本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種甲狀腺癌相關(guān)基因突變的檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、甲狀腺癌(thyroid?cancer)是起源于甲狀腺濾泡上皮或?yàn)V泡旁上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是頭頸部最為常見(jiàn)的惡性腫瘤。甲狀腺癌的類型包括甲狀腺乳頭狀癌(ptc)、甲狀腺濾泡癌(ftc)、甲狀腺髓樣癌(mtc)以及甲狀腺未分化癌(atc)，其中最常見(jiàn)的是ptc，占所有甲狀腺癌的85％-90％。疾病發(fā)病率在全球逐年升高，高風(fēng)險(xiǎn)人群包括女性及那些有甲狀腺癌基因突變或家族史的人群。

2、癌癥的術(shù)前診斷和復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)有助于及時(shí)確定手術(shù)方案和降低治療成本。液體活檢或穿刺活檢因其具有微創(chuàng)性便于在整個(gè)疾病過(guò)程中輕松獲得樣本成為腫瘤采樣的主流方式?；顧z樣本中含有的腫瘤特異性的突變蘊(yùn)含著重要的疾病線索，是腫瘤診斷和伴隨治療的有效指標(biāo)。如braf?v600e突變可作為甲狀腺癌穿刺結(jié)節(jié)良惡性的指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)可輔助進(jìn)行甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性判斷。但因活檢樣本中基因組dna含量低、突變豐度低的特點(diǎn)對(duì)突變檢測(cè)工具提出了超靈敏和高特異的性能要求。

3、核酸探針因嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則對(duì)靶標(biāo)的識(shí)別具有較好的特異性。然而目前現(xiàn)有的核酸探針要么因過(guò)于穩(wěn)定，對(duì)單堿基的突變極其不敏感，或者為了增強(qiáng)核酸探針識(shí)別突變的敏感度，減弱其與突變靶標(biāo)之間的結(jié)合，提高突變檢測(cè)的特異性的同時(shí)犧牲檢測(cè)突變的靈敏度。因此，需要發(fā)展一種新的甲狀腺癌相關(guān)基因檢測(cè)方法，可以檢測(cè)低豐度基因突變并且能夠同時(shí)在寬濃度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)高的靈敏度和高特異性，從根本上傳統(tǒng)雜交探針在檢測(cè)甲狀腺癌相關(guān)基因時(shí)靈敏度和特異性相互制衡的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本技術(shù)提供了一種甲狀腺癌相關(guān)基因突變檢測(cè)方法，該方法使用三條甲狀腺癌相關(guān)基因突變檢測(cè)的核酸探針，可實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高特異性且經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，能夠在寬的濃度范圍內(nèi)很好地實(shí)現(xiàn)低豐度的臨床樣品中突變的檢測(cè)，具有更好的推廣意義。

2、本發(fā)明的第一方面，提供了一種甲狀腺癌相關(guān)基因突變檢測(cè)的探針組，所述的探針組包括三條探針，所述的探針的序列包括seq?id?no：3-4任一所示的核苷酸序列或與seqid?no：3-4任一所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。

3、優(yōu)選的，所述的第一探針和第二探針組合為雙鏈探針組，第三探針與第一或第二探針包含相同的核苷酸序列。

4、優(yōu)選的，所述的第一探針包括seq?id?no：3所示的核苷酸序列；所述的第二、三探針包括seq?id?no：4所示的核苷酸序列。

5、優(yōu)選的，所述的探針還包含修飾，所述的第一探針的末端各包含一個(gè)熒光基團(tuán)修飾，第二探針的末端各包含一個(gè)熒光猝滅基團(tuán)修飾，第三探針的5’端或3’端包含一個(gè)熒光猝滅基團(tuán)修飾。

6、優(yōu)選的，所述的熒光基團(tuán)包括但不限于alex-350、fam、vic、tet、cal?gold540、joe、hex、cal?orange560、tamra、cal?red590、rox、cal?red610、texas?red、cal?red635、quasar670、cy3、cy5、cy5.5和/或quasar705。

7、優(yōu)選的，所述的熒光猝滅基團(tuán)包括但不限于dabcyl、bhq類淬滅劑、eclipse和/或tamra。

8、優(yōu)選的，所述bhq類淬滅劑包括bhq-1和/或bhq-2。

9、優(yōu)選的，所述的第一探針末端兩個(gè)熒光基團(tuán)相同或不同，進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的第一探針兩個(gè)末端包括不同的熒光基團(tuán)。

10、優(yōu)選的，所述的第二探針末端兩個(gè)熒光猝滅基團(tuán)相同或不同，進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的第二探針兩個(gè)末端包括不同的熒光猝滅基團(tuán)。

11、優(yōu)選的，所述的第三探針的熒光猝滅基團(tuán)與第二探針的熒光猝滅基團(tuán)不同或與其中一個(gè)末端的熒光猝滅基團(tuán)相同，進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的第三探針的熒光猝滅基團(tuán)與第二探針其中一個(gè)末端的熒光猝滅基團(tuán)相同。

12、優(yōu)選的，所述突變包括單核苷酸突變。

13、優(yōu)選的，所述單核苷酸突變是同一物種的不同個(gè)體間的同一基因座位上的核酸序列中的一個(gè)或多個(gè)相同或不同位置的單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失，且所述基因組的一個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)段相同或不同。

14、優(yōu)選的，所述的探針的堿基序列可以包含特殊修飾。這些特殊修飾的堿基可以幫助調(diào)節(jié)探針的結(jié)合能力，例如增強(qiáng)探針結(jié)合能力或者削弱結(jié)合能力。比如能夠增強(qiáng)探針結(jié)合能力的特殊修飾堿基如鎖定核酸(即locked?nucleic?acids，縮寫(xiě)為lna)堿基或肽核酸(pna)等。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的探針可由未經(jīng)修飾的堿基組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)探針的堿基進(jìn)行修飾。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的探針包含能增強(qiáng)或減弱探針結(jié)合能力的堿基。

15、本發(fā)明的第二方面，提供了一種甲狀腺癌相關(guān)基因突變的檢測(cè)產(chǎn)品，所述的檢測(cè)產(chǎn)品包含上述的探針組。

16、優(yōu)選的，所述的檢測(cè)產(chǎn)品還可以包括其他方法如pcr法、lcr法、tas法、ican法、lamp法、nasba法、rca法、tama法和/或ucan法中所需用到的引物或試劑。

17、在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述的檢測(cè)方法還包括進(jìn)行pcr使用的相關(guān)試劑，所述的試劑包括pcr引物及組裝探針。

18、優(yōu)選的，所述的pcr引物包括seq?id?no：7-8。

19、優(yōu)選的，所述的組裝探針包括包括seq?id?no：7-11。

20、優(yōu)選的，所述的檢測(cè)產(chǎn)品包括但不限于試劑盒、試劑或芯片。

21、本發(fā)明的第三方面，提供一種基因突變的檢測(cè)方法，所述的檢測(cè)方法包括使用上述的檢測(cè)產(chǎn)品或上述探針組。

22、優(yōu)選的，所述的檢測(cè)方法包括：

23、(1)將第一探針和第二探針混合，加入待測(cè)靶序列，檢測(cè)熒光強(qiáng)度；

24、(2)加入第三探針，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

25、優(yōu)選的，所述的檢測(cè)方法包括將第一探針和第二探針及待測(cè)靶序列混合后獲得中間體，進(jìn)一步加入第三探針后獲得催化產(chǎn)物，所述的中間體為第一探針與待測(cè)靶序列的組合物，所述的催化產(chǎn)物為第一探針與第三探針的組合物，分別檢測(cè)中間體和催化產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。

26、優(yōu)選的，所述的檢測(cè)方法通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度判斷是否存在突變，突變靶序列與不存在野生型靶序列的情況相比，中間體和催化產(chǎn)物熒光或熒光強(qiáng)度增加，當(dāng)存在野生型靶核酸序列的情況時(shí)，無(wú)熒光或熒光強(qiáng)度弱，不產(chǎn)生熒光響應(yīng)。

27、優(yōu)選的，所述的檢測(cè)方法不用于疾病診斷或治療。

28、本發(fā)明的第四方面，提供上述的探針組或上述的檢測(cè)產(chǎn)品在制備甲狀腺癌檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

29、本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“包括”或“包含”是開(kāi)放式的描述，含有所描述的指定成分或步驟，以及不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響的其他指定成分或步驟。

30、本發(fā)明所述的“同源性”或“同一性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際工作需要對(duì)序列進(jìn)行調(diào)整，使使用序列與現(xiàn)有技術(shù)獲得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同源性/同一性。

31、本發(fā)明的有益效果：

32、本發(fā)明公開(kāi)了一種新型的基于甲狀腺癌相關(guān)基因突變特異性的中間體和催化產(chǎn)物的催化突變識(shí)別方法。該探針包含三條核酸探針，實(shí)現(xiàn)了低至0.1％的單堿基突變檢測(cè)。本專利發(fā)明的新型探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，無(wú)需修飾功能性核酸，使dna突變檢測(cè)對(duì)臨床和科研人員更加經(jīng)濟(jì)。此外，結(jié)合本專利發(fā)明的新型探針和pcr擴(kuò)增技術(shù)，最后成功將其應(yīng)用于檢測(cè)25對(duì)甲狀腺癌術(shù)后組織樣品和67例石蠟切片樣本(術(shù)后和穿刺)中的braf?v600e突變。

33、本方法克服了傳統(tǒng)探針單重識(shí)別突變機(jī)制，解決了傳統(tǒng)核酸雜交探針靈敏度和特異性相互制衡的問(wèn)題。與現(xiàn)有的應(yīng)用于臨床的甲狀腺癌相關(guān)基因突變檢測(cè)技術(shù)相比，本技術(shù)在寬的靶標(biāo)濃度范圍內(nèi)可實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高特異性且經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，能夠在寬的濃度范圍內(nèi)很好地實(shí)現(xiàn)低豐度的臨床樣品(如穿刺樣本)中突變的檢測(cè)，具有更好的推廣意義。