優(yōu)選地，步驟1)和2)中所述種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成中粗甘油30g?L' 玉米漿10g?L-1;
[0018] 優(yōu)選地，步驟1)和2)中所述種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成中礦物質(zhì)的構(gòu)成為： NaCl 15g ? L' KC1 0? 5g ? L' MgS04 ? 7H20 2. 0g ? L' K2S040.65g ? L' KH2P041. 0g ? L' (NH4)2S041. Og ? L' CaCl2 ? 2H20 0? 17g ? L