本發(fā)明涉及大豆多肽制備，具體是涉及一種大豆多肽及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、我國是大豆的生產(chǎn)大國，同時也是豆制品的消費大國。大豆中含有豐富的蛋白質(zhì)，由于其氨基酸配比合理，常作為動物蛋白的替代品。大豆多肽是由大豆蛋白水解產(chǎn)生的一類化合物，平均肽鏈長為2～10個氨基酸殘基，分子量分布通常在3000da以下。大豆多肽不僅易于消化吸收，還具有抗氧化、抗衰老、降血壓、降血脂和抗疲勞等生理功能，是一類應(yīng)用廣泛的功能性原料。

2、大豆多肽的制備主要是以大豆分離蛋白或豆粕等為原料，應(yīng)用蛋白酶在一定的溫度和ph條件下酶促降解而獲得。但由于商業(yè)種類不多，作用位點單一，因此催化降解產(chǎn)生的多肽序列往往同質(zhì)化，某些功能如抗癌活性報道較少。目前，大豆多肽更多地采用發(fā)酵法制備，即篩選產(chǎn)蛋白酶能力強的菌株直接發(fā)酵豆粕，一方面可以降低生產(chǎn)成本，另一方面也可以改善多肽的風(fēng)味，但以這種方法制備的多肽往往純度不高，功效不突出。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，提供一種大豆多肽及其制備方法與應(yīng)用，本技術(shù)方案解決了上述背景技術(shù)中提出的制備的多肽往往純度不高，功效不突出的問題。

2、為達到以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

3、一種大豆多肽及其制備方法，包括：

4、s1、原材料預(yù)處理：采用粉碎機將低溫脫溶豆粕進行粉碎處理，將產(chǎn)物過60～80目篩，得到豆粕粉；

5、s2、酸沉與水洗：向豆粕粉當(dāng)中加入水，溫度升高到30～60℃，在攪拌條件下采用濃鹽酸將ph調(diào)節(jié)到3.0～6.0，所述豆粕粉和水的固液比為1：8～1：12；

6、將大豆蛋白沉淀，繼續(xù)攪拌1～2h，采用離心機進行處理，傾去上清；

7、按照上述固液比繼續(xù)向沉淀當(dāng)中加水，此時不需要升溫，同時不需要調(diào)整ph值；

8、繼續(xù)攪拌15～20min，對沉淀進行水洗，離心機繼續(xù)進行離心，所述離心機的轉(zhuǎn)速為每分鐘6000～9000r，將上清液去除以后收集沉淀；

9、按照同樣的操作水洗沉淀，然后棄掉上清液，收集沉淀；

10、s3、酶水解：收集酸沉與水洗步驟當(dāng)中的沉淀，所述沉淀和水的固液比為1：8～1：12，將其和水進行混合、攪拌；

11、采用naoh溶液將ph調(diào)節(jié)到8.0～10.0，將溫度升高到35℃～60℃；

12、按照每千克豆粕中加入40～100ml酶液的比例，向其中加入酶液，所述酶液為卡氏枯草桿菌絲氨酸堿性蛋白酶液；

13、在水解反應(yīng)的進程中，向其中滴0.05mol/l的naoh，保持體系內(nèi)部的ph值穩(wěn)定，在蛋白質(zhì)水解度為20～30％的時候，反應(yīng)停止；

14、s4、酶滅活：在酶水解結(jié)束以后，將溫度快速升高到90～100℃，維持10～20min，將酶滅活；

15、在10～20min內(nèi)將其快速降到室溫，將ph調(diào)節(jié)到中性，用離心機進行離心處理以后，所述離心機的轉(zhuǎn)速為每分鐘12000～15000r，固液分離，其中上清液即為大豆多肽原液；

16、s5、濃縮：從酶滅活步驟中獲得過膜液，對過膜液進行減壓濃縮處理，得到固型物，所述固型物的含量為35～40％；

17、s6、干燥：在濃縮結(jié)束以后，經(jīng)噴霧干燥或者冷凍干燥以后，將其制作成干粉。

18、具體的制備過程如下：選取20g蛋白含量45％的大豆豆粕粉，將其與200ml的水混合、攪拌，將溫度升高到45℃，采用濃鹽酸將溶液的ph值調(diào)節(jié)到4.2。2h以后攪拌停止，以9000rpm離心處理30min，將上清去除，向沉淀中加入200ml的水，繼續(xù)攪拌20min，繼續(xù)以9000rpm離心處理30min，去除上清，繼續(xù)重復(fù)該步驟。將沉淀收集，加入200ml的水，繼續(xù)攪拌，加入0.5mol/l的naoh，將ph值調(diào)節(jié)到9.5，溫度升高到35℃，加入1.1ml酶液，進行水解反應(yīng)。在水解反應(yīng)的過程中，繼續(xù)保持50℃的溫度，ph維持在9.5。在水解度達到了25％以后，停止反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束以后，快速將溫度升高到95℃，保持10～15min，使酶滅活。將溫度降到室溫，將ph調(diào)整到6.8，以12000rpm進行30min離心處理，上清液是粗制的大豆肽液。將大豆肽液過分子量是5000da超濾膜，將大分子片段去除。膜上液回到酶解罐中然后進行水解。精制大豆肽液減壓并且濃縮到固形物含量35～40％，噴霧干燥獲得精制的大豆肽干粉。

19、一種大豆多肽的應(yīng)用，由上述制備方法制得，應(yīng)用在制備保健食品或抗癌藥物中。

20、實驗以對胃癌細胞sgc7901的生長抑制作用作為反映抗癌活性的指標(biāo)，通過初次篩選，發(fā)現(xiàn)大豆多肽對癌細胞的生長抑制率隨加樣濃度升高而升高，最高抑制率分別為44.84％、69.34％、50.32％(見圖1)。根據(jù)ic50的定義，采用spss的probit計算得分子量小于5000u、5000～10000u、大于10000u三種組分的ic50值分別為1.17、0.47、0.96mg/ml。比較各組分半數(shù)致死濃度(ic50)值可知，分子量在5000～10000u的組分對癌細胞的抑制作用最佳，此時的ic50≈0.47mg/ml。因此，初步確定大豆抗癌肽的分子量范圍在5000～10000u。

21、對經(jīng)過膜液得到的相對分子質(zhì)量在5000～10000u的多肽液進行sephadexg-75柱層析分離，分別收集洗脫峰并編號a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8、a9、a10(見圖2)。將收集的各組分配成濃度為0.1mg/ml溶液，進行抗癌活性檢測，結(jié)果見圖3。

22、由圖3可知，組分a1～a10中，a4的抗癌活性最高，生長抑制率ir＝33.15％＞30％，具有敏感的抗癌性。其次是組分a5，它的生長抑制率ir＝27.73％<30％，因此對癌細胞的生長抑制不敏感?？拱┗钚宰畹偷氖墙M分a2，抑癌率只有1.17％。各組分的抗癌活性依次為a4＞a5＞a3＞a9＞a1＞a7＞a8＞a6＞a10＞a2。將a4組分配成不同濃度(0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml)的溶液，根據(jù)細胞抑制率(17.58％、20.96％、30.59％、35.67％、40.2％、46.7％、45.5％、44.4％、56.3％)計算其ic50為0.37mg/ml。明顯優(yōu)于過膜后的抗癌肽組分(ic50≈0.47mg/ml)，說明純化效果較好。

23、由于肽結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其抗癌機理也比較復(fù)雜。肽的抗癌活性一方面與其特定的氨基酸組成有關(guān)；另一方面還與其氨基酸序列有密切聯(lián)系。如lunasin，其抗癌作用是因為在它的c-末端有8個天冬氨酸殘基，當(dāng)它們結(jié)合到核染色質(zhì)區(qū)域后(比如出現(xiàn)在著絲點)，它們對抗有絲分裂效應(yīng)起到很大的作用。結(jié)果，著絲點處復(fù)合物不能正常形成，微管不能連到著絲點上，導(dǎo)致有絲分裂停止，細胞最終死亡，從而起到抑制癌細胞增殖的作用。

24、按上述柱層析分離方法測定各已知分子量標(biāo)準物的保留時間，記錄蛋白標(biāo)準品的最大吸收峰出現(xiàn)時的保留時間(min)，測定結(jié)果見圖4，以保留時間為橫坐標(biāo)，以lgm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線如圖5。

25、由圖5可見，分子量對數(shù)與保留時間呈線性關(guān)系，回歸方程為y＝-0.0817x+6.4632，r2＝0.988。式中，x代表保留時間，y代表分子量對數(shù)，0.988為標(biāo)準曲線的線性相關(guān)系數(shù)。由此可知，各分子量的對數(shù)值與各標(biāo)樣的保留時間具有良好的線性關(guān)系，可以準確地根據(jù)此回歸方程計算出提取物中抗癌肽分子量分布。

26、大豆多肽也有易消化吸收以及吸收速度快的基本特征，使其可以作為營養(yǎng)劑。可以將大豆多肽用在康復(fù)期患者以及消化功能減退的老年人、消化功能未完全成熟的嬰幼兒服用。在使用大豆多肽的時候可以結(jié)合輔料，制作成各種各樣的食品，比如制作成老年奶粉。將大豆多肽作為基料，按照老年人的營養(yǎng)要求以及生理特征，添加全脂奶粉以及蜂蜜，加強必需氨基酸，即半胱氨酸以及蛋氨酸，加強ca、fe以及zn等無機鹽融入到天然果汁當(dāng)中，研制出高果糖和高蛋白、易消化的老年奶粉，能夠顯著降低老年，人的血清膽固醇，是非常優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)保健類食品。大豆多肽具備了反抗原性以及降低膽固醇的作用，因此能夠?qū)⑵溆糜谏a(chǎn)具備降血壓、降膽固醇以及預(yù)防心血管疾病等功能性保健食品

27、大豆多肽還具備了較好的保濕性與吸濕性，能夠軟化產(chǎn)品，改善口感。因此，能夠?qū)⑵溆糜谏a(chǎn)各種豆制品，風(fēng)味與品質(zhì)俱佳，同時富有豐富的營養(yǎng)，容易消化吸收。用于肉、魚等高蛋白制品，能夠凸顯出制品的肉類風(fēng)味，提升食品香鮮度，有助于口感與品質(zhì)的優(yōu)化。將其用戶烘焙食品，能夠增加食品的香氣與風(fēng)味，保證食品質(zhì)地疏松，比如加入面包面團當(dāng)中，可以增加粘彈性，降低面包失水，保證面包具備更加柔軟的質(zhì)地，增大體積，增加香氣。用于生產(chǎn)糕點、糖果、巧克力，降低產(chǎn)品的甜度，降低成本，顯著提升蛋白質(zhì)中氨基酸的含量，有助于改善口味品質(zhì)，延長保質(zhì)期。由于大豆多肽具備較高的水溶性，容易導(dǎo)致粘性較低，在酸性條件性不容易產(chǎn)生沉淀，并且還具備了一定的發(fā)泡作用，因此可以用于生產(chǎn)酸性飲料、汽水、營養(yǎng)飲品、速溶奶粉等食品高果糖和高蛋白、易消化的老年奶粉，能夠顯著降低老年。

28、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種大豆多肽及其制備方法與應(yīng)用，具備以下有益效果：

29、本發(fā)明制備大豆多肽分子量在5000-10000u時具有最高的抑癌活性，大豆抗癌肽的ic50為0.47mg/ml。經(jīng)柱層析分離后，體外細胞實驗結(jié)果顯示：組分a4具有最佳抗癌活性，ic50為0.37mg/ml；在0.1mg/ml濃度下，其ir值為33.15％＞30％，具有敏感的抗癌性；通過標(biāo)準曲線計算大豆抗癌肽的平均相對分子質(zhì)量為6723u，因此該制備方法較為簡單，大豆多肽純度較高，功效較為突出。