本發(fā)明屬于分子生物檢測(cè)，尤其涉及一種用于檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種rna病毒的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)組合物、方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

1、昆蟲(chóng)病毒作為一類以昆蟲(chóng)為宿主并能使昆蟲(chóng)致病的病毒，其以昆蟲(chóng)作為媒介，同時(shí)也能夠感染人類及其他哺乳動(dòng)物，引發(fā)疫病，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡。昆蟲(chóng)細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中，包括high?five細(xì)胞、sf9細(xì)胞、d.mel-2細(xì)胞在內(nèi)的昆蟲(chóng)細(xì)胞常被用于病毒疫苗、重組蛋白以及病毒載體的生產(chǎn)中，因此昆蟲(chóng)細(xì)胞中的外源病毒感染被認(rèn)為是一項(xiàng)主要的安全性問(wèn)題。

2、常見(jiàn)的能夠感染昆蟲(chóng)細(xì)胞的rna病毒包括彈狀病毒科、諾達(dá)病毒科、黃病毒科、布尼亞病毒科等，而比較具有代表性的病毒包括被報(bào)道能感染sf細(xì)胞系的sf彈狀病毒、能夠感染high?five細(xì)胞的獸棚病毒變異株、包括牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、乙腦病毒在內(nèi)的哺乳動(dòng)物病毒、以及腦心肌炎病毒、松毛蟲(chóng)ω病毒、白蛉熱病毒等。

3、目前傳統(tǒng)的昆蟲(chóng)病毒檢測(cè)方法一般包括生物學(xué)測(cè)定法、電子顯微鏡觀察、基于酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)的血清學(xué)方法、基于核酸分析的pcr檢測(cè)方法等，普遍存在檢測(cè)靈敏度低、特異性差等情況，同時(shí)傳統(tǒng)的qpcr方法多采用單獨(dú)的檢測(cè)試劑盒，操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或無(wú)法覆蓋較全的病毒種類，不同病毒檢測(cè)反應(yīng)體系及程序相差較大，無(wú)法滿足多種病毒同時(shí)檢測(cè)的需求。同時(shí)常見(jiàn)的rna病毒檢測(cè)方法在rna抽提、反轉(zhuǎn)等過(guò)程中沒(méi)有較好的質(zhì)控品，傳統(tǒng)的qpcr選擇的標(biāo)準(zhǔn)品多為質(zhì)粒，并能不夠比較真實(shí)的反應(yīng)rna病毒的狀態(tài)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種rna病毒的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)組合物、方法及試劑盒，可以準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)樣品中的昆蟲(chóng)病毒。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本技術(shù)采用了如下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種rna病毒的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)組合物，所述檢測(cè)組合物包括檢測(cè)如下rna病毒的引物和探針：

4、檢測(cè)sf彈狀病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：1所示，下游引物如seq?idno：2所示，探針如seq?id?no：3所示；

5、檢測(cè)獸棚病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：4所示，下游引物如seq?idno：5所示，探針如seq?id?no：6所示；

6、檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：7所示，下游引物如seq?id?no：8所示，探針如seq?id?no：9所示；

7、檢測(cè)豬瘟病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：10所示，下游引物如seq?idno：11所示，探針如seq?id?no：12所示；

8、檢測(cè)乙腦病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：13所示，下游引物如seq?idno：14所示，探針如seq?id?no：15所示；

9、檢測(cè)果蠅x病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：16所示，下游引物如seq?idno：17所示，探針如seq?id?no：18所示；

10、檢測(cè)腦心肌炎病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：19所示，下游引物如seqid?no：20所示，探針如seq?id?no：21所示；

11、檢測(cè)松毛蟲(chóng)ω病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：22所示，下游引物如seqid?no：23所示，探針如seq?id?no：24所示；

12、檢測(cè)白蛉熱病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：25所示，下游引物如seqid?no：26所示，探針如seq?id?no：27所示。

13、第二方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種rna病毒的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒包含上述檢測(cè)組合物。

14、探針的熒光基團(tuán)為fam、vic或cy5，淬滅基團(tuán)選擇bhq1或bhq2。

15、在以上技術(shù)方案中，所述檢測(cè)試劑盒包含陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品以及熒光定量pcr反應(yīng)試劑。

16、在以上技術(shù)方案中，所述熒光定量pcr反應(yīng)試劑為熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液，包括2×one?step?rt-pcr?bufferⅲ、ex?taq?hs、rt?enzyme?mixⅱ、rox?reference?dye內(nèi)參染料、無(wú)核酶水、以及上述檢測(cè)組合物。

17、在以上技術(shù)方案中，所述陽(yáng)性對(duì)照品包含陽(yáng)性rna標(biāo)準(zhǔn)品，濃度均為2×108copies/μl。

18、在以上技術(shù)方案中，所述檢測(cè)試劑盒中的熒光定量pcr反應(yīng)體系為20μl，包含15μl的所述熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液和5μl的模板；所述模板為待測(cè)樣品的rna、陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。

19、在以上技術(shù)方案中，所述反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為：42℃反轉(zhuǎn)5min；95℃預(yù)變性3min；95℃變性5s，60℃退火34s，40個(gè)循環(huán)。

20、第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種rna病毒的多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法非診斷或治療目的，包括如下步驟：

21、(1)提取待測(cè)樣品的rna模板；

22、(2)采用上述檢測(cè)組合物建立熒光定量pcr反應(yīng)體系；

23、(3)進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)；

24、(4)待測(cè)樣品的結(jié)果分析。

25、在以上技術(shù)方案中，所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為20μl，包含15μl的熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液和5μl的模板；所述模板為待測(cè)樣品的rna、陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品；所述熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液包括2×one?step?rt-pcr?bufferⅲ、ex?taq?hs、rt?enzymemixⅱ、rox?reference?dye內(nèi)參染料、無(wú)核酶水、以及上述檢測(cè)組合物。

26、在以上技術(shù)方案中，所述熒光定量pcr反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為：42℃反轉(zhuǎn)5min；95℃預(yù)變性3min；95℃變性5s，60℃退火34s，40個(gè)循環(huán)。

27、本發(fā)明的有益效果在于：

28、1、本發(fā)明旨在檢測(cè)能夠感染昆蟲(chóng)細(xì)胞的多種rna病毒，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析比對(duì)分析，尋找病毒基因組保守序列，設(shè)計(jì)具有較強(qiáng)特異性的引物探針，可檢出該病毒的絕大部分亞型。

29、2、本發(fā)明所述檢測(cè)組合物，其中探針熒光報(bào)告基團(tuán)可選擇fam、vic或cy5，熒光淬滅基團(tuán)選擇bhq1或bhq2，即可滿足檢測(cè)上述任意一種的rna病毒，同時(shí)可檢測(cè)任意組合的rna病毒。

30、3、通過(guò)對(duì)病毒保守區(qū)域設(shè)計(jì)多對(duì)探針引物，最終篩選特異性好、靈敏度高的引物探針，可準(zhǔn)確定量2×107copies/μl至20copies/μl的病毒含量，大部分病毒檢測(cè)靈敏度能達(dá)到10copies/μl，部分病毒最低靈敏度可達(dá)2copies/μl。

31、4、本發(fā)明所述檢測(cè)昆蟲(chóng)細(xì)胞中多種rna病毒的檢測(cè)試劑盒，含有用于檢測(cè)的陽(yáng)性rna標(biāo)準(zhǔn)品，能夠更真實(shí)的反應(yīng)rna病毒檢測(cè)過(guò)程，同時(shí)對(duì)rna的qpcr檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)試，能夠滿足在一個(gè)程序里同時(shí)檢測(cè)多種rna病毒。

32、5、本發(fā)明通過(guò)反復(fù)篩選優(yōu)化反應(yīng)體系，包括引物和探針的濃度，最終該檢測(cè)方法可在較少核酸樣本下，能夠穩(wěn)定檢出多種rna病毒，操作簡(jiǎn)單，且具有較高的靈敏度。