本發(fā)明屬于生物，具體涉及表達(dá)gm-csf的非連續(xù)截短功能區(qū)的免疫工程細(xì)胞及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、對于腫瘤，傳統(tǒng)的手術(shù)摘除、化療、放療手段已經(jīng)不能滿足有效監(jiān)測和治療的目的，迫切需要有效的替代療法去攻克這個難題。近年來隨著免疫治療的出現(xiàn)腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)生了革命性的進(jìn)步，如免疫檢查點(diǎn)抑制劑，雙特異性抗體和car-t細(xì)胞療法均取得了令人矚目的成就。

2、嵌合抗原受體（car）是一種基因工程技術(shù)制造的人工受體分子，它可以賦予免疫效應(yīng)細(xì)胞（如t細(xì)胞、nk細(xì)胞）針對某個靶點(diǎn)抗原表位的特異性，從而增強(qiáng)淋巴細(xì)胞識別抗原信號與活化的功能。第一代car胞內(nèi)僅有cd3?ξ（含有3個itam）和fcrγ（含有2個itam）的信號傳導(dǎo)域，只能提供t細(xì)胞活化的第一信號。第一代car的早期臨床試驗(yàn)顯示，一代car-t不能有效的維持t細(xì)胞的增殖和活化，并未取得令人滿意的效果，表明一代car-t細(xì)胞可能缺乏足夠的激活信號來維持t細(xì)胞增值和有效的抗腫瘤作用。在第一代car-t的基礎(chǔ)上，開發(fā)了第二代car-t。第二代car-t細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的體內(nèi)擴(kuò)展和持久能力，其效果已在臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)。

3、之后car-t相關(guān)技術(shù)不斷被革新，但自1993年以來啟動的939項(xiàng)免疫細(xì)胞療法試驗(yàn)中，僅有大約一半是針對實(shí)體瘤。然而全球癌癥發(fā)病率中有90%為實(shí)體瘤。遺憾的是相比對血液腫瘤表現(xiàn)出的良好療效，大多數(shù)報(bào)道的利用car-t細(xì)胞治療實(shí)體瘤的效果在某些關(guān)鍵階段始終難以有效突破。因此，該領(lǐng)域依然需要技術(shù)創(chuàng)新。

4、nk細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的重要成員，主要存在于血液及淋巴器官中，不需要預(yù)先致敏，且無主要組織相容性復(fù)合物（mhc）限制性，可快速且直接殺傷靶細(xì)胞，具有廣譜的抗腫瘤作用。nk細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的方式多種多樣，一旦nk細(xì)胞內(nèi)的抑制信號和激活信號之間的平衡偏向激活，nk細(xì)胞就能與靶細(xì)胞形成突觸，從而釋放效應(yīng)顆粒以裂解靶細(xì)胞，并產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞因子。通過在nk細(xì)胞表面表達(dá)嵌合抗原受體（car）可明顯提高免疫細(xì)胞抗癌效果。目前科學(xué)界認(rèn)為，與car-t細(xì)胞相比，car-nk細(xì)胞具有一些顯著優(yōu)勢。然而，具有腫瘤殺傷效力的car-nk細(xì)胞的制備具有一些難度，主要表現(xiàn)在nk細(xì)胞因具有天然的抗病毒功能，其基因修飾難度大。

5、公布號為cn114934071a，發(fā)明名稱為“一種表達(dá)免疫調(diào)節(jié)因子的car載體及其應(yīng)用”的專利，公開了一種car-t細(xì)胞表達(dá)一種由病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的嵌合抗原受體及免疫調(diào)節(jié)因子，該免疫調(diào)節(jié)因子為粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（gm-csf）全長。nk細(xì)胞激活受體包括天然細(xì)胞毒性受體（ncr），如nkg2d、cd16（fcgriiia）、fasl和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（trail），以及共刺激受體，如lfa-1、cd244（2b4）和cd137（41bb）。而car-t細(xì)胞的胞內(nèi)信號激活域則主要為41bb、cd28及cd3?ζ，因此對car-t有作用的傳統(tǒng)car分子設(shè)計(jì)不一定能在nk細(xì)胞中發(fā)揮較好的激活作用。

6、綜上所述，有必要針對現(xiàn)有技術(shù)做出改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供表達(dá)gm-csf的非連續(xù)截短功能區(qū)的免疫工程細(xì)胞及制備方法和應(yīng)用，具體技術(shù)方案如下。

2、本發(fā)明的一方面在于提供了一種表達(dá)gm-csf的非連續(xù)截短功能區(qū)的car-nk細(xì)胞。

3、一種表達(dá)gm-csf的非連續(xù)截短功能區(qū)的car-nk細(xì)胞，所述car-nk細(xì)胞表達(dá)一種新型嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)；所述新型嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)包含gm-csf蛋白的非連續(xù)截短功能區(qū)片段和嵌合抗原受體；所述gm-csf蛋白的非連續(xù)截短功能區(qū)片段包括a?helix片段、c?helix片段和exon?2片段；所述gm-csf蛋白的非連續(xù)截短功能區(qū)片段與所述嵌合抗原受體通過p2a序列連接；所述嵌合抗原受體包括cd8信號肽、抗原識別區(qū)、鉸鏈區(qū)、人源cd8跨膜區(qū)、人源4-1bb共刺激信號區(qū)和人源cd3?ζ信號結(jié)構(gòu)域。

4、進(jìn)一步，所述gm-csf蛋白的非連續(xù)截短功能區(qū)片段的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

5、進(jìn)一步，所述新型嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)上還連接ef1-α啟動子序列。

6、進(jìn)一步，所述car-nk細(xì)胞表達(dá)的所述嵌合抗原受體的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

7、本發(fā)明的另一方面在于提供一種表達(dá)gm-csf的非連續(xù)截短功能區(qū)的car-t細(xì)胞。

8、一種表達(dá)gm-csf的非連續(xù)截短功能區(qū)的car-t細(xì)胞，所述car-t細(xì)胞表達(dá)一種新型嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)；所述新型嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)包含gm-csf蛋白的非連續(xù)截短功能區(qū)片段和嵌合抗原受體；所述gm-csf蛋白的非連續(xù)截短功能區(qū)片段包括a?helix片段、c?helix片段和exon?2片段；所述gm-csf蛋白的非連續(xù)截短功能區(qū)片段與所述嵌合抗原受體通過p2a序列連接；所述嵌合抗原受體包括cd8信號肽、抗原識別區(qū)、鉸鏈區(qū)、人源cd8跨膜區(qū)、人源4-1bb共刺激信號區(qū)和人源cd3?ζ信號結(jié)構(gòu)域。

9、進(jìn)一步，所述gm-csf蛋白的非連續(xù)截短功能區(qū)片段的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

10、進(jìn)一步，所述新型嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)上還連接ef1-α啟動子序列。

11、進(jìn)一步，所述car-t細(xì)胞表達(dá)的所述嵌合抗原受體的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

12、上述car-nk細(xì)胞在制備治療實(shí)體腫瘤的藥物中的應(yīng)用。上述car-t細(xì)胞在制備治療實(shí)體腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

13、與car-t細(xì)胞相比，car-nk細(xì)胞有一些顯著優(yōu)勢，包括：（1）細(xì)胞因子釋放綜合征和神經(jīng)毒性較小。（2）car-nk細(xì)胞可以通過car依賴性和car非依賴性兩個途徑殺死癌細(xì)胞。此外，nk細(xì)胞可通過cd16介導(dǎo)的adcc殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，nk細(xì)胞具有廣譜高效的殺瘤活性。（3）可以實(shí)現(xiàn)同種異體的回輸治療。

14、上述car-nk細(xì)胞或car-t可以通過表達(dá)gm-csf的非連續(xù)截短功能區(qū)來增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

15、本發(fā)明提供的car中的抗原結(jié)合域可以是靶向cd19、bcma、her2、claudin18.2、mesothelin、gpc3、gd2等。

16、進(jìn)一步，所述所述腫瘤包括血液瘤、肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、膠質(zhì)瘤、胰腺癌、肉瘤或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

17、本發(fā)明還可以包括一種上述car的制備方法或上述car-t或上述car-nk的制備方法。

18、有益技術(shù)效果：

19、一方面，本發(fā)明構(gòu)建了表達(dá)gm-csf的非連續(xù)截短功能區(qū)的免疫工程細(xì)胞，該免疫工程細(xì)胞表達(dá)一種新型嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)。相較于包含gm-csf全長蛋白，本發(fā)明的新型嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)僅包含了gm-csf全長蛋白的部分非連續(xù)截短功能區(qū)，減少了過表達(dá)基因的序列長度，但是并沒有影響car的表達(dá)和功能，相反，由于該非連續(xù)截短功能區(qū)不含信號肽，即其在胞內(nèi)即可發(fā)揮功能，提高car-t細(xì)胞的增殖能力。本發(fā)明的car-x4-t細(xì)胞的增殖能力顯著優(yōu)于常規(guī)car-t細(xì)胞和car-gm-t細(xì)胞。顯然的，本發(fā)明的car-x4-t細(xì)胞在用于工業(yè)化生產(chǎn)時其產(chǎn)量更高，生產(chǎn)成本更低，具有更大的工業(yè)化推廣價值。

20、另一方面，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在包含gm-csf全長蛋白相同數(shù)量功能區(qū)的前提條件下，不同的序列改造手段導(dǎo)致不同的技術(shù)效果。本發(fā)明證實(shí)了表達(dá)gm-csf的非連續(xù)截短功能區(qū)改造的car-nk細(xì)胞（car-x4-nk）比表達(dá)gm-csf的連續(xù)截短功能區(qū)改造的car-nk細(xì)胞（car-x5-nk）對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率更高，并且，其細(xì)胞因子的分泌能力整體更強(qiáng)，對car效果的增強(qiáng)更顯著。具體的，本發(fā)明的car-x4-nk細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞起殺傷作用的時間明顯早于常規(guī)car-nk細(xì)胞和car-x5-nk細(xì)胞，而car-x5-nk細(xì)胞的整體殺傷效果反而比常規(guī)car-nk細(xì)胞更弱。此外，car-x4-nk細(xì)胞和car-x5-nk細(xì)胞分泌的tnf-α和ifn-γ均顯著高于常規(guī)car-nk細(xì)胞，并且整體來看car-x4-nk細(xì)胞相較于car-x5-nk細(xì)胞具有更好的細(xì)胞因子分泌能力。因此本發(fā)明的car-x4-nk細(xì)胞可以作為一種細(xì)胞治療輔助產(chǎn)品，在抗腫瘤治療藥物的制備中發(fā)揮更大的作用。

21、最后，由于nk細(xì)胞改造與t細(xì)胞改造的差異，在car-t細(xì)胞上表達(dá)并且起作用的car結(jié)構(gòu)，在car-nk細(xì)胞上并不一定有相同的作用，需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。