本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)，尤其涉及一種適用于咽拭子核酸直擴(kuò)的qpcr檢測(cè)體系及其用途。

背景技術(shù)：

1、核酸擴(kuò)增檢測(cè)作為一種高靈敏度的病毒或病原體檢測(cè)方法，在感染性疾病的診斷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。定量pcr(qpcr)技術(shù)是核酸擴(kuò)增檢測(cè)中最常用的手段之一。在眾多核酸檢測(cè)樣本中，咽拭子樣本由于取樣便捷、患者接受度高、且相對(duì)痰液等樣本相對(duì)安全不易造成醫(yī)務(wù)人員的二次感染，成為最常見(jiàn)的選擇。大多數(shù)呼吸道病原體，包括流感病毒、冠狀病毒等，首先在上呼吸道部位進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)散。因此咽拭子樣本可以有效捕捉到這些病原體的核酸，提升了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。在傳統(tǒng)的qpcr檢測(cè)流程中，通常需要復(fù)雜的樣本處理步驟，包括核酸提取和純化等操作，這不僅耗時(shí)，而且增加了實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備需求和檢測(cè)成本。

2、為了解決傳統(tǒng)qpcr檢測(cè)流程中的復(fù)雜性，核酸直擴(kuò)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。咽拭子核酸直擴(kuò)技術(shù)省略了傳統(tǒng)檢測(cè)中核酸提取的步驟，直接將樣本加入qpcr反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。這種方法大幅提高了檢測(cè)效率，縮短了整體流程，降低了實(shí)驗(yàn)室設(shè)備需求和檢測(cè)成本，特別適用于快速檢測(cè)需求和大規(guī)模篩查的場(chǎng)合。然而，咽拭子樣本中往往存在影響后續(xù)qpcr檢測(cè)的抑制物。常見(jiàn)的抑制物包括：1)黏液蛋白：咽喉部位存在大量的黏液，黏液中的蛋白質(zhì)可能與qpcr反應(yīng)中的酶發(fā)生非特異性結(jié)合，抑制酶的活性，降低擴(kuò)增效率。2)宿主細(xì)胞dna和rna：咽拭子樣本不僅包含病原體核酸，還含有大量來(lái)自人體細(xì)胞的dna和rna。這些非目標(biāo)核酸與引物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，干擾擴(kuò)增的特異性和準(zhǔn)確性。3)酚類化合物：部分取樣拭子可能在樣本采集過(guò)程中帶入酚類或其他化學(xué)抑制物質(zhì)，這些物質(zhì)可能會(huì)抑制qpcr反應(yīng)中的關(guān)鍵酶活性，導(dǎo)致擴(kuò)增反應(yīng)失敗或不完全。這些抑制物的存在使得核酸直擴(kuò)技術(shù)雖然在操作上更加簡(jiǎn)單快捷，但檢測(cè)結(jié)果的可靠性可能受到干擾，導(dǎo)致靈敏度下降，甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果?，F(xiàn)有qpcr定量檢測(cè)試劑盒常受到咽拭子樣本中抑制物干擾，無(wú)法提供咽拭子樣本直擴(kuò)的準(zhǔn)確定量結(jié)果。因此，開(kāi)發(fā)具有良好抗抑制能力的qpcr定量檢測(cè)體系，對(duì)提高樣本檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決背景技術(shù)中提到的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種適用于咽拭子核酸直擴(kuò)的qpcr檢測(cè)體系。

2、所述檢測(cè)體系包括弱堿性緩沖液、dna聚合酶、dntps、金屬鹽以及反應(yīng)增強(qiáng)劑。

3、進(jìn)一步的，所述弱堿性緩沖液選自tes、tricine、tris、taps、hepes、heppso、hepps中的一種或多種，所述弱堿性緩沖液在檢測(cè)體系中的濃度為10-100mm。

4、進(jìn)一步的，所述dna聚合酶選用taq?dna聚合酶或tth?dna聚合酶，所述dna聚合酶在檢測(cè)體系中的濃度為0.1-5u/μl。

5、進(jìn)一步的，所述dntps在檢測(cè)體系中的濃度為0.1-0.5mm。

6、進(jìn)一步的，所述金屬鹽選自以下的一種或多種：mgcl2，在檢測(cè)體系中的濃度為1-5mm；mgso4，在檢測(cè)體系中的濃度為1-5mm；kcl，在檢測(cè)體系中的濃度為20-120mm；koac，在檢測(cè)體系中的濃度為20-120mm；(nh4)2so4，在檢測(cè)體系中的濃度為2-50mm；tmac，在檢測(cè)體系中濃度為5-100mm。

7、進(jìn)一步的，所述反應(yīng)增強(qiáng)劑選自以下的一種或多種：bsa，在檢測(cè)體系中的濃度為5-300μg/ml；ssb，在檢測(cè)體系中的濃度為5-200μg/ml；明膠，在檢測(cè)體系中的濃度為0.01-0.05％；dtt，在檢測(cè)體系中的濃度為1-10mm；dmso，在檢測(cè)體系中的濃度為1-5％；海藻糖，在檢測(cè)體系中的濃度為1-10％；甘露醇，在檢測(cè)體系中的濃度為1-10％；甜菜堿，在檢測(cè)體系中的濃度為0.1-1m；左旋肉堿，在檢測(cè)體系中的濃度為1-10％；triton?x-100，在檢測(cè)體系中的濃度為0.01-0.1％；tween?80，在檢測(cè)體系中的濃度為0.01-0.1％；np-40，在檢測(cè)體系中的濃度為0.01-0.1％。

8、進(jìn)一步的，所述檢測(cè)體系還包括dutp和udg，dutp在檢測(cè)體系中的濃度為0.2-1mm；udg在檢測(cè)體系中的濃度為0.01-0.1u/μl。

9、所述檢測(cè)體系在核酸檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

10、本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的檢測(cè)體系，無(wú)需進(jìn)行復(fù)雜的核酸提取步驟，直接將咽拭子樣本用于qpcr擴(kuò)增，極大簡(jiǎn)化了操作流程，減少了檢測(cè)時(shí)間和成本，適用于快速檢測(cè)和大規(guī)模篩查。該體系具備優(yōu)良的抗抑制能力，能夠有效抵抗咽拭子樣本中常見(jiàn)的抑制物，如黏液蛋白和宿主dna等對(duì)qpcr擴(kuò)增的抑制，從而保證擴(kuò)增效率和檢測(cè)靈敏度。此發(fā)明避免了抑制物對(duì)qpcr反應(yīng)的影響，降低了假陰性結(jié)果的發(fā)生率，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，由于檢測(cè)體系的優(yōu)化設(shè)計(jì)，該方法可以在短時(shí)間內(nèi)完成核酸檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)效率。該發(fā)明為咽拭子核酸檢測(cè)提供了更快捷、準(zhǔn)確且高效的解決方案。

技術(shù)特征：

1.一種適用于咽拭子核酸直擴(kuò)的qpcr檢測(cè)體系，其特征在于，包括弱堿性緩沖液、dna聚合酶、dntps、金屬鹽以及反應(yīng)增強(qiáng)劑。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于咽拭子核酸直擴(kuò)的qpcr檢測(cè)體系，其特征在于，所述弱堿性緩沖液選自tes、tricine、tris、taps、hepes、heppso、hepps中的一種或多種，所述弱堿性緩沖液在檢測(cè)體系中的濃度為10-100mm。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于咽拭子核酸直擴(kuò)的qpcr檢測(cè)體系，其特征在于，所述dna聚合酶選用taq?dna聚合酶或tth?dna聚合酶，所述dna聚合酶在檢測(cè)體系中的濃度為0.1-5u/μl。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于咽拭子核酸直擴(kuò)的qpcr檢測(cè)體系，其特征在于，所述dntps在檢測(cè)體系中的濃度為0.1-0.5mm。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于咽拭子核酸直擴(kuò)的qpcr檢測(cè)體系，其特征在于，所述金屬鹽選自以下的一種或多種：mgcl2，在檢測(cè)體系中的濃度為1-5mm；mgso4，在檢測(cè)體系中的濃度為1-5mm；kcl，在檢測(cè)體系中的濃度為20-120mm；koac，在檢測(cè)體系中的濃度為20-120mm；(nh4)2so4，在檢測(cè)體系中的濃度為2-50mm；tmac，在檢測(cè)體系中濃度為5-100mm。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于咽拭子核酸直擴(kuò)的qpcr檢測(cè)體系，其特征在于，所述反應(yīng)增強(qiáng)劑選自以下的一種或多種：bsa，在檢測(cè)體系中的濃度為5-300μg/ml；ssb，在檢測(cè)體系中的濃度為5-200μg/ml；明膠，在檢測(cè)體系中的濃度為0.01-0.05％；dtt，在檢測(cè)體系中的濃度為1-10mm；dmso，在檢測(cè)體系中的濃度為1-5％；海藻糖，在檢測(cè)體系中的濃度為1-10％；甘露醇，在檢測(cè)體系中的濃度為1-10％；甜菜堿，在檢測(cè)體系中的濃度為0.1-1m；左旋肉堿，在檢測(cè)體系中的濃度為1-10％；triton?x-100，在檢測(cè)體系中的濃度為0.01-0.1％；tween?80，在檢測(cè)體系中的濃度為0.01-0.1％；np-40，在檢測(cè)體系中的濃度為0.01-0.1％。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于咽拭子核酸直擴(kuò)的qpcr檢測(cè)體系，其特征在于，所述檢測(cè)體系還包括dutp和udg，dutp在檢測(cè)體系中的濃度為0.2-1mm；udg在檢測(cè)體系中的濃度為0.01-0.1u/μl。

8.權(quán)利要求1-7任一所述的檢測(cè)體系在核酸檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種適用于咽拭子核酸直擴(kuò)的qPCR檢測(cè)體系及其用途，所述檢測(cè)體系包括弱堿性緩沖液、DNA聚合酶、dNTPs、金屬鹽以及反應(yīng)增強(qiáng)劑，本發(fā)明提供的檢測(cè)體系，無(wú)需進(jìn)行復(fù)雜的核酸提取步驟，直接將咽拭子樣本用于qPCR擴(kuò)增，極大簡(jiǎn)化了操作流程，減少了檢測(cè)時(shí)間和成本，適用于快速檢測(cè)和大規(guī)模篩查，該體系具備優(yōu)良的抗抑制能力，能夠有效抵抗咽拭子樣本中常見(jiàn)的抑制物，從而保證擴(kuò)增效率和檢測(cè)靈敏度，該體系避免了抑制物對(duì)qPCR反應(yīng)的影響，降低了假陰性結(jié)果的發(fā)生率，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明提供的檢測(cè)體系為咽拭子核酸檢測(cè)提供了更快捷、準(zhǔn)確且高效的解決方案。

技術(shù)研發(fā)人員：鄒爭(zhēng)爭(zhēng),吳思佳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：新鎂（上海）生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2