本發(fā)明涉及合成生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及植物細胞中表達工具的創(chuàng)建及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、植物利用二氧化碳作為碳源，能夠進行光合自養(yǎng)。植物細胞具有豐富的次生代謝合成途徑，可以產(chǎn)生多種前體用于復(fù)雜化合物的合成。除此以外，植物作為合成生物學(xué)底盤還具有安全性高、易于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)等優(yōu)勢。隨著植物合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的功能性治療蛋白和活性小分子在植物底盤中成功實現(xiàn)了合成。合成應(yīng)用中最廣泛的植物底盤是煙草。它具有生長周期短，生物量大的優(yōu)勢。2014年，在煙草中生產(chǎn)了用于治療埃博拉病毒的特效抗體藥物zmapp，在臨床試驗中能夠治好埃博拉的重病患者；此外，bxn的轉(zhuǎn)基因煙草在英國被批準(zhǔn)可以進行商業(yè)化種植；ntqpt1的轉(zhuǎn)基因煙草在美國也通過了安全行驗證，被商業(yè)化種植。

2、在植物細胞中以特定的模式或特定的強度控制目的基因的表達仍然具有挑戰(zhàn)性。一個很有效的解決方案就是引入人工基因表達調(diào)控工具來實現(xiàn)對目的基因表達模式和表達強度的調(diào)控。合成生物學(xué)基于理性的設(shè)計，通過對元件的集成和裝配，從而構(gòu)建出具有特定功能的人工核酸/蛋白序列工具。人工合成的表達調(diào)控工具在微生物細胞中已經(jīng)表現(xiàn)出了比天然基因序列更優(yōu)越、更可控的功能性狀。一個高活性的基因表達工具有助于提高植物細胞中生產(chǎn)功能活性蛋白的經(jīng)濟效益，促進植物底盤的商業(yè)化應(yīng)用。

3、植物較長的生長周期是這些遺傳工具難以廣泛應(yīng)用的一個重要原因。如果需要根據(jù)輸出結(jié)果再回來調(diào)整序列結(jié)構(gòu)和活性更是會耗費很長的時間。因此，本領(lǐng)域仍需要使用方便的煙草葉片中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化法以便定量分析。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于上述缺陷，本發(fā)明提供一種人工轉(zhuǎn)錄激活表達工具，能提高植物細胞中目的蛋白的表達。

2、本發(fā)明第一方面提供一種嵌合啟動子，包含蛋白結(jié)合區(qū)域以及核心啟動子序列。

3、在一個或多個實施方案中，所述蛋白結(jié)合區(qū)域是結(jié)合激活蛋白的核苷酸區(qū)域。

4、在一個或多個實施方案中，所述蛋白結(jié)合區(qū)域包含1-8個串聯(lián)重復(fù)的seq?id?no:1第1-36位所示的序列。優(yōu)選地，重復(fù)個數(shù)為5和/或6。

5、在一個或多個實施方案中，所述核心啟動子序列包含act2核心啟動子序列，優(yōu)選包含擬南芥的act2核心啟動子序列。在一個或多個實施方案中，所述核心啟動子元件如是擬南芥的act2啟動子的包含seq?id?no:1第43-243位所示序列的片段。所述片段為200-1000bp，優(yōu)選200-500bp。

6、在一個或多個實施方案中，所述蛋白結(jié)合區(qū)域和核心啟動子序列直接連接或通過接頭操作性連接。

7、在一個或多個實施方案中，所述蛋白結(jié)合區(qū)域位于核心啟動子序列上游。

8、在一個或多個實施方案中，所述蛋白結(jié)合區(qū)域與核心啟動子序列距離為0-300nt，優(yōu)選為0-216nt。

9、在一個或多個實施方案中，所述嵌合啟動子序列具有seq?id?no:1-8任一所示的序列或與其有至少90％序列相同性并保留seq?id?no:1-8的蛋白結(jié)合功能的變體。

10、本發(fā)明第二方面提供一種融合蛋白，包含核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，所述核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域是能與核酸結(jié)合的蛋白或結(jié)構(gòu)域，包括lexa結(jié)合蛋白或其含有l(wèi)exa識別結(jié)構(gòu)域的肽段。

11、在一個或多個實施方案中，所述核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有seq?id?no:9第1-87位氨基酸序列或與其有至少90％序列相同性并保留核酸識別功能的同源序列。所述同源序列來自腸桿菌科，或來自埃希氏菌屬。

12、在一個或多個實施方案中，所述轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域選自vp16、dell、erf2、med2、p300、tv、vp64、vpr中的一種或多種；優(yōu)選為vpr或tv；更優(yōu)選為vpr。

13、在一個或多個實施方案中，所述核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域直接連接或通過接頭肽連接。所述接頭肽是由1-5個氨基酸g和1-5個氨基酸s組成的單元的重復(fù)序列，優(yōu)選為ggggsn，n＝1-4，優(yōu)選n為1。

14、在一個或多個實施方案中，所述融合蛋白還包括核定位信號(nls)，優(yōu)選為植物細胞核定位信號氨基酸序列。在一個或多個實施方案中，所述核定位信號的序列如seq?idno:10第1-8位所示。

15、在一個或多個實施方案中，所述融合蛋白具有seq?id?no:9-17任一所示的序列或與其有至少90％序列相同性并保留seq?id?no:9-17的功能的變體。

16、本發(fā)明還提供一種核酸構(gòu)建物，包含(1)本文任一實施方案所述嵌合啟動子和(2)本文任一實施方案所述融合蛋白的編碼序列。

17、在一個或多個實施方案中，所述核酸構(gòu)建物是載體，優(yōu)選非病毒載體，更優(yōu)選適于在植物中復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或表達的載體。

18、在一個或多個實施方案中，所述核酸構(gòu)建物是克隆載體、表達載體或重組載體。

19、在一個或多個實施方案中，所述核酸構(gòu)建物包含第一表達框和第二表達框，第一表達框包含所述融合蛋白的編碼序列，第二表達框包含所述嵌合啟動子。

20、在一個或多個實施方案中，所述第一表達框和第二表達框位于同一載體上或不同載體上。

21、在一個或多個實施方案中，所述第一表達框包含所述融合蛋白的編碼序列，位于融合蛋白上游的啟動子，及位于融合蛋白下游的終止子。

22、在一個或多個實施方案中，所述第一表達框中融合蛋白的啟動子是適合在植物中啟動表達的啟動子，例如選自p_stubi、p_mas、p_atrbcs1、p_csvmv、p_ocs、p_rbc。所述啟動子的序列分別如seq?id?no:18-23所示。

23、在一個或多個實施方案中，所述第一表達框中的終止子是能在植物中終止表達的終止子。所述終止子選自t_athsp、t_rbcs1、t_mas、t_atact2、t_ubq和t_35s。優(yōu)選地，所述終止子序列如seq?id?no:29所示。

24、在一個或多個實施方案中，所述第二表達框還包含位于嵌合啟動子下游的用于插入外源序列的區(qū)域，例如克隆位點。

25、在一個或多個實施方案中，所述第二表達框還包含位于嵌合啟動子下游的終止子。所述終止子選自t_athsp、t_rbcs1、t_mas、t_atact2、t_ubq和t_35s。優(yōu)選地，所述終止子序列如seq?id?no:24所示。

26、在一個或多個實施方案中，所述第二表達框還包含目標(biāo)蛋白的編碼序列，所述目標(biāo)蛋白的編碼序列由所述嵌合啟動子啟動表達。所述目標(biāo)蛋白的編碼序列位于嵌合啟動子下游。

27、在一個或多個實施方案中，所述目標(biāo)蛋白的編碼序列位于克隆位點中。優(yōu)選地，所述目標(biāo)蛋白的編碼序列包含選自egfp蛋白、西尼羅河病毒ns1蛋白、寨卡病毒ns1蛋白、奇果蛋白(miraculin)中的一種或多種蛋白的編碼序列。

28、在一個或多個實施方案中，所述第二表達框包含所述嵌合啟動子，克隆位點，及位于克隆位點下游的終止子序列。

29、在一個或多個實施方案中，所述第二表達框包含所述嵌合啟動子，目標(biāo)蛋白編碼序列，及位于目標(biāo)蛋白下游的終止子序列。

30、本發(fā)明還提供一種宿主細胞，包含：

31、(1)本文任一實施方案融合蛋白和具有本文任一實施方案嵌合啟動子的表達框，或，

32、(2)本文任一實施方案所述的核酸構(gòu)建物。

33、在一個或多個實施方案中，所述宿主細胞包括大腸桿菌、農(nóng)桿菌。

34、在一個或多個實施方案中，所述宿主細胞不是植物細胞。

35、本發(fā)明還提供一種試劑盒，包含本文任一實施方案所述的嵌合啟動子、融合蛋白、核酸構(gòu)建物、和/或宿主細胞。

36、本發(fā)明還提供一種在細胞中表達目標(biāo)蛋白的方法，所述細胞包含：(1)本文任一實施方案融合蛋白和(2)具有本文任一實施方案嵌合啟動子的表達框，所述目標(biāo)蛋白的編碼序列與所述嵌合啟動子操作性連接，所述方法包括在所述融合蛋白誘導(dǎo)嵌合啟動子啟動表達的條件下孵育所述細胞的步驟。在一個或多個實施方案中，所述條件是適合所述細胞生長的條件。

37、在一個或多個實施方案中，所述細胞包含本文所述的核酸構(gòu)建物。

38、在一個或多個實施方案中，所述方法包括：(1)將目標(biāo)蛋白的編碼序列導(dǎo)入本文所述核酸構(gòu)建物中，所述目標(biāo)蛋白的編碼序列由所述嵌合啟動子啟動表達；(2)將所述核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)移到細胞中；(3)在適合所述核酸構(gòu)建物表達的條件下孵育所述細胞。在一個或多個實施方案中，所述目標(biāo)蛋白的編碼序列導(dǎo)入第二表達框中的嵌合啟動子下游，優(yōu)選地，導(dǎo)入嵌合啟動子下游的克隆位點中。在一個或多個實施方案中，所述適合所述核酸構(gòu)建物表達的條件是第一表達框表達并且所表達的融合蛋白能誘導(dǎo)嵌合啟動子啟動目標(biāo)核酸表達的條件。在一個或多個實施方案中，所述條件是適合細胞生長的條件。

39、在一個或多個實施方案中，所述方法包括：(1)將目標(biāo)蛋白的編碼序列導(dǎo)入包含本文任一實施方案所述的嵌合啟動子的第二表達框中，位于嵌合啟動子的下游，(2)將第二表達框?qū)爰毎校黾毎疚娜我粚嵤┓桨傅娜诤系鞍谆蚝械谝槐磉_框，所述第一表達框包含本文任一實施方案所述的融合蛋白的編碼序列；(3)在適合第二表達框表達的條件下孵育所述細胞。在一個或多個實施方案中，所述第二表達框還包含終止子和任選的克隆位點。在一個或多個實施方案中，所述目標(biāo)蛋白的編碼序列位于克隆位點中。在一個或多個實施方案中，所述適合第二表達框表達的條件是融合蛋白能誘導(dǎo)嵌合啟動子啟動表達的條件，或者，是第一表達框表達并且所表達的融合蛋白能誘導(dǎo)嵌合啟動子啟動目標(biāo)蛋白的編碼序列表達的條件。在一個或多個實施方案中，所述條件是適合細胞生長的條件。

40、在一個或多個實施方案中，所述目標(biāo)蛋白的編碼序列包含選自egfp蛋白、西尼羅河病毒ns1蛋白、寨卡病毒ns1蛋白、奇果蛋白(miraculin)中的一種或多種蛋白的編碼序列。

41、在一個或多個實施方案中，所述細胞是植物細胞。

42、本發(fā)明還提供一種獲取表達目標(biāo)蛋白的植物的方法，包括：

43、(1)將包含目標(biāo)蛋白的編碼序列的本文所述的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)入植物器官或組織，獲得轉(zhuǎn)化有所述核酸構(gòu)建物的植物組織或器官，所述目標(biāo)蛋白的編碼序列由所述嵌合啟動子啟動表達；和

44、(2)將步驟(1)獲得的轉(zhuǎn)入了本文所述核酸構(gòu)建物的植物組織或器官再生成植物植株。

45、在一個或多個實施方案中，所述目標(biāo)蛋白的編碼序列位于所述第二表達框中，由所述嵌合啟動子啟動表達。

46、優(yōu)選地，所述的方法包括步驟：

47、(1)提供攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，所述的表達載體含有本發(fā)明所述核酸構(gòu)建物；

48、(2)將植物組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述目標(biāo)蛋白的編碼序列轉(zhuǎn)入并且整合到植物細胞的染色體上；

49、(3)選擇出轉(zhuǎn)入所述目標(biāo)蛋白的編碼序列的植物組織或器官；以及

50、(4)將步驟(3)中的植物組織或器官再生成植物。

51、本發(fā)明通過在植物細胞中引入人工啟動子核苷酸序列以及人工激活融合蛋白，利用激活轉(zhuǎn)錄回路提高了植物細胞中內(nèi)源、外源蛋白的表達，實現(xiàn)了天然啟動子不能實現(xiàn)的目標(biāo)基因的表達模式和強度，有助于提高植物細胞中生產(chǎn)功能活性蛋白的經(jīng)濟效益，促進植物底盤的商業(yè)化應(yīng)用。