裂殖壺菌ylh70及其合成dha的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株新菌株--裂殖壺菌(Aurantiochytrium sp.)YLH70及其在合成DHA中的應用，本發(fā)明的原料是非糧食資源菊芋及植物淀粉來源的果葡糖漿，產(chǎn)量大且價格低廉，可以降低DHA的生產(chǎn)成本；菊芋水解液和果葡糖漿含有高濃度的還原糖，且以果糖、低聚果糖和葡萄糖等易發(fā)酵糖類為主，成為裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的潛在碳源；提供發(fā)酵性能優(yōu)良的裂殖壺菌(Aurantiochytrium sp.)YLH70菌株，在以菊芋水解液作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，發(fā)酵生物量可達54.61-76.52g/L，DHA產(chǎn)量可達12.56-18.78g/L；而以果葡糖漿作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，發(fā)酵生物量可達70.51-79.85g/L，DHA產(chǎn)量可達14.1-20.1g/L。
CCTCC NO：M 2014215
20140521
【專利說明】裂殖壺菌YLH70及其合成DHA的應用 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種海洋原生生物裂殖壺菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70菌株，及 其利用菊芋水解液或果葡糖漿生產(chǎn)二十二碳六烯酸（DHA)的方法。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] DHA (二十二碳六稀酸，Docosahexaenoic acid)，被譽為"腦黃金"，是成人及嬰幼 兒視覺和大腦等神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不可缺少的重要物質(zhì)；具有預防心血管疾病、抗癌、抗炎等生 理功效；在餌料中添加一定比例的DHA，可顯著提高水產(chǎn)品及家禽的品質(zhì)和生長速率。DHA 廣泛應用于醫(yī)藥、食品和飼料領(lǐng)域，其廣闊的市場前景受到人們的極大關(guān)注。傳統(tǒng)的DHA 資源是魚油，然而魚油目前面臨資源匱乏、污染、工藝繁瑣、口感差及高成本等問題，制約著 DHA產(chǎn)業(yè)發(fā)展，人們急需尋找一種新型的DHA資源以替代傳統(tǒng)的魚油資源。
[0003] 研宄發(fā)現(xiàn)海洋微生物裂殖壺菌細胞中能積累大量DHA，而且具有培養(yǎng)周期短和不 易受污染等優(yōu)點，能夠克服魚油資源所面臨的種種問題；同時裂殖壺菌來源的DHA已通過 FDA等權(quán)威機構(gòu)的安全認證，是安全的DHA新資源。國內(nèi)外開展裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的相關(guān)研 宄，已有相關(guān)專利的公開。申請?zhí)枮?200910061419. 7、201210251850. X、201210380900. 4、 201210338013. (K200910130628. 2的專利公開了利用裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的工藝， 培養(yǎng)基均使用葡萄糖、蛋白胨和酵母粉等傳統(tǒng)碳氮源。為了降低生產(chǎn)成本，申請?zhí)枮?201010104774. 0的專利公開了裂殖壺菌利用廉價的豆柏水解液作為氮源發(fā)酵生產(chǎn)DHA的 工藝，而申請?zhí)枮?01310571413. 0的專利則通過處理廢棄秸桿生成水解液，并以此作為碳 源生產(chǎn)DHA，有效降低了 DHA的生產(chǎn)成本，而裂殖壺菌利用廉價的菊芋水解液或果葡糖漿等 富含果糖的植物質(zhì)資源發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法并未見報道。
[0004] 菊芋又稱鬼子姜、洋姜，是一種耐貧瘠和干旱的高產(chǎn)、高糖植物。菊芋產(chǎn)量可達1. 2 噸/畝，其塊莖中的主要成分是菊糖，除此之外，還含有果膠、纖維素、蛋白質(zhì)和微量元素等 成分，是一種重要的非糧食生物質(zhì)能源。與傳統(tǒng)的淀粉質(zhì)原料不同，菊糖是由D-呋喃果糖 通過β -2, 1糖苷鍵相連而成的多聚果糖，其還原性末端通常為葡萄糖殘基；與另外富含菊 糖的植物相比，菊芋中菊糖聚合度一般較低，容易實現(xiàn)微生物的轉(zhuǎn)化。目前利用菊芋發(fā)酵生 產(chǎn)酒精和單細胞蛋白已有報道，但附加值較低，無法實現(xiàn)菊芋資源的大規(guī)模高效利用，而利 用菊芋發(fā)酵生產(chǎn)DHA等高值產(chǎn)品并未見報道。
[0005] 果葡糖漿是通過對植物來源的淀粉質(zhì)進行水解和異構(gòu)化處理而生產(chǎn)的，是一種重 要的調(diào)味劑。由于生產(chǎn)果葡糖漿不受季節(jié)限制，設備簡單，原料及投資費用低，故其生產(chǎn)成 本大大降低，經(jīng)常用來替代單一葡萄糖、果糖和蔗糖等作為調(diào)味劑。果葡糖漿主要成分是果 糖和葡萄糖等可發(fā)酵單糖，發(fā)酵性能好，很多微生物能夠利用果葡糖漿快速生長。果葡糖漿 還原糖含量高，同時具有較好的溶解性，且抗結(jié)晶性和流動性好，適用于任何條件下高糖培 養(yǎng)基的配制及發(fā)酵過程?；诠咸菨{的諸多優(yōu)勢，利用其生產(chǎn)高值產(chǎn)品（如DHA)的方法 尚未報道。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是基于DHA生產(chǎn)成本以及菊芋水解液和果葡糖漿在發(fā)酵過程中的 優(yōu)勢，本發(fā)明旨在提供一種以果糖為優(yōu)勢碳源、高產(chǎn)DHA的裂殖壺菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70,及其利用菊芋水解液或果葡糖漿發(fā)酵生產(chǎn)DHA的方法。本發(fā)明有效降低了 DHA 生產(chǎn)成本，有效利用了菊芋或果葡糖漿資源，且整個工藝流程簡單，設備要求低，可控性強， 適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明提供一株新菌株一裂殖壺菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70,保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NO !M2014215,保藏日期為2014年5月21日，保藏地 址為中國武漢，武漢大學，郵編430072。本發(fā)明所述裂殖壺菌YLH70利用的碳源是葡萄糖、 果糖、鹿糖、乳糖、麥芽糖、淀粉、甘油、橄欖油和木糖中的一種或幾種；可利用的氮源是酵母 粉、蛋白胨、玉米漿和豆餅粉中的一種或幾種，脂肪酸主要包括十四烷酸、十六烷酸、二十二 碳五烯酸（EPA)和二十二碳六烯酸（DHA)。
[0009] 本發(fā)明還提供一種所述裂殖壺菌YLH70在合成二十二碳六烯酸中的應用，具體所 述的應用為：將裂殖壺菌YLH70接種至以菊芋水解液或果葡糖漿為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基 中，在20-32°C、通氣量20-100L/min、攪拌速度200-600rpm、溶氧量10-60%的條件下，培養(yǎng) 時間2-6天，獲得發(fā)酵液；將發(fā)酵液離心，取沉淀，獲得含二十二碳六烯酸的菌體，從菌體分 離提取獲得二十二碳六烯酸；所述菊芋水解液制備方法為：將新鮮菊芋清洗、切片、干燥、 粉碎制成菊芋粉末，再將菊芋粉末于硫酸水溶液中，60-100°C提取30-300min，過濾，取濾液 調(diào)節(jié)pH值至4. 0-7. 0后添加菊糖酶、果膠酶和纖維素酶，再在30-60°C下水解5-48h，過濾， 取濾液即為菊芋水解液，所述硫酸水溶液的體積用量以菊芋粉重量計為l_15mL/g。
[0010] 進一步，優(yōu)選所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：酵母粉5-30g/L，海鹽5-30g/L，硫胺素 0· 01-0. lmg/L，鈷胺素 (λ 001-0. 01mg/L，七水硫酸鐵 l-10mg/L，五水硫酸銅(λ 5-5mg/L，七 水硫酸鋅〇. 5-5mg/L，一水硫酸錳0. 1-lmg/L，添加菊芋水解液或果葡糖漿使發(fā)酵培養(yǎng)基總 還原糖濃度達到40-100g/L，pH值5. 0-7. 0 (優(yōu)選使用體積濃度40%的NaOH水溶液調(diào)pH 至5. 0-7. 0,115°C滅菌30min)。更優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：酵母粉20g/L，海鹽20g/L，硫胺 素0· lmg/L，鈷胺素 (λ 004-0. 005mg/L，七水硫酸鐵5-7mg/L，五水硫酸銅L 5mg/L，七水硫酸 鋅I. 5mg/L，一水硫酸錳0. 5mg/L，添加菊芋水解液或果葡糖漿使培養(yǎng)基總還原糖濃度達到 60-100g/L，pH值6. 0-7. 0 (優(yōu)選使用體積濃度40%的NaOH水溶液調(diào)pH至6. 0-7. 0,115°C 滅菌 30min)。
[0011] 進一步，本發(fā)明所述菊芋水解液制備方法為：將新鮮菊芋清洗、切片后在40-80°C 烘箱中烘干，粉碎過60目篩，獲得菊芋粉；將菊芋粉與體積濃度1-10%的硫酸水溶液混合， 在60-100°C反應30-300min，過濾，濾液調(diào)節(jié)pH至4. 0-7. 0后添加菊糖酶、果膠酶和纖維素 酶，在30-60°C下水解5-48h，過濾，濾液即為菊芋水解液；所述硫酸水溶液的體積用量以菊 芋粉重量計為l_5mL/g，所述菊糖酶的用量以菊芋粉重量計為5-80U/g(優(yōu)選為5-40U/g)， 果膠酶的用量以菊芋粉重量計為〇. 5-10U/g(優(yōu)選為0. 5-5U/g)，纖維素酶的用量以菊芋粉 重量計為10_80U/g(優(yōu)選為10-30U/g)。
[0012] 進一步，本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)選為：溫度25-30°C，通氣量40-100L/min，攪拌速 度200-600rpm，溶氧量40-60%的條件下，培養(yǎng)時間4-6天，獲得發(fā)酵液。
[0013] 進一步，本發(fā)明所述裂殖壺菌YLH70在發(fā)酵培養(yǎng)前先進行擴大培養(yǎng)，所述擴大培 養(yǎng)的方法為：將裂殖壺菌YLH70轉(zhuǎn)接到海水平板上，28°C倒置靜止培養(yǎng)3天，得到單菌落； 將單菌落接入含50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震蕩培養(yǎng)2天，得一級 種子液；將一級種子液以體積濃度1 %接種量接入含150mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中， 28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)2天，得二級種子液；將二級種子液以體積濃度5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā) 酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)；所述海水平板終濃度組成為：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨 5g/L，海鹽20g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水，pH值為6. 0 ;所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：酵 母粉10g/L，海鹽20g/L，添加菊芋水解液或果萄糖漿使培養(yǎng)基還原糖濃度為40g/L，溶劑為 水，pH 值 6.0。
[0014] 本發(fā)明所述裂殖壺菌YLH70發(fā)酵培養(yǎng)中，當培養(yǎng)體系中還原糖濃度低于IOg/ L時，使用菊芋水解液或果葡糖漿按照分批補料或流加方式使培養(yǎng)基總還原糖濃度達到 40-100g/L進行發(fā)酵，直到結(jié)束得到裂殖壺菌發(fā)酵液。
[0015] 本發(fā)明所述菊芋（Jerusalem artichoke)，又名洋姜、五星草，是菊科、向日葵屬宿 根性草本植物，菊科、管狀花亞科、向日葵族、向日葵屬、被子植物門、五膜草屬、木蘭門、菊 芋種，洋姜亞種。
[0016] 本發(fā)明所述從菌體分離提取獲得二十二碳六烯酸方法為：蔣發(fā)酵液5000rpm、4°C 下離心5min，棄上清液得到菌體，然后使用蒸餾水洗滌菌體2次，-40°C冷凍干燥至菌體 恒重，即為凍干菌體；將凍干菌體在液氮下研磨至粉末狀，獲得裂殖壺菌YLH70干菌粉；稱 取Ig干菌粉加入5mL飽和NaCl水溶液充分混勻，用5mL正己烷萃取3次，合并萃取液，在 40°C下將萃取液蒸干，獲得油脂；再用正己烷將0. 592g油脂定容至10mL，取5mL并加入5mL 0. 4M的KOH甲醇水溶液，60°C皂化lh，向皂化液中加入5mL(體積濃度，v/v) 14%的三氟化 硼甲醇溶液，60°C甲酯化lh，甲酯化反應液用2mL正己烷萃取3次，合并萃取液，獲得DHA粗 品。
[0017] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：
[0018] 本發(fā)明的原料是非糧食資源菊芋及植物淀粉來源的果葡糖漿，產(chǎn)量大且價格低 廉，可以降低DHA的生產(chǎn)成本；菊芋水解液和果葡糖漿含有高濃度的還原糖，且以果糖、低 聚果糖和葡萄糖等易發(fā)酵糖類為主，成為裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的潛在碳源；本發(fā)明提供發(fā)酵 性能優(yōu)良的裂殖壺菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70菌株，在以菊芋水解液作為唯一碳源 的培養(yǎng)基中，發(fā)酵生物量可達54. 61-76. 52g/L，DHA產(chǎn)量可達12. 56-18. 78g/L ;而以果葡糖 漿作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，發(fā)酵生物量可達70. 51-79. 85g/L，DHA產(chǎn)量可達14. 1-20. Ig/ L0 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1是裂殖壺菌YLH70的平板菌落形態(tài)。
[0020] 圖2是裂殖壺菌YLH70的顯微鏡細胞形態(tài)（400 X)。
[0021] 圖3是基于18SrDNA序列的進化樹。 (五）

【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0023] 實施例1裂殖壺菌YLH70的分離及鑒定
[0024] (1)菌株YLH70的分離
[0025] 在浙江省溫州市樂清灣海邊采集腐葉樣品，洗凈放于表面懸浮0. Ig松花粉的YP 培養(yǎng)液（lg/L酵母粉，lg/L蛋白胨，50mg/L氨芐青霉素，50mg/L鏈霉素，水配制，pH值6. 0) 中，30°〇黑暗培養(yǎng)1周，取50^培養(yǎng)物涂布于￥?平板（18/1酵母粉，18/1蛋白胨，5〇11^/1 氨芐青霉素，50mg/L鏈霉素，瓊脂20g/L，水配制，pH值6. 0)上，28°C培養(yǎng)3天，直到長出單 菌落，重復劃線純化培養(yǎng)三次，得到純的菌株，記為菌株YLH70。
[0026] ⑵菌株YLH7O的鑒定
[0027] 將菌株YLH70接種在YP平板上，28°C培養(yǎng)2天，菌落呈黃白色，圓形，表面濕潤光 滑，微微隆起（圖1);在顯微鏡下細胞呈圓形或橢圓形，直徑5-20 μ m，細胞表面比較明亮， 有鱗片狀結(jié)構(gòu)，邊緣清晰，細胞分裂增殖，有偶數(shù)個細胞聚集在一起的現(xiàn)象（圖2)。
[0028] 菌株 YLH70 的 18SrDNA 序列見 SEQ ID No. 1 所不。與 Aurantiochytrium sp.菌 株KRS101、BLll和TF23的18SrDNA序列相似度可達99%，另外基于18SrDNA序列的進 化樹（圖3)顯不菌株YLH70與Aurantiochytrium sp. KRSlOl、BLll和TF23菌株很好的 聚在一起，故將將菌株YLH70鑒定為裂殖壺菌（Aurantiochytrium sp.)，命名為裂殖壺菌 (Aurantiochytrium sp.)YLH70〇
[0029] 實施例2菊芋水解液的制備
[0030] 將約5000g新鮮菊芋（Jerusalem artichoke)洗凈，切片，在80°C烘箱中放置24h 烘干。將干燥的菊芋片經(jīng)固體粉碎機粉碎，使用60目的網(wǎng)篩過濾，獲得菊芋粉。稱取IOOOg 菊芋粉，與3000mL的體積濃度3%硫酸水溶液混合，80°C下酸解240min，過濾得到菊芋汁 (即濾液），IM的NaOH水溶液調(diào)pH至6. 0。向濾液中添加菊糖酶40U/g菊芋粉，果膠酶2U/ g菊芋粉，纖維素酶l〇U/g菊芋粉，在溫度50°C下水解24h，過濾制成菊芋水解液，其還原糖 濃度是145g/L，S卩為菊芋水解液。
[0031] 實施例3菊芋水解液的制備
[0032] 將約5000g新鮮菊芋洗凈，切片，在40°C烘箱中放置48h烘干。將干燥的菊芋片經(jīng) 固體粉碎機粉碎，使用60目的網(wǎng)篩過濾，獲得菊芋粉。稱取3000g菊芋粉，與3000mL的體 積濃度10%硫酸水溶液混合，l〇〇°C下酸解30min，過濾得到菊芋汁，IM的NaOH水溶液調(diào)pH 至6. 0。向菊芋汁中添加菊糖酶5U/g菊芋粉，果膠酶0. 5U/g菊芋粉，纖維素酶10U/g菊芋 粉，在溫度30°C下水解48h，過濾制成菊芋水解液，其還原糖濃度是256g/L。
[0033] 實施例4菊芋水解液的制備
[0034] 將約5000g新鮮菊芋洗凈，切片，在60°C烘箱中放置32h烘干。將干燥的菊芋片經(jīng) 固體粉碎機粉碎，使用60目的網(wǎng)篩過濾，獲得菊芋粉。稱取600g菊芋粉，與3000mL的體積 濃度1 %硫酸水溶液混合，60°C下酸解300min，過濾得到菊芋汁，IM的NaOH水溶液調(diào)pH至 6. 0。向菊芋汁中添加菊糖酶30U/g菊芋粉，果膠酶5U/g菊芋粉，纖維素酶30U/g菊芋粉， 在溫度60°C下水解5h，過濾制成菊芋水解液，其還原糖濃度是90g/L。
[0035] 實施例5裂殖壺菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70菌株利用菊芋水解液發(fā)酵生產(chǎn) DHA
[0036] (1)裂殖壺菌YLH70利用菊芋水解液發(fā)酵生產(chǎn)DHA
[0037] 將_80°C保存的裂殖壺菌YLH70菌株轉(zhuǎn)接到海水平板上，28°C倒置靜止培養(yǎng)3天， 得到單菌落。將單菌落接入含50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震蕩培養(yǎng)2 天，得一級種子液；將一級種子液以體積濃度1%接種量接入含150mL種子培養(yǎng)基的500mL 三角瓶中，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)2天，得二級種子液；將二級種子液以體積濃度5%的接種 量轉(zhuǎn)入含發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中（裝液量為3L)，發(fā)酵罐溫度28°C，通氣量40L/min，攪 拌轉(zhuǎn)速600rpm，溶氧量40 %。當發(fā)酵液還原糖濃度低于10g/L時，通過實施例3配制的菊 芋水解液分批補料使培養(yǎng)基還原糖濃度達到60g/L，發(fā)酵4天停止，得到裂殖壺菌YLH70發(fā) 酵液。
[0038] 海水平板終濃度組成為：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，海鹽20g/L，瓊 脂20g/L，溶劑水，pH值6.0。
[0039] 種子培養(yǎng)基組成：酵母粉10g/L，海鹽20g/L，添加菊芋水解液（實施例3配制）和 水使培養(yǎng)基還原糖濃度為40g/L，使用質(zhì)量濃度40% NaOH水溶液調(diào)pH至6. 0,121°C高壓 蒸汽滅菌20min待用；發(fā)酵培養(yǎng)基組成：酵母粉20g/L，海鹽20g/L，硫胺素0. lmg/L，鈷胺 素0. 005mg/L，七水硫酸鐵5mg/L，五水硫酸銅I. 5mg/L，七水硫酸鋅I. 5mg/L，一水硫酸猛 0. 5mg/L，添加菊芋水解液（實施例3配制）使培養(yǎng)基還原糖濃度為100g/L，溶劑為水，使用 質(zhì)量濃度40% NaOH水溶液調(diào)pH至6. 0,121 °C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0040] ⑵DHA的提取和分析
[0041] 取步驟（1)中裂殖壺菌發(fā)酵液40ml到50mL離心管中，5000rpm和4°C下離心5min， 棄上清液得到菌體，然后使用蒸餾水洗滌菌體2次，-40°C冷凍干燥至菌體恒重，菌體生物 量是65. 35g/L，即為凍干菌體。
[0042] 將凍干菌體在液氮下研磨至粉末狀，獲得裂殖壺菌YLH70干菌粉。稱取Ig裂殖壺 菌YLH70干菌粉至帶有螺帽的50mL離心管中，加入5mL飽和NaCl水溶液充分混勻，5mL正 己烷萃取3次，合并萃取液。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40°C下將萃取液蒸干，獲得油脂0. 592g，占細 胞干重的59. 2%。
[0043] 使用正己烷將0. 592g油脂定容至10mL，取5mL并加入5mL 0. 4M的KOH甲醇水溶 液，60°C皂化lh，向皂化液中加入5mL(體積濃度，v/v) 14%的三氟化硼甲醇溶液，60°C甲酯 化lh，甲酯化反應液用2mL正己烷萃取3次，合并萃取液并用正己烷定容至10mL，使用安捷 倫6890N氣相色譜儀分析。HP-INN0WAX毛細血管柱（30mX0. 25mmX0. 25 μπι)，氦氣作為載 氣，流量是lmL/min，進樣口溫度250°C，檢測器溫度250°C，進樣量lyL?？販爻绦颍?00°C 以15°C /min速度升至240°C，并保持10min。以十九烷酸甲酯作為內(nèi)標。測得DHA產(chǎn)量可 達 16. 78g/L。
[0044] 實施例6裂殖壺菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70菌株利用菊芋水解液發(fā)酵生產(chǎn) DHA
[0045] 將_80°C保存的裂殖壺菌YLH70菌株轉(zhuǎn)接到海水平板上，28°C倒置靜止培養(yǎng)3天， 得到單菌落。將單菌落接入含50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震蕩培養(yǎng)2 天，得一級種子液；將一級種子液以體積濃度1%接種量接入含150mL種子培養(yǎng)基的500mL 三角瓶中，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)2天，得二級種子液；將二級種子液以體積濃度5%的接種 量轉(zhuǎn)入含發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中（裝液量為3L)，發(fā)酵罐溫度25°C，通氣量100L/min，攪 拌轉(zhuǎn)速200rpm，溶氧量40 %。當還原糖濃度低于10g/L時，通過實施例3配制的菊芋水解 液分批補料使培養(yǎng)基還原糖濃度達到60g/L，發(fā)酵6天停止，得到裂殖壺菌YLH70發(fā)酵液。
[0046] 種子培養(yǎng)基組分見實施例5,發(fā)酵培養(yǎng)基組成：酵母粉20g/L，海鹽20g/L，硫胺素 0· lmg/L，鈷胺素0· 005mg/L，七水硫酸鐵5mg/L，五水硫酸銅I. 5mg/L，七水硫酸鋅I. 5mg/L， 一水硫酸錳0. 5mg/L，添加菊芋水解液（實施例3配制）使培養(yǎng)基還原糖濃度為80g/L，溶 劑為水，使用質(zhì)量濃度40% NaOH水溶液調(diào)pH至6. 0,121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。生 物量、油脂和DHA的分析見實施例5,菌體生物量是69. 8g/L，油脂占細胞干重的49. 1 %，DHA 產(chǎn)量可達17. 20g/L。
[0047] 實施例7裂殖壺菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70菌株利用菊芋水解液發(fā)酵生產(chǎn) DHA
[0048] 將-80°C保存的裂殖壺菌YLH70菌株轉(zhuǎn)接到海水平板上，28°C倒置靜止培養(yǎng)3天， 得到單菌落。將單菌落接入含50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震蕩培養(yǎng)2 天，得一級種子液；將一級種子液以體積濃度1%接種量接入含150mL種子培養(yǎng)基的500mL 三角瓶中，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)2天，得二級種子液；將二級種子液以體積濃度5%的接種 量轉(zhuǎn)入含發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中（裝液量為3L)，發(fā)酵罐溫度30°C，通氣量60L/min，攪 拌轉(zhuǎn)速400rpm，溶氧量60 %。當還原糖濃度低于10g/L時，通過實施例3配制的菊芋水解 液分批補料使培養(yǎng)基還原糖濃度達到60g/L，發(fā)酵5天停止，得到裂殖壺菌YLH70發(fā)酵液。
[0049] 種子培養(yǎng)基組分見實施例5,發(fā)酵培養(yǎng)基組成：酵母粉20g/L，海鹽20g/L，硫胺素 0· lmg/L，鈷胺素0· 005mg/L，七水硫酸鐵5mg/L，五水硫酸銅I. 5mg/L，七水硫酸鋅I. 5mg/L， 一水硫酸錳0. 5mg/L，添加菊芋水解液（實施例3配制）使培養(yǎng)基還原糖濃度為60g/L，溶 劑為水，使用質(zhì)量濃度40% NaOH水溶液調(diào)pH至6. 0,121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。生 物量、油脂和DHA的分析見實施例5,菌體生物量是72. 14g/L，油脂占細胞干重的45. 5%， DHA產(chǎn)量可達15. 78g/L。
[0050] 實施例8裂殖壺菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70菌株利用果葡糖衆(zhòng)發(fā)酵生產(chǎn) DHA
[0051] 將_80°C保存的裂殖壺菌YLH70菌種轉(zhuǎn)接到海水平板上，28°C倒置靜止培養(yǎng)3天， 得到單菌落。將單菌落接入含50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震蕩培養(yǎng)2 天，得一級種子液；將一級種子液以體積濃度1%接種量接入含150mL種子培養(yǎng)基的500mL 三角瓶中，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)2天，得二級種子液；將二級種子液以體積濃度5%轉(zhuǎn)入含 發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐溫度28°C，通氣量60L/min，攪拌轉(zhuǎn)速600rpm，溶氧量60%。 當還原糖濃度低于l〇g/L時，通過果葡糖漿分批補料使培養(yǎng)基還原糖濃度達到80g/L，發(fā)酵 4天停止，得到裂殖壺菌YLH70發(fā)酵液。
[0052] 種子培養(yǎng)基組成：酵母粉20g/L，海鹽20g/L，添加果葡糖漿液使培養(yǎng)基還原糖 濃度為40g/L，溶劑為水，使用質(zhì)量濃度40 % NaOH水溶液調(diào)pH至6. 0,121 °C高壓蒸汽 滅菌20min待用；發(fā)酵培養(yǎng)基組成：酵母粉20g/L，海鹽20g/L，硫胺素0. 05mg/L，鈷胺素 0. 004mg/L，七水硫酸鐵7mg/L，五水硫酸銅I. 5mg/L，七水硫酸鋅I. 5mg/L，一水硫酸猛 0. 5mg/L，添加果葡糖漿液使還原糖濃度為100g/L，溶劑為水，使用質(zhì)量濃度40 % NaOH水溶 液調(diào)pH至6. 0,121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0053] 生物量、油脂和DHA的分析見實施例5,菌體生物量是75. 24g/L，油脂占細胞干重 的 52. 15%，DHA 產(chǎn)量可達 18. 26g/L。
[0054] 實施例9裂殖壺菌（Aurantiochytrium sp.) YLH70菌株利用果葡糖衆(zhòng)發(fā)酵生產(chǎn) DHA
[0055] 將-80°C保存的裂殖壺菌YLH70菌種轉(zhuǎn)接到海水平板上，28°C倒置靜止培養(yǎng)3天， 得到單菌落。將單菌落接入含50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震蕩培養(yǎng)2 天，得一級種子液；將一級種子液以體積濃度1%接種量接入含150mL種子培養(yǎng)基的500mL 三角瓶中，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)2天，得二級種子液；將二級種子液以體積濃度5%接種 量轉(zhuǎn)入含發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐溫度25°C，通氣量100L/min，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，溶 氧量40%。當還原糖濃度低于10g/L時，通過果葡糖漿分批補料使培養(yǎng)基還原糖濃度達到 80g/L，發(fā)酵5天停止，得到裂殖壺菌YLH70發(fā)酵液。
[0056] 種子培養(yǎng)基組分見實施例8 ;發(fā)酵培養(yǎng)基組成：酵母粉20g/L，海鹽20g/L，硫胺素 0· 05mg/L，鈷胺素0· 004mg/L，七水硫酸鐵7mg/L，五水硫酸銅I. 5mg/L，七水硫酸鋅I. 5mg/ L，一水硫酸錳0. 5mg/L，添加果葡糖漿（購自湖北德安府糖業(yè)有限責任公司）使培養(yǎng)基還原 糖濃度為80g/L，溶劑為水，使用質(zhì)量濃度40% NaOH水溶液調(diào)pH至6. 0,121 °C高壓蒸汽滅 菌20min待用。
[0057] 生物量、油脂和DHA的分析見實施例5,菌體生物量是78. 15g/L，油脂占細胞干重 的 55%，DHA 產(chǎn)量可達 19. 52g/L。
[0058] 實施例10裂殖壺菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70菌株利用果葡糖衆(zhòng)發(fā)酵生產(chǎn) DHA
[0059] 將-80°C保存的裂殖壺菌YLH70菌種轉(zhuǎn)接到海水平板上，28°C倒置靜止培養(yǎng)3天， 得到單菌落。將單菌落接入含50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震蕩培養(yǎng)2 天，得一級種子液；將一級種子液以體積濃度1%接種量接入含150mL種子培養(yǎng)基的500mL 三角瓶中，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)2天，得二級種子液；將二級種子液以體積濃度5%接種 量轉(zhuǎn)入含發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐溫度30°C，通氣量40L/min，攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，溶 氧量60%。當還原糖濃度低于10g/L時，通過果葡糖漿分批補料使培養(yǎng)基還原糖濃度達到 80g/L，發(fā)酵6天停止，得到裂殖壺菌YLH70發(fā)酵液。
[0060] 種子培養(yǎng)基組分見實施例8 ;發(fā)酵培養(yǎng)基組成：酵母粉20g/L，海鹽20g/L，硫胺素 0· 05mg/L，鈷胺素0· 004mg/L，七水硫酸鐵7mg/L，五水硫酸銅I. 5mg/L，七水硫酸鋅I. 5mg/ L，一水硫酸錳0. 5mg/L，添加果葡糖漿使培養(yǎng)基還原糖濃度為60g/L，溶劑為水，使用質(zhì)量 濃度40% NaOH水溶液調(diào)pH至6. 0,121 °C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0061] 生物量、油脂和DHA的分析見實施例5,菌體生物量是70. 51g/L，油脂占細胞干重 的 43. 6%，DHA 產(chǎn)量可達 14. 28g/L。
【權(quán)利要求】
1. 裂殖壺菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編 號CCTCC NO :M2014215,保藏日期為2014年5月21日，保藏地址為中國武漢，武漢大學，郵 編 430072。
2. -種權(quán)利要求1所述裂殖壺菌YLH70在合成二十二碳六烯酸中的應用。
3. 如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于所述的應用為：將裂殖壺菌YLH70接種至以 菊芋水解液或果葡糖漿為唯一碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在20-32°C、通氣量20-100L/min、攪 拌速度200-600rpm、溶氧量10-60%的條件下，培養(yǎng)時間2-6天，獲得發(fā)酵液；將發(fā)酵液離 心，取沉淀，獲得含二十二碳六烯酸的菌體，從菌體分離提取獲得二十二碳六烯酸；所述菊 芋水解液制備方法為：將新鮮菊芋清洗、切片、干燥、粉碎制成菊芋粉末，再將菊芋粉末于硫 酸水溶液中，60-100°C提取30-300min，過濾，取濾液調(diào)節(jié)pH值至4. 0-7. 0后添加菊糖酶、果 膠酶和纖維素酶，再在30-60°C下水解5-48h，過濾，取濾液即為菊芋水解液，所述硫酸水溶 液的體積用量以菊芋粉重量計為l_15mL/g。
4. 如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：酵母粉5-30g/L，海 鹽5-30g/L，硫胺素0? 01-0. lmg/L，鈷胺素0? 001-0. 01mg/L，七水硫酸鐵l-10mg/L，五水硫 酸銅0. 5-5mg/L，七水硫酸鋅0. 5-5mg/L，一水硫酸猛0. 1-lmg/L，添加菊芋水解液或果葡糖 漿使發(fā)酵培養(yǎng)基總還原糖濃度達到40-100g/L，溶劑為水，pH值5. 0-7. 0。
5. 如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述菊芋水解液制備方法為：將新鮮菊芋 清洗、切片后在40-80°C烘箱中烘干，粉碎過60目篩，獲得菊芋粉；將菊芋粉與體積濃度 1-10%的硫酸水溶液混合，在60-100°C反應30-300min，調(diào)節(jié)pH至4. 0-7. 0,添加菊糖酶、果 膠酶和纖維素酶，在30-60°C下水解5-48h，過濾，濾液即為菊芋水解液；所述硫酸水溶液的 體積用量以菊芋粉重量計為l_5mL/g，所述菊糖酶的用量以菊芋粉重量計為5-80U/g，果膠 酶的用量以菊芋粉重量計為〇. 5-10U/g，纖維素酶的用量以菊芋粉重量計為10-80U/g。
6. 如權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于添加菊芋水解液或果葡糖漿使培養(yǎng)基總還原 糖濃度達到60-100g/L。
7. 如權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：酵母粉20g/L，海鹽20g/ L，硫胺素0? lmg/L，鈷胺素0? 004-0. 005mg/L，七水硫酸鐵5-7mg/L，五水硫酸銅1. 5mg/L，七 水硫酸鋅1. 5mg/L，一水硫酸猛0. 5mg/L，添加菊芋水解液或果葡糖衆(zhòng)使培養(yǎng)基總還原糖濃 度達到60-100g/L，溶劑為水，使用體積濃度40%的NaOH水溶液調(diào)pH至6. 0-7. 0。
8. 如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)條件為：在25-30 °C，通氣量 40-100171^11，攪拌速度200-600印111，溶氧量40-60%的條件下，培養(yǎng)時間4-6天，獲得發(fā)酵 液。
9. 如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于裂殖壺菌YLH70在發(fā)酵培養(yǎng)前先進行擴大 培養(yǎng)，所述擴大培養(yǎng)的方法為：將裂殖壺菌YLH70轉(zhuǎn)接到海水平板上，28°C倒置靜止培養(yǎng)3 天，得到單菌落；將單菌落接入含50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震蕩培 養(yǎng)2天，得一級種子液；將一級種子液以體積濃度1 %的接種量接入含150mL種子培養(yǎng)基的 500mL三角瓶中，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)2天，得二級種子液；將二級種子液以體積濃度5% 的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)；所述海水平板終濃度組成為：葡萄糖20g/L，酵母 粉l〇g/L，蛋白胨5g/L，海鹽20g/L，瓊脂20g/L，溶劑為水，pH值為6. 0 ;所述種子培養(yǎng)基終 濃度組成為：酵母粉l〇g/L，海鹽20g/L，添加菊芋水解液或果葡萄糖漿使培養(yǎng)基還原糖濃 度為40g/L，溶劑為水，pH值6. 0。
【文檔編號】C12R1/645GK104498371SQ201410854830
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】于欣君, 汪釗, 鄭建永, 章銀軍 申請人:浙江工業(yè)大學