與豬肌肉pH值性狀相關的分子標記的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于家畜分子標記制備【技術領域】，具體涉及與豬肌肉pH值性狀相關的SNP分子標記。所述的分子標記由LDHA基因克隆得到，其核苷酸序列如附圖4所示。在附圖4所示序列的第495位有一個等位基因G或A的堿基替換；在該序列的第635位有一個等位基因C或T的堿基替換。本發(fā)明為豬的標記輔助選擇提供了新的分子標記。
【專利說明】與豬肌肉pH值性狀相關的分子標記

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于家畜分子標記制備【技術領域】，具體涉及一個與豬肉PH值性狀相關的 分子標記的應用。

【背景技術】
[0002] 我國肉制品的主要來源是豬肉，隨著生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，其產量已經能夠滿足人 們的需求，所以對豬肉品質的改善已經成為豬育種學研宄的熱點問題。肉質的改善可以從 遺傳，營養(yǎng)和疾病防治等多方面考慮，其中，遺傳因素是內在原因。通過分子遺傳手段進行 品種選育，可以從源頭上有效的改善豬肉品質。
[0003] 肉質的評價指標包括肉色、pH值、系水力、滴水損失、大理石紋等（崔敏.淺談影 響豬肉品質的因素[J].中國豬業(yè)，2014,9(1) :57-60.)，而pH值與肉色和系水力以及ATP、 糖原和乳酸含量有著密切的關系，同時，根據屠宰后糖原分解終止時的PH值，可以區(qū)分PSE 肉，正常肉和DFD肉，所以pH值是判定肉質的非常重要的指標。（陳松，馮月榮，曹淑萍.pH 值對屠宰肉品質的影響[J].肉類工業(yè)，2009(6) :21-23.)但是，pH值的測定只能在屠宰之 后，極大的限制了選育工作的發(fā)展。所以，運用分子手段，選擇影響PH值的候選基因輔助選 種，成為改善肉質的重要的途徑。
[0004] LDHA基因是乳酸脫氫酶家族中的成員，其主要在骨骼肌中表達。乳酸脫氫酶是生 物體內無氧糖酵解最后一步的重要酶類，以NADH為輔酶催化乳酸和丙酮酸相互轉化。丙酮 酸在乳酸脫氫酶的催化下轉化成乳酸，反應同時釋放少量能量供機體利用。因此，乳酸脫氫 酶的活性將直接影響糖酵解的速度，從而導致PH值的差異。所以本發(fā)明選擇LDHA為候選 基因，通過對群體樣品的擴增，利用測序儀對DNA片段進行測序，從測序峰圖上直接讀取單 核苷酸多態(tài)性（SNP)位點的基因型，從而篩選出與pH值性狀相關的分子標記。
[0005] 本發(fā)明中，對LDHA基因的內含子區(qū)域進行擴增，發(fā)現(xiàn)兩個新的SNP位點，進一步完 善了豬的SNP信息庫，同時對肉質的改善具有重要意義。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供與豬肌肉pH值性狀相關的單核苷酸多態(tài)性（SNP)分子標 記。本發(fā)明另一個目的在于提供與豬肌肉PH值性狀相關的單核苷酸多態(tài)性分子標記的應 用。
[0007] 本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)：
[0008] 申請人:從報道的豬LDHA基因中克隆得到一個與豬肌肉pH值性狀相關的SNP分子 標記，該分子標記的核苷酸序列如下所示：
[0009] TAATGACTCATCTAGTATCGCTGCCTAAATATTTTCTTCATAGTGGATATCTTGACCTATGTGGCTTGG AAGATAAGTGGCTTTCCCAAAAACCGTGTTATTGGAAGTGGTTGCAATTTGGATTCAGCCCGGTTCCGTTACCTAAT GGGGGAAAGGCTGGGAGTTCACCCCCTAAGCTGTCATGGGTGGATCCTTGGGGAGCATGGAGACTCTAGTGGTAAGT ATAACTTATTTTCTCTGTGAAAGAAAGATGGTGTAAAAATTGATAGGAGTATCATTACTAAATCAGAGCCTAAATCA GATGTCCATTCTTTAGGGTAGAATGATTTCCAGGAATCTTTTATTTTGGTATAATTATATCCTAAGAATTGTAAAGA TTTTTAGCATTCTGTATGACATTTTCTGGTATAAGGGATATGGGATGAAATTTCTTTCTTACAGTAGACAGACATAT AATAAGATGATAGCTCTTAGGCTACTTCTTTTAATATCACRGCTGTTTATACTCAAACTGTTTAGCCCTGAAAGAGT CAGCCAAGCCAAATGGAGGGTATGAGAACAAATATTATTATCACAGTTGAAAGATGTTATCATTTGTGCAGAGTCCT CAGTTCCTTATGCCAAGAAAATTCCTRTTATGCTCTCATCCTGTTTCATCTCAATAGGTTAGGAAAATAGGTTAAAA TAAGAGTATAACTGATAGTATAAAACTGATAGTTTTACATAATCTAATCATTGAAAAGTTAAAAGTTGGGGTATTGG TAGTCTTGACCATCTCTACCAAAAGGGGGTAATCTTCCACAGATAAGACAATTTTAGAAGAATAGGTCAGGATGACT AGTTTGCTGGCTGGCGCATGAAAATAAATATATTCTATACTATTTCTTTTAGTGCCTGTGTGGAGCGGAGTAAATGT TGCTGGTGTCTCCCTGAAGAATCTGCACCCTGAATTAGGCACTGATGCAGATAAGGAACACTGGAAAGCAGTTCACA AACAGGTGGTGGACAGGTAATAGATCTCA
[0010] 上述序列共l〇22bp，第495位中的R是G或A ;第635位中的R是C或T。
[0011] 申請人:設計了擴增上述LDHA基因片段的引物對（該引物對也是擴增本發(fā)明的分 子標記的引物對），其DNA序列如下所示：
[0012] 正向引物：5' -TAATGACTCATCTAGTATCGCTGCC-3'，
[0013] 反向引物：5' -TGAGATCTATTACCTGTCCACCACC-3'。
[0014] 實施本發(fā)明的具體方法是：提取豬基因組DNA，根據NCBI公布的豬LDHA基因序列 信息（其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1或附圖4所示的序列）設計引物。用這些引物 對進行PCR擴增，得到1022bp的片段，其電泳圖如圖3所示。將PCR產物送至武漢擎科生 物公司測序公司測序，分析獲得SNP，并進行基因型與豬肌肉pH值性狀之間的關聯(lián)分析的 應用，為豬標記輔助選擇提供新的分子標記。
[0015] 更詳細的技術方案參見《【具體實施方式】》。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明克隆的豬LDHA基因全序列中的部分核苷酸序列，該 序列為等位基因突變后的序列，其495位的堿基由G突變?yōu)锳 ;第635位堿基由C突變?yōu)門。
[0017] 圖1 :是本發(fā)明的主要技術流程示意圖。
[0018] 圖2 :是LDHA基因部分序列PCR產物電泳圖。附圖標記說明：圖2中：M泳道為DNA 分子量標記（DL2000);擴增產物為1022bp。
[0019] 圖3 :是LDHA基因部分序列測序結果圖。
[0020] 圖4 :是本發(fā)明制備的分子標記的核苷酸序列，SNP位點是第495和第635位，上述 序列中的第495位中的R是G或A ;第635位中的R是C或T。

【具體實施方式】
[0021] 實施實例1
[0022] (一）豬基因組DNA提取
[0023] 本發(fā)明中提取豬基因組DNA的豬品種為大白豬（湖北金林原種畜牧有限公司）。豬 群體DNA樣品全部采用天根生化（北京）技術有限公司生產的基因組DNA試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit)提取，具體操作步驟如下：
[0024] 1、將大白豬的耳樣放入2mL的EP管中，用酒精棉擦拭干凈的眼科手術剪剪成糊狀 后加入200 μ L緩沖液GA (該試劑盒自帶）。
[0025] 2、加入20 μ L蛋白酶K溶液（該試劑盒自帶），混勻后置于56°C水浴鍋中消化過 夜。
[0026] 3、加入200 μ L緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置lOmin，溶液應變清亮，短暫離 心，去除管內壁的水珠。
[0027] 4、加入200 μ L無水乙醇，充分振蕩混勻15s，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，短暫離心 后，去除管內壁的水珠。
[0028] 5、將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入到一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12, OOOrpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
[0029] 6、向吸附柱CB3中加入500 μ L緩沖液⑶（該試劑盒自帶），12, OOOrpm離心30s， 倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0030] 7、向吸附柱CB3中加入600 yL漂洗液PW(該試劑盒自帶），12,000rpm離心30s， 倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0031] 8、重復操作步驟7。
[0032] 9、將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附柱的中間部位懸空滴加 50-200 μ L洗脫緩沖液TE (該試劑盒自帶），室溫放置2-5min，12, OOOrpm離心2min，將溶液 收集到離心管中。
[0033] 10、對提取出的DNA進行完整性鑒定和濃度檢測后，置于-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0034] (二）PCR擴增與測序
[0035] 從NCBI上下載LDHA基因（GenBank的收錄號：NC_010444. 3)的序列，設計引物擴 增，引物的DNA序列如下：
[0036] 正向引物：5, -TAATGACTCATCTAGTATCGCTGCC-3'，
[0037] 反向引物：5' -TGAGATCTATTACCTGTCCACCACC-3'。
[0038] PCR反應體系：反應總體系為10yL，包括DNA模板40ng，2XPCR Mix 5yL，正向 引物 3pmoL，反向引物 3pmoL，ddH20 3.4 yL。
[0039] PCR 反應程序：95°C預變性 5min，94°C 30s，59.9°C 30s，72°C 50s，循環(huán) 35 次，72°C 延伸5min，15°C停止反應。
[0040] PCR產物經2. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產物為1002bp。
[0041] 經過鑒定的PCR產物送至武漢擎科生物公司測序，測序分析結果如圖4所示。
[0042] (三）數(shù)據關聯(lián)分析
[0043] 本發(fā)明測定IOOkg體重日齡，IOOkg體重活體大白豬（樣本共計235頭大白豬）背 膘厚和眼肌面積，并結合全自動飼料轉化效率測定系統(tǒng)，計算平均日增重（Average daily gain, ADG)，飼料轉化率（Feed conversion rate, FCR)和剩余米食量（Residual feed intake，RFI)這三項指標，并根據農業(yè)部種豬測定中心大白豬群的群體結構，采用一般線性 模型（GLM)對單個SNP位點與豬群體校正后的各性狀數(shù)據進行關聯(lián)分析，闡明影響這些性 狀的基因型，統(tǒng)計模型如下：
[0044] Yij = μ +genotypej+ ε
[0045] 其中Yij為表型值；μ為群體均值；genotype 基因型效應；ε U為隨機誤差；相 互獨立且服從于N (0, 〇2)。
[0046] 表I LDHA基因 SNP位點第495位基因型與屠宰后24小時pH的關聯(lián)分析
[0047]

【權利要求】
1. 與大白豬肌肉pH值性狀相關的SNP分子標記，其特征在于，所述的分子標記的核苷 酸序列如下所示： TAATGACTCATCTAGTATCGCTGCCTAAATATTTTCTTCATAGTGGATATCTTGACCTATGTGGCTTGGAA GATAAGTGGCTTTCCCAAAAACCGTGTTATTGGAAGTGGTTGCAATTTGGATTCAGCCCGGTTCCGTTACCTAATG GGGGAAAGGCTGGGAGTTCACCCCCTAAGCTGTCATGGGTGGATCCTTGGGGAGCATGGAGACTCTAGTGGTAAGTA TAACTTATTTTCTCTGTGAAAGAAAGATGGTGTAAAAATTGATAGGAGTATCATTACTAAATCAGAGCCTAAATCAG ATGTCCATTCTTTAGGGTAGAATGATTTCCAGGAATCTTTTATTTTGGTATAATTATATCCTAAGAATTGTAAAGAT TTTTAGCATTCTGTATGACATTTTCTGGTATAAGGGATATGGGATGAAATTTCTTTCTTACAGTAGACAGACATATA ATAAGATGATAGCTCTTAGGCTACTTCTTTTAATATCACRGCTGTTTATACTCAAACTGTTTAGCCCTGAAAGAGTC AGCCAAGCCAAATGGAGGGTATGAGAACAAATATTATTATCACAGTTGAAAGATGTTATCATTTGTGCAGAGTCCTC AGTTCCTTATGCCAAGAAAATTCCTRTTATGCTCTCATCCTGTTTCATCTCAATAGGTTAGGAAAATAGGTTAAAAT AAGAGTATAACTGATAGTATAAAACTGATAGTTTTACATAATCTAATCATTGAAAAGTTAAAAGTTGGGGTATTGGT AGTCTTGACCATCTCTACCAAAAGGGGGTAATCTTCCACAGATAAGACAATTTTAGAAGAATAGGTCAGGATGACTA GTTTGCTGGCTGGCGCATGAAAATAAATATATTCTATACTATTTCTTTTAGTGCCTGTGTGGAGCGGAGTAAATGTT GCTGGTGTCTCCCTGAAGAATCTGCACCCTGAATTAGGCACTGATGCAGATAAGGAACACTGGAAAGCAGTTCACAA ACAGGTGGTGGACAGGTAATAGATCTCA 上述序列共l〇22bp，第495位中的R是G或A ;第635位中的R是C或T。
2. 擴增如權利要求1所述的分子標記的引物對，其DNA序列如下所示： 正向引物：5' -TAATGACTCATCTAGTATCGCTGCC-3'， 反向引物：5'-TGAGATCTATTACCTGTCCACCACC-3'。
3. 權利要求1所述的分子標記在大白豬肌肉pH值性狀檢測中的應用。
4. 權利要求2所述的引物對在大白豬肌肉pH值性狀檢測中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104480216SQ201410853566
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月31日 優(yōu)先權日:2014年12月31日
【發(fā)明者】趙書紅, 黃濟, 賀佳瑋, 曹建華, 李世軍, 李長春, 李新云 申請人:華中農業(yè)大學