本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及rpa-mnazyme檢測(cè)方法，即，不對(duì)稱rpa(asymmetric?rpa,arpa)與mnazyme聯(lián)用的快速檢測(cè)方法(oar-mna)。

背景技術(shù)：

1、核酸檢測(cè)作為生命科學(xué)領(lǐng)域的重要組成部分，廣泛應(yīng)用于植物、動(dòng)物和微生物dna的檢測(cè)中。其中，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase?chain?reaction，簡(jiǎn)稱pcr)因其高靈敏度和特異性，已成為一種有效、定量且能夠同時(shí)檢測(cè)細(xì)菌的有前途的策略(garrido&prado，2022)。然而，基于pcr的方案通常需要專業(yè)人員操作、昂貴的高精度溫度循環(huán)設(shè)備，并且反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)(約2小時(shí))，因此在診斷過(guò)程中顯得較為繁瑣(胡等人，2020)。由于這些局限性，pcr并不適合用于開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速、便攜的現(xiàn)場(chǎng)診斷技術(shù)。

2、針對(duì)這些需求，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，如環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(lamp)和重組聚合酶擴(kuò)增(rpa)等。這些技術(shù)以其操作簡(jiǎn)便、快速和經(jīng)濟(jì)高效的特點(diǎn)逐漸受到關(guān)注。在這些方法中，rpa因其在較低且廣泛的溫度范圍內(nèi)(25-42℃)進(jìn)行反應(yīng)，并且通常能夠在20分鐘內(nèi)完成反應(yīng)，成為一種非常適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)(poc)的工具。然而，rpa技術(shù)本身存在特異性不足的問(wèn)題，并且rpa使用的探針通常需要復(fù)雜的堿基修飾，增加了檢測(cè)成本。

3、近年來(lái)，另一種值得關(guān)注的新興擴(kuò)增技術(shù)是多組分核酸酶(mnazyme)。該技術(shù)源于dna酶，作為一種無(wú)酶的信號(hào)放大工具，廣泛應(yīng)用于高靈敏度的核酸檢測(cè)。典型的mnazyme結(jié)構(gòu)依賴于金屬離子，由兩個(gè)部分酶(partzyme?a和partzyme?b)組成。每個(gè)部分酶包含底物臂、部分催化核心和效應(yīng)器結(jié)合臂。目標(biāo)核酸作為組裝促進(jìn)劑，引導(dǎo)兩個(gè)部分酶結(jié)合，形成具有完整催化核心的mnazyme。該酶通過(guò)切割核酸底物片段實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。因此，mnazyme本質(zhì)上是一種通用的放大工具，具有高催化效率、操作簡(jiǎn)便、等溫反應(yīng)及成本低廉(無(wú)需催化酶)的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)調(diào)整partzyme?a和partzyme?b的底物臂堿基配對(duì)，可以根據(jù)不同的目標(biāo)序列定制mnazyme，從而做到用同一探針識(shí)別不同的目標(biāo)序列的目的。由于mnazyme探針僅rpa探針價(jià)格的三分之一，將rpa與mnazyme方法連用，可有效降低rpa反應(yīng)高成本問(wèn)題。此外，rpa與mnazyme系統(tǒng)的結(jié)合能夠顯著提高檢測(cè)靈敏度，并解決了特異性不足的問(wèn)題。

4、然而，mnazyme技術(shù)的應(yīng)用仍面臨一定挑戰(zhàn)，主要在于其只能識(shí)別特定的單鏈dna/rna靶標(biāo)，而不能直接識(shí)別雙鏈dna。這使得rpa與mnazyme的耦合變得復(fù)雜。目前，mnazyme技術(shù)主要應(yīng)用于mirna的識(shí)別。在病原體檢測(cè)中，常通過(guò)可以識(shí)別目標(biāo)病原體的特異性dna適配體，實(shí)現(xiàn)mnazyme對(duì)病原體的檢測(cè)。然而，從selex(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化)篩選適配體的過(guò)程復(fù)雜且耗時(shí)，限制了多組分核酸酶的廣泛應(yīng)用。此外，過(guò)去一些研究通過(guò)變性反應(yīng)(如熱變性或化學(xué)變性)獲得單鏈序列，避免了適配體的使用，但這類方法增加了操作復(fù)雜性、提高了儀器要求，并增加了氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)。

5、以下是目前mnazyme與rpa單獨(dú)或聯(lián)用檢測(cè)的舉例及不足：

6、1.abdou?mohamed和hu等人首先使用rpa擴(kuò)增目的片段，隨后通過(guò)開(kāi)蓋取核酸并使用堿處理將雙鏈核酸變性，并與阻斷鏈部分雜交，利用暴露的單鏈與mnazyme結(jié)合，進(jìn)行信號(hào)放大。缺點(diǎn)是開(kāi)蓋操作增加操作步驟，且容易導(dǎo)致氣溶膠污染。

7、2.fang采用適配體識(shí)別病菌后，釋放短鏈以激活rca反應(yīng)，產(chǎn)生的重復(fù)單鏈與mnazyme結(jié)合進(jìn)行信號(hào)放大。缺點(diǎn)是該方法依賴特異性適配體，適配體的篩選難度較大，限制了適用范圍。

8、3.僅使用rpa反應(yīng)也可以識(shí)別各類動(dòng)植物和微生物中的雙鏈dna，但rpa技術(shù)需要針對(duì)每個(gè)樣品設(shè)計(jì)特異性探針，且探針價(jià)格昂貴。相比之下，mnazyme只需通過(guò)調(diào)整底物臂的堿基序列即可實(shí)現(xiàn)通用探針的檢測(cè)，大大降低了成本。

9、4.目前已有許多方法將rpa與crispr/cas系統(tǒng)結(jié)合，但與crispr/cas系統(tǒng)相比，mnazyme無(wú)需購(gòu)買或合成cas蛋白和grna引導(dǎo)鏈，而僅需合成dna鏈即可實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，這顯著降低了成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種無(wú)需開(kāi)蓋的不對(duì)稱rpa-mnazyme(oar-mna)檢測(cè)方法。

2、為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種不對(duì)稱rpa與mnazyme聯(lián)用(oar-mna)的快速檢測(cè)方法：

3、用于dna檢測(cè)，即，用于微生物、動(dòng)植物等遺傳物質(zhì)為dna的生物的快速檢測(cè)；

4、反應(yīng)體系由rpa組分a、rpa組分b和mnazyme組分組成；

5、rpa組分a由6μl含有重組酶和聚合酶的干粉的rehydration?a?buffer、0.4μl的正向引物rpa-sp(10μm)、0.4μl反向引物rpa-ap(3.12×10-2μm)和1.7μl的雙蒸水組成；

6、rpa組分b由1μl的模板(待測(cè)樣品)和0.5μl含有mgoac的b-buffer緩沖液組成；

7、mnazyme組分為40μl體系，包含4μl的10x?mnazyme?buffer，250nm?partzyme?a，250nm?partzyme?b,500nm?mnafq-probe，余量為雙蒸水。

8、反應(yīng)體系是將rpa組分a加至反應(yīng)管管底，將mnazyme組分加至反應(yīng)管管蓋上，然后反應(yīng)管管底加入rpa組分b，關(guān)蓋，41℃孵育30分鐘后，將mnazyme組分加入到管底，繼續(xù)41℃孵育15分鐘；而后選擇以下任一方式：

9、方式一：在加入mnazyme組分后進(jìn)行的41℃、15分鐘的孵育過(guò)程中，通過(guò)定量pcr儀器記錄熒光值；

10、方式二：在加入mnazyme組分后進(jìn)行的41℃、15分鐘的孵育過(guò)程結(jié)束后，通過(guò)使用led藍(lán)光照明器或配備有內(nèi)置uv通道的bio-rad?chemidoc?mp成像系統(tǒng)檢測(cè)終點(diǎn)信號(hào)。

11、即，具體而言，分別進(jìn)行如下操作方式：

12、方式一：反應(yīng)體系是將rpa組分a加至反應(yīng)管管底，將mnazyme組分加至反應(yīng)管管蓋上，然后反應(yīng)管管底加入rpa組分b，關(guān)蓋，41℃孵育30分鐘后，通過(guò)手動(dòng)甩管將mnazyme組分加入到管底，同時(shí)通過(guò)定量pcr儀器記錄熒光值，每37s記錄一次，共檢測(cè)24次，由于機(jī)子每次讀取需要額外時(shí)間，所以讀完需要15分鐘左右；

13、方式二：反應(yīng)體系是將rpa組分a加至反應(yīng)管管底，將mnazyme組分加至反應(yīng)管管蓋上，然后反應(yīng)管管底加入rpa組分b，關(guān)蓋，41℃孵育30分鐘后，通過(guò)手動(dòng)甩管將mnazyme組分加入到管底，繼續(xù)41℃孵育15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)管置于冰上，通過(guò)使用led藍(lán)光照明器或配備有內(nèi)置uv通道的bio-rad?chemidoc?mp成像系統(tǒng)檢測(cè)終點(diǎn)信號(hào)。

14、10x?mnazyme?buffer包含50mm?hepes,200mm?mgcl2,20mm?kcl,120mm?nacl,1％v/v?dmso，余量為雙蒸水。

15、現(xiàn)有的mnazyme技術(shù)由于只能識(shí)別單鏈核酸，當(dāng)前主要用于mirna的檢測(cè)或依賴適配體選擇，但本發(fā)明通過(guò)利用不對(duì)稱rpa(arpa)技術(shù)，以dna或rna為模板生成大量單鏈dna，再通過(guò)單鏈dna激活多組分核酸酶的識(shí)別與信號(hào)放大，極大拓展了核酸酶的應(yīng)用范圍。該方法無(wú)需篩選靶標(biāo)的適配體，無(wú)需開(kāi)蓋，操作簡(jiǎn)便、成本較低，且能夠?qū)崿F(xiàn)雙模檢測(cè)。在細(xì)菌以及轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)中，本方法已得到驗(yàn)證，表明其在動(dòng)植物、微生物以及病毒檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用潛力。

16、本發(fā)明還提供了如下具體應(yīng)用：

17、具體應(yīng)用一：

18、本方法用于細(xì)菌檢測(cè)(細(xì)菌性病害-細(xì)菌性果斑病)的方法：

19、正向引物rpa-sp-2：tcaccggcggcacggtgcagtttcctgctt；

20、反向引物rpa-ap-1：cgctctgcggtagggcgaagaaaccaacac

21、ac-p?a(partzyme?a):aaattcatagagtcgaaacaacgagatgaatactt

22、ac-p?b(partzyme?b):atctgacggaggctagcttcagcgttgccggcgg

23、mna?fq-probe：

24、6-fam-ccaccacgagtattcatc/rg//ru/ccgtcagacgtggtgg-bhq1

25、模板改成雙蒸水，體積用量保持不變，仍為1μl，以此作為陰性對(duì)照。

26、所述方式一：反應(yīng)體系是將rpa組分a加至反應(yīng)管管底，將mnazyme組分加至反應(yīng)管管蓋上，然后反應(yīng)管管底加入rpa組分b，關(guān)蓋，41℃孵育30分鐘后，通過(guò)手動(dòng)甩管將mnazyme組分加入到管底，同時(shí)通過(guò)定量pcr儀器記錄熒光值，每37s記錄一次，共檢測(cè)24次(共15min)；

27、以隨機(jī)選取的60個(gè)陰性對(duì)照在終點(diǎn)熒光值均值的95％置信區(qū)間(mean+3sd)，命名為陽(yáng)性判斷線；

28、當(dāng)熒光反應(yīng)實(shí)時(shí)曲線上的熒光值均超過(guò)陽(yáng)性判斷線時(shí)，判定待測(cè)樣品為陽(yáng)性(即，待測(cè)樣品中含有西瓜嗜酸菌)；反之，判定待測(cè)樣品為陰性。

29、方式二：反應(yīng)體系是將rpa組分a加至反應(yīng)管管底，將mnazyme組分加至反應(yīng)管管蓋上，然后反應(yīng)管管底加入rpa組分b，關(guān)蓋，41℃孵育30分鐘后，通過(guò)手動(dòng)甩管將mnazyme組分加入到管底，繼續(xù)41℃孵育15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)管置于冰上，通過(guò)使用led藍(lán)光照明器或配備有內(nèi)置uv通道的bio-rad?chemidoc?mp成像系統(tǒng)檢測(cè)終點(diǎn)信號(hào)，若待測(cè)樣本的熒光能與陰性對(duì)照能進(jìn)行觀察區(qū)分，則判斷為陽(yáng)性。

30、mnazyme僅識(shí)別單鏈核酸。所以本發(fā)明根據(jù)不對(duì)稱rpa的原理，即改變正反向引物濃度比例，產(chǎn)生大量單鏈dna。利用單鏈dna?激活mnazyme的識(shí)別及信號(hào)放大的一種有前景的方法。該方法檢測(cè)無(wú)需開(kāi)蓋，操作簡(jiǎn)便、成本較低、可以實(shí)現(xiàn)雙模檢測(cè)(圖1)。

31、本發(fā)明的方法能夠在45分鐘內(nèi)檢測(cè)20個(gè)拷貝/μl西瓜嗜酸菌dna。此外，本發(fā)明通過(guò)測(cè)試22個(gè)西瓜種子樣品進(jìn)行了驗(yàn)證，并與qpcr方法獲得一致的結(jié)果。通過(guò)測(cè)試西瓜種子中的五種常見(jiàn)病原體，確認(rèn)了本發(fā)明檢測(cè)方法的特異性。

32、本發(fā)明的具體內(nèi)容如下：

33、1.1)、病原體培養(yǎng)物的制備和dna提取

34、本發(fā)明使用了西瓜嗜酸菌標(biāo)準(zhǔn)株acidovorax?citrulli(atcc?29625)和其他四種瓜類常見(jiàn)病原體，包括兩種常見(jiàn)細(xì)菌，pseudomonas?lachrymans和xanthomonascucurbita，以及兩種常見(jiàn)真菌，即fusarium?solani和fusarium?oxysporum。西瓜嗜酸菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂nutrient?broth上培養(yǎng)，而p.lachrymans和x.cucurbita則在lb瓊脂上培養(yǎng)。f.solani和f.oxysporum用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)。使用tianamp細(xì)菌dna試劑盒(中國(guó)北京天根)提取細(xì)菌的基因組dna，而使用simgen植物dna試劑箱(中國(guó)杭州simgen)提取真菌基因組。

35、1.2)、西瓜嗜酸菌物種特異性引物設(shè)計(jì)

36、以西瓜嗜酸菌基因組為模板，用seq?id?1和seq?id?5(如表1所述)擴(kuò)增出一段344bp的pcr產(chǎn)物，將該344bp的擴(kuò)增片段純化，克隆到pbm23載體(transgen，中國(guó)上海)中，并命名為plasmid-t，作為模板質(zhì)粒以供后續(xù)使用。使用primer?premier?5軟件設(shè)計(jì)rpa引物。rpa引物的設(shè)計(jì)原則是長(zhǎng)度在30-35nt之間，預(yù)期擴(kuò)增大小在500bp以下。使用ncbiprimer-blast評(píng)估引物的特異性(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)。同時(shí)，根據(jù)rpa引物位置設(shè)計(jì)partzyme?a和partzyme?b。使用local?blastn測(cè)試設(shè)計(jì)的partzyme?a和partzyme?b的個(gè)體特異性。本發(fā)明中使用的所有合成核酸由sangon(中國(guó)上海)合成，如表1所示。

37、表1.本發(fā)明中設(shè)計(jì)的引物序列、探針序列和靶標(biāo)序列信息

38、

39、1.3)、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)可行性分析

40、為了驗(yàn)證mnazyme的裂解能力，每孔裝入的總體積為10μl，各泳道加樣組分及濃度如表2所示。

41、表2、圖2中的各泳道加樣組分及濃度

42、

43、

44、說(shuō)明：500nmac-ssdna，自行合成了arpa的單鏈產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)試，實(shí)現(xiàn)可行性分析。

45、接著，進(jìn)一步研究了oar-mna的可行性。本發(fā)明對(duì)各種樣品進(jìn)行了凝膠電泳分析，各泳道加樣組分及濃度如表3所示。rpa反應(yīng)根據(jù)通用等溫?cái)U(kuò)增試劑盒規(guī)范(安普未來(lái)，中國(guó)山東)提供的說(shuō)明進(jìn)行。含有重組酶和聚合酶的rehydration?a?buffer和2.5μl含有mgoac的b-buffer購(gòu)自安普未來(lái)(中國(guó)山東)。每個(gè)反應(yīng)包含29.4μl含有重組酶和聚合酶的干粉的rehydration?a?buffer、2μl的正向引物(10μm)、2μl反向引物(10μm)、2μl的0.9μm的plasmid-t、2.5μl含有mgoac的b-buffer和12.1μl的depc水。對(duì)于不對(duì)稱rpa，除rpa正反向引物(正向引物ac-sp-2：反向引物ac-ap-1)濃度設(shè)定為10,000nm:31.25nm外，其他濃度均保持一致。反應(yīng)溫度40℃，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為30分鐘。在表3的泳道5-8中，將10μl?rpa?或arpa擴(kuò)增片段加入含有mnazyme組分的40μl反應(yīng)液中，在40℃溫育15分鐘。在1×tbe運(yùn)行緩沖液(89mm三硼酸，2mm乙二胺四乙酸，ph?8.3)中，在120v恒壓下，通過(guò)15％?page分析mnazyme和arpa-mnazyme系統(tǒng)的產(chǎn)物40分鐘。隨后，對(duì)凝膠進(jìn)行20分鐘的gelred染色，并使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

46、表3、圖3b中的各泳道加樣組分及濃度

47、 1 2 3 4 5 6 7 8 500nmac-p?a/b + + + + + 1250nm?mna?fq-probe + + + rpa產(chǎn)物 + + + arpa產(chǎn)物 + + + <![cdata[200nm?mgcl₂]]> + + + +

48、圖2中前四個(gè)泳道主要展示ac-pa、ac-pb、mnafq-probe、ac-ssdna四個(gè)單一組分的條帶深淺及條帶位置。泳道5、6、7均為缺少單一組分的反應(yīng)體系。分析結(jié)果顯示，在所有成分存在的情況下(泳道8)，相比較泳道6而言，ac-ssdna條帶減少，在ac-p?b下面出現(xiàn)了新的條帶，這表明mnazyme發(fā)生了構(gòu)象重排且探針發(fā)生裂解(圖2)。此外，泳道7和泳道8之間的比較還證實(shí)了鎂輔助因子在促進(jìn)mnazyme檢測(cè)中的重要性。

49、為闡明rpa產(chǎn)物與mnazyme之間的作用機(jī)制，用rpa擴(kuò)增子和arpa擴(kuò)增子取代ac-ssdna。圖3a表明理論上ssdna擴(kuò)增子而非dsdna擴(kuò)增子對(duì)于mnazyme催化核心的重新配置至關(guān)重要，使mnazyme持續(xù)切割mnafq-probe。接著，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)去證實(shí)rpa與mnazyme的內(nèi)在機(jī)制。圖3b前四個(gè)泳道主要展示ac-p?a/b、mna?fq-probe、rpa產(chǎn)物、arpa產(chǎn)物四個(gè)組分的條帶深淺及條帶位置。通過(guò)泳道5、6比較發(fā)現(xiàn)，rpa擴(kuò)增子的加入不能導(dǎo)致探針的裂解，因?yàn)閞pa擴(kuò)增子條帶的亮度保持不變。通過(guò)泳道7、8比較發(fā)現(xiàn)，arpa產(chǎn)物與mnazyme反應(yīng)引起arpa條帶減弱并產(chǎn)生新的條帶，表明arpa導(dǎo)致mnazyme構(gòu)象重排和探針切割，證實(shí)了arpa催化mnazyme活性的能力(圖3b)。同時(shí)，熒光動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果表明，只有arpa擴(kuò)增子出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)(圖3c)。因此，上述結(jié)果證明了arpa和mnazyme聯(lián)合檢測(cè)的可行性，展示了所開(kāi)發(fā)的生物傳感器作為應(yīng)用檢測(cè)利器的潛力。

50、1.4)oar-mna反應(yīng)體系優(yōu)化

51、反應(yīng)體系由rpa組分a、rpa組分b和mnazyme組分組成；

52、rpa組分a由6μl含有重組酶和聚合酶的干粉的rehydration?a?buffer、0.4μl的正向引物rpa-sp(10μm)、0.4μl反向引物rpa-ap(3.12×10-2μm)和1.7μl的雙蒸水組成；rpa組分b由1μl的模板(待測(cè)樣品)和0.5μl含有mgoac的b-buffer緩沖液組成；

53、mnazyme組分為40μl體系，包含10x?mnazyme?buffer，250nm?partzyme?a(ac-pa)，250nm?partzyme?b(ac-pb),500nm?mna?fq-probe；余量為雙蒸水。

54、反應(yīng)體系是將rpa組分a加至反應(yīng)管管底，將mnazyme組分加至反應(yīng)管管蓋上，然后反應(yīng)管管底加入rpa組分b，關(guān)蓋，41℃孵育30分鐘后，通過(guò)手動(dòng)甩管將mnazyme組分加入到管底，繼續(xù)41℃孵育15分鐘。mnazyme?buffer包含50mm?hepes,200mm?mgcl2,20mm?kcl,120mm?nacl,1％v/v?dmso(dmso)。在bio-rad?cfx96實(shí)時(shí)pcr檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行檢測(cè)，每隔37秒記錄熒光值，共記錄24次，做成熒光曲線。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)，以三次重復(fù)的終點(diǎn)熒光值做柱狀圖。同時(shí)，用備有內(nèi)置uv通道的bio-rad?chemidoc?mp成像系統(tǒng)對(duì)反應(yīng)管成像。

55、本發(fā)明對(duì)反應(yīng)溫度、mna?fq-probe濃度、ac-p?a/b濃度、鎂離子濃度以及rpa正反引物比例及arpa/mnazyme體積比例進(jìn)行優(yōu)化。并根據(jù)最終熒光強(qiáng)度以及f/f0比值確定最適條件。首先在37～42℃的不同溫度下進(jìn)行mnazyme反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，以確定合適的溫度。由于離子濃度對(duì)于核酶反應(yīng)非常重要，其次對(duì)鎂離子濃度進(jìn)行優(yōu)化，鎂離子的最佳濃度是通過(guò)測(cè)試六個(gè)濃度梯度來(lái)確定的0、50、100、200、400和800nm。接著，對(duì)arpa/mnazyme兩體系比例進(jìn)行優(yōu)化，arpa/mnazyme比例設(shè)置為1：4、1：2和1：1。再然后對(duì)rpa正反引物比例進(jìn)行優(yōu)化，rpa正反引物比例分別設(shè)置為10,000:250,10,000:125,10,000:62.5,10,000:31.25。。最后，對(duì)ac-p?a/b和mna?fq-probe的濃度進(jìn)行優(yōu)化，ac-p?a/b和mna?fq-probe的濃度優(yōu)化使用四個(gè)濃度梯度進(jìn)行評(píng)估：125、250、500和1000nm。

56、為了評(píng)估最佳反應(yīng)溫度范圍，首先將反應(yīng)管在不同溫度下孵育。當(dāng)反應(yīng)溫度設(shè)置為41℃時(shí)，本發(fā)明觀察到更高的熒光信號(hào)，f/f0比值也最高(圖4a)。因此，選擇41℃作為最適溫度。接下來(lái)，本發(fā)明對(duì)鎂離子的濃度進(jìn)行優(yōu)化，本發(fā)明通過(guò)測(cè)試從0到800nm的六種不同濃度來(lái)檢測(cè)鎂離子濃度對(duì)熒光信號(hào)的影響。在這些濃度中，200nm產(chǎn)生最高的可檢測(cè)熒光信號(hào)，f/f0比值也最高(圖4b)。因此，本發(fā)明選擇了200nm的鎂濃度用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。接著，本發(fā)明對(duì)arpa/mnazyme體系比例進(jìn)行優(yōu)化，arpa/mnazyme體系比例在1：4時(shí)，熒光信號(hào)最強(qiáng)且f/f0比值也最高，因此選擇arpa/mnazyme體系比例為1：4(圖4c)。然后，本發(fā)明對(duì)rpa正反引物比例進(jìn)行優(yōu)化，rpa正反引物比例為10,000:31.25時(shí)，熒光信號(hào)最強(qiáng)且f/f0比值也最高，因此選擇arpa雙向引物比例為1：320(圖4d)。最后，本發(fā)明對(duì)ac-p?a/b濃度和mna?fq-probe探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示ac-p?a/b濃度設(shè)定為250nm時(shí)，熒光信號(hào)最強(qiáng)(圖4e)。mna?fq-probe探針濃度與熒光信號(hào)積累呈正相關(guān)，然而隨著探針濃度增加，背景熒光信號(hào)也增加，導(dǎo)致f/f0比值下降，由于500nm濃度時(shí)f/f0比值最高，因此、最終選擇500nm的mnafq-probe探針進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)(圖4f)。

57、綜上，優(yōu)化后的oar-mna反應(yīng)體系為10μl的arpa(包括6μl含有重組酶和聚合酶干粉的rehydration?a?buffer、0.4μl的引物ac-sp-2(10μm)、0.4μl反向引物ac-ap-1(3.12×10-2μm)、1μl的模板(待測(cè)樣品)、0.5μl含有mgoac的b-buffer緩沖和1.7μl的depc水)，40μl的mnazyme(4μl的10x?mnazyme?buffer，250nmac-p?a，250nmac-p?b，500nm?mna?fq-probe以及作為余量的雙蒸水組成)。

58、本發(fā)明還同時(shí)提供了一種用于植物檢測(cè)(轉(zhuǎn)基因大豆dbn9004)的方法：

59、(正向引物rpa-sp)9004-f4：atggccgtatccgcaatgtgttattaagtt

60、(反向引物rpa-ap)9004-r3：agagcgttgcatttacgctccataaacgtg

61、9004-p?a(partzyme?a):tcattacggggtcaacaacgagatgaatactt

62、9004-p?b(partzyme?b):atctgacggaggctagctcagagttgtaaac

63、mna?fq-probe：

64、6-fam-ccaccacgagtattcatc/rg//ru/ccgtcagacgtggtgg-bhq1；

65、模板改成depc水，體積用量保持不變，仍為1μl，以此作為陰性對(duì)照。

66、方式一：首先進(jìn)行arpa反應(yīng)30分鐘，而后通過(guò)離心加入mnazyme組分，用定量pcr儀器每37s記錄一次熒光信號(hào)，共記錄12次(共15min)；

67、以隨機(jī)選取的60個(gè)陰性對(duì)照在終點(diǎn)熒光值均值的95％置信區(qū)間(mean+3sd)，命名為陽(yáng)性判斷線；

68、當(dāng)熒光反應(yīng)實(shí)時(shí)曲線上的熒光值均超過(guò)陽(yáng)性判斷線時(shí)，判定待測(cè)樣品為陽(yáng)性(即，待測(cè)樣品中含有dbn9004)；反之，判定待測(cè)樣品為陰性。

69、方式二：反應(yīng)體系是將rpa組分a加至反應(yīng)管管底，將mnazyme組分加至反應(yīng)管管蓋上，然后反應(yīng)管管底加入rpa組分b，關(guān)蓋，41℃孵育30分鐘后，通過(guò)手動(dòng)甩管將mnazyme組分加入到管底，繼續(xù)41℃孵育15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)管置于冰上，通過(guò)使用led藍(lán)光照明器或配備有內(nèi)置uv通道的bio-rad?chemidoc?mp成像系統(tǒng)檢測(cè)終點(diǎn)信號(hào)若待測(cè)樣本的熒光能與陰性對(duì)照能進(jìn)行觀察區(qū)分，則判斷為陽(yáng)性。

70、采用本方法進(jìn)行方法特異性分析，選取非轉(zhuǎn)基因大豆及6種其他轉(zhuǎn)基因大豆材料進(jìn)行特異性分析，僅轉(zhuǎn)基因大豆dbn9004被測(cè)出陽(yáng)性。說(shuō)明方法特異性好。

71、此外，本發(fā)明對(duì)13個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆樣品進(jìn)行了驗(yàn)證，并與qpcr方法獲得一致的結(jié)果。

72、本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)，主要為如下：

73、首先，本發(fā)明設(shè)定了不對(duì)稱rpa理念，不對(duì)稱rpa和mnazyme結(jié)合的方法。

74、其次，本發(fā)明對(duì)arpa/mnazyme溶液體積比例、arpa正反引物比例、partzyme?a/partzyme?b濃度、探針濃度、反應(yīng)溫度、鎂離子濃度進(jìn)行了優(yōu)化。

75、本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

76、1.本發(fā)明首次將不對(duì)稱rpa的概念與mnazyme方法聯(lián)用。本發(fā)明的方法展現(xiàn)了超高的靈敏度和特異性。

77、2.核酶的引入對(duì)反應(yīng)進(jìn)行二次放大，同時(shí)只需要設(shè)計(jì)一條通用型探針，大大減少探針設(shè)計(jì)難度，降低成本。

78、3.擴(kuò)增了mnazyme的使用范圍，形成的方法適用于dna、rna核酸檢測(cè)，一管式反應(yīng)減少污染。

79、本發(fā)明技術(shù)優(yōu)勢(shì)具體為如下：

80、1)、將mnazyme運(yùn)用到雙鏈核酸檢測(cè)中。

81、2)、開(kāi)始反應(yīng)后，不需要進(jìn)行開(kāi)蓋加樣，減少氣溶膠污染，減少操作步驟。

82、3)、靈敏度高，方法能夠檢測(cè)到20個(gè)拷貝/μl?dna。

83、4)、特異性高，靶標(biāo)序列通過(guò)rpa?擴(kuò)增和mnazyme雙重識(shí)別鑒定。