本發(fā)明涉及殼聚糖制備領(lǐng)域，具體涉及一種抗菌功能化殼聚糖衍生物的制備方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖(β-(1,4)-2-氨基-2-脫氧-d-葡萄糖)是一種具有良好的生物相容性和生物可降解性的天然堿性多糖，由地球上儲量僅次于纖維素的天然有機化合物甲殼素脫乙酰后得到。殼聚糖因其特殊的理化性質(zhì)和生物學特性而具有降低血糖、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制微生物生長、吸濕保濕等諸多優(yōu)良功能，被稱為第六生命要素，在醫(yī)藥、食品、化工及環(huán)保等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。尤其是作為抗菌大分子，由于其生物相容性好、毒性低、可降解等特點成為近年來綠色天然抗菌劑開發(fā)的研究熱點之一。但由于抗菌活性基團氨基的活性較低，并且由于殼聚糖分子間存在較強的氫鍵作用導致的難溶和抗菌活性低等問題，極大地限制了殼聚糖作為抗菌材料的推廣和應(yīng)用。
殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中含有的羥基、氨基等官能團是引入其它功能基團得到功能化殼聚糖衍生物的關(guān)鍵活性位點。通過控制與羥基或氨基的反應(yīng)條件，可對殼聚糖進行如酰基化、羧基化、醚化、烷基化、酯化、水解等功能化反應(yīng)[j.adv.drug.deliv.rev.,2001,50,591.]，從而改變其物理化學性能，賦予殼聚糖更多的特定功能，以適應(yīng)更多領(lǐng)域的需要，進一步拓寬殼聚糖的應(yīng)用范圍。
胍基是目前自然界發(fā)現(xiàn)的正電性最強的生物活性有機堿，其在生理ph介質(zhì)中能夠質(zhì)子化，在中性、酸性和堿性條件下均能形成帶正電的基團。胍基基團具有抗炎癥、降壓降血脂、抗病毒、抗腫瘤等生物活性，同時具有強堿性、強穩(wěn)定性、較好的生物活性和抗菌性能。胍基化合物在天然產(chǎn)物中產(chǎn)量豐富，正電性、堿性以及溶解性均較強，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、建筑、服裝、化工等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。殼聚糖上的氨基具有較高的反應(yīng)活性，因此通過氨基對殼聚糖進行胍基化改性賦予其與胍類化合物類似的性能，進而提高殼聚糖的抑菌抗菌性能，在這方面的研究國內(nèi)外已有諸多報道(huy.,et.al.,carbohyd.polym.,2007,67,66；bioresourtechnol，2010，101，5693；zhaix.,et.al.,j.appl.polym.sci.,2011,121,3569.)。xiao等人在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)與n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)存在的條件下，使精氨酸與殼聚糖在2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)緩沖液中常溫反應(yīng)，得到了精氨酸改性的胍基功能化殼聚糖衍生物(xiaob.,et.al.,carbohyd.polym.,2011,83,144.)。然而，由于精氨酸中α氨基的存在，同樣可以和羧基活化后的氨基酸發(fā)生反應(yīng)，使得精氨酸自聚嚴重從而導致精氨酸改性所得的胍基功能化殼聚糖衍生物側(cè)鏈取代度低，并沒有充分改善殼聚糖的水溶性以及抑菌性能，這在很大程度上影響了其作為綠色天然抑菌劑的應(yīng)用。而作為肌酸前體物的胍基乙酸，是甘氨酸的胍基衍生物，常被用作飼料添加劑、有機合成中間體，因為其分子中不含活性氨基，所含羧基具有一定的化學活性，在保證與殼聚糖分子上的氨基反應(yīng)的同時，又不會產(chǎn)生自聚，適合用于殼聚糖的抗菌功能化改性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種抗菌功能化殼聚糖衍生物的制備方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
一種抗菌功能化殼聚糖衍生物的制備方法，殼聚糖與胍基乙酸進行酰胺化反應(yīng)，得到抗菌功能化的殼聚糖衍生物。
優(yōu)選地，包括以下步驟：
1)將殼聚糖溶解在稀酸溶液中，得到殼聚糖稀酸水溶液；
2)胍基乙酸進行羧基活化；
3)將活化后的胍基乙酸混合液與殼聚糖稀酸水溶液混合，攪拌反應(yīng)；
4)向反應(yīng)液中加入鹽酸羥胺終止反應(yīng)；
5)反應(yīng)液過濾后在去離子水中透析，透析完成后進行冷凍干燥處理，即得抗菌功能化殼聚糖衍生物。
優(yōu)選地，步驟1)中所述的殼聚糖數(shù)均分子量為102-107，脫乙酰度為50-99％。
優(yōu)選地，步驟1)中所述的稀酸為鹽酸或乙酸，酸的濃度為0.1-0.5m，殼聚糖溶液質(zhì)量百分比為0.1％-50％。
優(yōu)選地，步驟2)中胍基乙酸進行羧基活化的具體條件為：
胍基乙酸在n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)存在的條件下，在2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)緩沖液中進行活化；
優(yōu)選地，所述mes緩沖液的濃度為10-100mm，ph為4.5-7.5；
優(yōu)選地，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)與胍基乙酸的物質(zhì)的量之比為0.5-5:1；
n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的物質(zhì)的量之比為1:1。
優(yōu)選地，步驟2)胍基乙酸進行羧基活化的溫度為0-35℃，活化時間為0.5-3小時。
優(yōu)選地，步驟3)中胍基乙酸與殼聚糖的物質(zhì)的量之比為0.1-10:1。
優(yōu)選地，步驟3)中的反應(yīng)溫度應(yīng)為0-35℃，反應(yīng)時間為12-72小時。
優(yōu)選地，步驟4)中所述鹽酸羥胺與胍基乙酸的物質(zhì)的量之比為1:1。
優(yōu)選地，步驟5)中透析條件為每5-10小時換水一次，換水6-8次后，即完成透析。
本發(fā)明所述的一種優(yōu)選地方案如式1所示：
本發(fā)明的有益效果如下：
本發(fā)明所述的抗菌功能化殼聚糖衍生物的制備方法，使用胍基乙酸直接與殼聚糖進行酰胺化，避免了傳統(tǒng)使用精氨酸進行胍基功能化過程中氨基酸自聚的問題。并且操作簡單、條件溫和，所用主要原料殼聚糖與胍基乙酸來源廣泛，價格相對較低，無毒無害，生產(chǎn)過程中不會造成環(huán)境污染；反應(yīng)流程簡單，并且由于后處理采用冷凍干燥技術(shù)，所得抗菌功能化的殼聚糖衍生物具有三維大孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有利于溶解過程中溶劑分子的快速滲入，提高了溶解性。利用該方法制備得到的抗菌功能化殼聚糖衍生物，在保證了產(chǎn)物較高生物安全性的同時提高了抗菌性和溶解性，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施方式
下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)以上發(fā)明的內(nèi)容做出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。
實施例1：
稱取0.1克殼聚糖加入到100毫升0.1m的稀鹽酸中，室溫下機械攪拌使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量百分比為0.1％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在冰水浴中活化3小時的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為10mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝4.5)20ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為10:1:5:5，于35℃下持續(xù)攪拌反應(yīng)12小時后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔5小時換水一次，換水6次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時后，放入凍干機直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率56％。
實施例2：
稱取1.0克殼聚糖加入到100毫升0.2m的稀鹽酸中，室溫下機械攪拌以使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量百分比為1.0％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在15℃下活化2小時的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為25mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝5.0)35ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為2:2:5:5，于室溫下持續(xù)攪拌反應(yīng)24小時后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔7小時換水一次，換水7次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時后，放入凍干機直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率59％。
實施例3：
稱取10.0克殼聚糖加入到100毫升0.3m的稀鹽酸中，室溫下機械攪拌以使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量體積百分比濃度為9.1％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在室溫下活化1小時的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為50mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝6.5)20ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為1:5:5:5，于15℃下持續(xù)攪拌反應(yīng)48小時后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔8小時換水一次，換水6次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時后，放入凍干機直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率63％。
實施例4：
稱取100克殼聚糖加入到100毫升0.5m的稀鹽酸中，50℃水浴下機械攪拌以使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量百分比為50％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在35℃下活化0.5小時的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為100mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝7.5)20ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為1:10:5:5，于冰水浴下持續(xù)攪拌反應(yīng)72小時后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔10小時換水一次，換水8次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時后，放入凍干機直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率45％。
實施例5：
稱取0.1克殼聚糖加入到100毫升0.1m的稀乙酸中，60℃水浴下機械攪拌以使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量百分比為0.1％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在冰水浴下活化3小時的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為10mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝4.5)30ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為10:1:5:5，于35℃下持續(xù)攪拌反應(yīng)72小時后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔5小時換水一次，換水7次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時后，放入凍干機直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率48％。
實施例6：
稱取1.0克殼聚糖加入到100毫升0.2m的稀乙酸中，60℃水浴下機械攪拌以使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量百分比為1.0％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在15℃下活化2小時的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為25mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝5.0)40ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為2:2:5:5，于室溫下持續(xù)攪拌反應(yīng)48小時后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔7小時換水一次，換水6次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時后，放入凍干機直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率58％。
實施例7：
稱取10.0克殼聚糖加入到100毫升0.3m的稀乙酸中，60℃油浴下機械攪拌以使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量百分比為9.1％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在室溫下活化1小時的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為50mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝6.5)50ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為1:5:5:5，于15℃下持續(xù)攪拌反應(yīng)24小時后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔8小時換水一次，換水7次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時后，放入凍干機直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率55％。
實施例8：
稱取20.0克殼聚糖加入到100毫升0.5m的稀乙酸中，60℃油浴下機械攪拌以使殼聚糖溶解完全，從而得到質(zhì)量百分比為16.7％的殼聚糖稀酸溶液；然后將在35℃下中活化0.5小時的胍基乙酸、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)的混合溶液(溶劑為100mm的2-(n-嗎啉代)乙烷磺酸(mes)的緩沖溶液，ph＝7.5)50ml加入上述殼聚糖稀酸溶液中，其中殼聚糖、胍基乙酸、nhs、edc的物質(zhì)的量之比為1:10:5:5，于冰水浴中持續(xù)攪拌反應(yīng)12小時后加入與胍基乙酸等物質(zhì)的量的鹽酸羥胺終止反應(yīng)；過濾除去反應(yīng)液中的不溶物，接著將濾液轉(zhuǎn)入透析袋，將透析袋兩端封緊投入去離子水中透析，每隔10小時換水一次，換水8次后將透析液放入-86℃冰箱中冷凍1小時后，放入凍干機直至冷凍干燥充分，即可得所述抗菌功能化的殼聚糖衍生物，產(chǎn)率55％。