本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體來說是一種利用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)對牛、豬源性成分進行定量檢測的方法，以及在該方法中用到的引物和探針組合、相應(yīng)的試劑盒。

背景技術(shù)：

近年來，遭到媒體曝光的阿膠不含驢皮成分，假牛肉，假豬蹄，用鴨肉制成涮羊肉和烤串，花旗參里摻蘿卜干，山寨蜂膠，假魚丸、假燕窩、假蟲草等摻假售假事件，涉及集貿(mào)市場、餐飲飯館，乃至深受消費者信賴的知名超市以及各大電商平臺。面對這些真假難辨的食品和保健品，消費者總是一籌莫展。該如何鑒別這些商品是否摻假或假冒已成為食品安全監(jiān)管和檢測機構(gòu)迫切需要解決的問題。事實上，相關(guān)的檢測并不困難，利用DNA檢測技術(shù)鑒別動、植物源性成分早已應(yīng)用于物種資源的鑒定工作中。

針對市面上摻雜、摻假牛肉普遍的現(xiàn)象，經(jīng)過調(diào)查分析我們發(fā)現(xiàn)，牛肉制品中最普遍的摻假成分是豬肉，因為豬肉成本低廉，并且容易獲得。

目前常用的DNA檢測手段是PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù)。不同的動、植物DNA都具有唯一性，根據(jù)這一特性采用PCR技術(shù)對相應(yīng)物種的DNA進行特異性擴增，可迅速準確地鑒定產(chǎn)品中是否含有其他外源性成分。但是同時存在一個問題，由于PCR技術(shù)非常靈敏，尤其是實時熒光PCR，這樣就有可能在加工過程被污染了其他動物成分，或用的調(diào)味料中帶進了其他成分，從而造成誤判的情況發(fā)生，因此有必要針對此類樣品開發(fā)定量檢測方法。

微滴式數(shù)字PCR(droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR)作為DNA定量的新技術(shù)，克服了實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR，qPCR)的一系列缺點，實現(xiàn)了單分子DNA的絕對定量。該技術(shù)是潛在的核酸測量基準方法，并從原理上為核酸計量提供了保證。相比其他方法，ddPCR作為絕對定量方法能準確定量目標DNA和提供可靠的定量數(shù)據(jù)。

qPCR是目前DNA定量研究的主要技術(shù)，該技術(shù)通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光結(jié)合染料(SYBR green I)或熒光標記的探針(如TaqMan Probes)，利用實時積累的熒光信號監(jiān)測整個擴增過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析，以此來評估PCR的擴增效果。qPCR主要依賴于校準物制備的標準曲線，進而確定未知樣品的濃度或含量，因此是一種相對定量的方法。該技術(shù)存在以下問題：(1)校準品和樣品間背景的不同將引入偏差，并且影響PCR的效率和測量響應(yīng)；(2)低拷貝數(shù)的目標DNA分子可能通過擴增檢測不到；(3)樣品的PCR擴增效率可能與校準物的擴增效率存在差異；(4)DNA提取時引入DNA溶液的雜質(zhì)或者DNA的降解影響了PCR動態(tài)擴增過程。

ddPCR不同于傳統(tǒng)的qPCR，因為其采用直接計數(shù)目標DNA分子數(shù)而不依賴任何校準物或外標，ddPCR通過計數(shù)單個分子從而實現(xiàn)絕對定量。ddPCR將傳統(tǒng)PCR的指數(shù)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，僅僅通過程序設(shè)定的循環(huán)數(shù)后顯示擴增是否發(fā)生，克服了qPCR的缺點，達到核酸的絕對定量。ddPCR在進行擴增反應(yīng)前，將含有DNA模板的PCR體系分布到大量的獨立反應(yīng)單元，單分子間通過稀釋分離，并且獨自進行PCR擴增，最后分析每個擴增產(chǎn)物，這種通過先于PCR擴增的樣品分離，可以消除本底信號的影響，從而提高低豐度靶標的擴增靈敏度，由檢測結(jié)果即可計算出DNA的模板拷貝數(shù)而不需要采用參考標準物或者外標。ddPCR的準確定量依賴于40～45個循環(huán)的擴增，錯誤的陰性檢出水平(單分子DNA模板出現(xiàn)在單一反應(yīng)單元而未被檢出)非常低。

ddPCR技術(shù)操作方便、檢測通量高、特異性強、靈敏度高、定量準確等優(yōu)點使其成為了現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的重要工具。ddPCR在臨床診斷方面已應(yīng)用于癌癥的等位基因突變和拷貝數(shù)變異等方面的檢測，為癌癥檢測提供了新的診斷工具。ddPCR技術(shù)用于單細胞基因表達的研究是ddPCR發(fā)展的里程碑，基于這項技術(shù)，目前中山大學(xué)腫瘤防治中心已推出多項腫瘤檢測項目，能精確檢測人體的基因突變位點。在環(huán)境微生物方面，ddPCR的高通量擴增和分析的優(yōu)點使同時研究自然界中多個細菌單細胞的多個不同基因得以實現(xiàn)，ddPCR將為環(huán)境研究領(lǐng)域提供新的契機。另外核酸測序?qū)⑹腔赿dPCR的單分子擴增技術(shù)最重要的應(yīng)用領(lǐng)域，下一代測序技術(shù)如454，Solexa和SOLiD平臺均需要通過測序校正分子數(shù)量，基于ddPCR的單分子測序技術(shù)的研究，使ddPCR能為高通量測序提供靈敏和絕對的校準。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于微滴式數(shù)字PCR的牛、豬源性成分定量檢測方法，所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)實時熒光定量PCR的不足，根據(jù)牛的生長激素基因(BGH)序列特征設(shè)計了一組牛特異性引物和熒光探針，根據(jù)豬的肌動蛋白基因(β-Actin)序列特征設(shè)計了一組豬特異性引物和熒光探針，這兩個基因在牛、豬肉組織中的拷貝數(shù)相對穩(wěn)定，適合用于微滴式數(shù)字PCR的定量檢測。經(jīng)過PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的優(yōu)化后，建立了一種牛、豬源性成分定量檢測方法。本發(fā)明提供的方法適用于摻雜了豬肉的牛肉及其制品中牛成分的定量檢測，檢測結(jié)果穩(wěn)定、準確。

為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種基于微滴式數(shù)字PCR的牛、豬源性成分定量檢測的引物和探針，包括：

兩條檢測牛源性成分的引物，其序列分別為

Bov-BGH-F：5′-CCGATGGATGTGTTCAGAGCT-3′；(SEQ ID No.1)

Bov-BGH-R：5′-GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3′；(SEQ ID No.2)

一條檢測牛源性成分的探針，其序列為

Bov-BGH-Pr：5′-TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-3′；(SEQ ID No.3)

兩條檢測豬源性成分的引物，其序列分別為

Sus-β-Actin-F：5′-CGAGACCTTCAACACCCCAG-3′；(SEQ ID No.4)

Sus-β-Actin-R：5′-GGCGTACCCCTCGTAGATG-3′；(SEQ ID No.5)

一條檢測豬源性成分的探針，其序列為

Sus-β-Actin-Pr：5′-TGTGGGTGACCCCGTCTCCGGA-3′。(SEQ ID No.6)

進一步地，所述Bov-BGH-Pr的5′端標記有熒光報告基團FAM，3′端標記有熒光淬滅基團BHQ1；所述Sus-β-Actin-Pr的5′端標記有熒光報告基團HEX，3′端標記有熒光淬滅基團BHQ1。

一種基于微滴式數(shù)字PCR的牛、豬源性成分定量檢測的試劑盒，所述試劑盒包括上述的引物和探針。

一種基于微滴式數(shù)字PCR的牛、豬源性成分定量檢測方法，包括使用上述引物和探針進行PCR擴增的步驟。

進一步地，該測試方法包括以下步驟：

S1、提取樣品基因組DNA；

S2、將上述引物和探針加入反應(yīng)體系中進行雙重PCR擴增反應(yīng)；

S3、將PCR產(chǎn)物置于數(shù)字PCR儀中讀數(shù)分析。

進一步地，所述步驟S2中，PCR反應(yīng)體系總體積為20μL，各組分如下：2×ddPCR Supermix混合反應(yīng)液10μL，引物Bov-BGH-F、Bov-BGH-R、Sus-β-Actin-F、Sus-β-Actin-R各1μL，探針Bov-BGH-Pr、Sus-β-Actin-Pr各1μL，模板DNA 2μL，加ddH₂O補足至20μL。

進一步地，所述步驟S2中，PCR擴增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，55℃退火10s，68℃延伸20s，40個循環(huán)；擴增結(jié)束后進行98℃10min的酶熱失活。

進一步地，所述引物Bov-BGH-F、Bov-BGH-R、Sus-β-Actin-F、Sus-β-Actin-R的使用終濃度均為900nmol/L，所述探針Bov-BGH-Pr、Sus-β-Actin-Pr的使用終濃度均為250nmol/L。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明設(shè)計了一組牛的特異性引物和熒光探針以及一組豬的特異性引物和熒光探針，建立了一套牛、豬源性成分定量檢測方法體系。本發(fā)明方法克服了實時熒光定量PCR的一系列缺點，在不依賴于任何標準物或參照物的情況下，能對樣品中的牛肉和豬肉含量進行準確定量，而且特異性強、靈敏度高，具有非常重要的實際意義。

附圖說明

圖1為實施例1對一系列參照樣品中牛肉含量進行檢測的結(jié)果分析圖；

圖2為實施例2靈敏度熒光檢測信號圖譜；

圖3為實施例3牛引物、探針擴增信號圖譜；

圖4為實施例3豬引物、探針擴增信號圖譜；

圖5為實施例3牛肉含量檢測結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。

實施例1

測試方法的準確性驗證

1、儀器、試劑與供試樣品

儀器：伯樂QX200微滴數(shù)字PCR儀，全自動核酸提取系統(tǒng)，微量分光光度計，超速冷凍離心機。

試劑：2×Droplet PCR Supermix，Droplet generation oil(購自伯樂生物有限公司)。

引物、探針由大連寶生物技術(shù)有限公司合成，序列如下：

兩條檢測牛源性成分的引物

Bov-BGH-F：5′-CCGATGGATGTGTTCAGAGCT-3′；

Bov-BGH-R：5′-GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3′；

一條檢測牛源性成分的探針Bov-BGH-Pr：5′-TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-3′；

兩條檢測豬源性成分的引物

Sus-β-Actin-F：5′-CGAGACCTTCAACACCCCAG-3′；

Sus-β-Actin-R：5′-GGCGTACCCCTCGTAGATG-3′；

一條檢測豬源性成分的探針Sus-β-Actin-Pr：5′-TGTGGGTGACCCCGTCTCCGGA-3′。

Bov-BGH-Pr的5′端標記有熒光報告基團FAM，3′端標記有熒光淬滅基團BHQ1；Sus-β-Actin-Pr的5′端標記有熒光報告基團HEX，3′端標記有熒光淬滅基團BHQ1。

供試樣品：將牛肉和豬肉樣品烘干至恒重后研磨成肉粉，按質(zhì)量比9：1、3：1、1：1、1：3、1：9的比例混合成牛肉含量分別90％、75％、50％、25％、10％的參照樣品。

2、DNA的提取和模板的制備

分別稱取各參照樣品1.0g，采用改良CTAB磁珠法提取基因組DNA，得到的DNA溶液經(jīng)微量分光光度計測定后定量至50ng/uL，即為上樣模板。

3、反應(yīng)體系的配制

PCR反應(yīng)體系總體積為20μL，各組分如下：2×ddPCR Supermix混合反應(yīng)液10μL，濃度為18μmol/L的引物Bov-BGH-F、Bov-BGH-R、Sus-β-Actin-F、Sus-β-Actin-R各1μL，濃度為5μmol/L的探針Bov-BGH-Pr、Sus-β-Actin-Pr各1μL，模板DNA 2μL，加ddH₂O補足至20μL；引物的終濃度為900nmol/L，探針的終濃度為250nmol/L。

4、微滴的生成

將充分混勻的反應(yīng)體系小心地轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡相應(yīng)孔中，在每個對應(yīng)油孔中分別加入70μL Droplet generation oil，蓋上橡膠墊后放入微滴發(fā)生器中生成油包水的反應(yīng)微滴。再小心地將反應(yīng)微滴轉(zhuǎn)移至96孔反應(yīng)板中，并封好鋁膜。

5、反應(yīng)程序

將裝有反應(yīng)微滴的96孔反應(yīng)板置于PCR儀中，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，55℃退火10s，68℃延伸20s，40個循環(huán)；擴增結(jié)束后進行98℃10min的酶熱失活。

6、讀數(shù)與結(jié)果分析

反應(yīng)結(jié)束后，將96孔板放入伯樂QX200微滴數(shù)字PCR儀中進行檢測，檢測結(jié)果見圖1，其中C02、C03牛肉含量為90％，C04、C05牛肉含量為75％，C06、C07牛肉含量為50％，C08、C09牛肉含量為25％，C10、C11牛肉含量為10％。牛肉含量計算方法為：由檢測結(jié)果可知本方法測定的數(shù)值與參照樣品實際含量非常接近，絕對偏差不超過4％。

實施例2

測試方法的靈敏度試驗

1、儀器與試劑

儀器：伯樂QX200微滴數(shù)字PCR儀，全自動核酸提取系統(tǒng)，微量分光光度計，超速冷凍離心機。

試劑：2×Droplet PCR Supermix，Droplet generation oil(購自伯樂生物有限公司)；引物、探針(同實施例1)。

2、DNA模板的制備

將牛肉DNA和豬肉DNA按體積比分別配成牛含量為50％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％的DNA溶液，作為上樣模板。

3、反應(yīng)體系的配制

PCR反應(yīng)體系總體積為20μL，各組分如下：2×ddPCR Supermix混合反應(yīng)液10μL，引物Bov-BGH-F、Bov-BGH-R、Sus-β-Actin-F、Sus-β-Actin-R各1μL，探針Bov-BGH-Pr、Sus-β-Actin-Pr各1μL，模板DNA 2μL，加ddH₂O補足至20μL；引物的終濃度為900nmol/L，探針的終濃度為250nmol/L。

4、微滴的生成

將充分混勻的反應(yīng)體系小心地轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡相應(yīng)孔中，在每個對應(yīng)油孔中分別加入70μL Droplet generation oil，蓋上橡膠墊后放入微滴發(fā)生器中生成油包水的反應(yīng)微滴。再小心地將反應(yīng)微滴轉(zhuǎn)移至96孔反應(yīng)板中，并封好鋁膜。

5、反應(yīng)程序

將裝有反應(yīng)微滴的96孔反應(yīng)板置于PCR儀中，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，55℃退火10s，68℃延伸20s，40個循環(huán)；擴增結(jié)束后進行98℃10min的酶熱失活。

6、讀數(shù)與結(jié)果分析

反應(yīng)結(jié)束后，將96孔板放入伯樂QX200微滴數(shù)字PCR儀中進行檢測，熒光信號圖譜見圖2，其中B03為牛含量50％，C03為牛含量10％，D03為牛含量5％，E03為牛含量1％，F(xiàn)03為牛含量0.1％，G03為牛含量0.01％，可知本方法的靈敏度可檢測到0.01％以下。

實施例3

對市售牛肉丸樣品進行檢測

1、儀器與試劑

儀器：伯樂QX200微滴數(shù)字PCR儀，全自動核酸提取系統(tǒng)，微量分光光度計，超速冷凍離心機。

試劑：2×Droplet PCR Supermix，Droplet generation oil(購自伯樂生物有限公司)；引物、探針(同實施例1)。

供試樣品：購自市場的牛肉丸樣品。

2、DNA的提取和模板的制備

取樣品約200g，烘干至恒重后研磨成肉粉，稱取2g采用改良CTAB磁珠法提取基因組DNA，得到的DNA溶液作為上樣模板。

3、反應(yīng)體系的配制

PCR反應(yīng)體系總體積為20μL，各組分如下：2×ddPCR Supermix混合反應(yīng)液10μL，引物Bov-BGH-F、Bov-BGH-R、Sus-β-Actin-F、Sus-β-Actin-R各1μL，探針Bov-BGH-Pr、Sus-β-Actin-Pr各1μL，模板DNA 2μL，加ddH₂O補足至20μL；引物的終濃度為900nmol/L，探針的終濃度為250nmol/L。

4、微滴的生成

將充分混勻的反應(yīng)體系小心地轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡相應(yīng)孔中，在每個對應(yīng)油孔中分別加入70μL Droplet generation oil，蓋上橡膠墊后放入微滴發(fā)生器中生成油包水的反應(yīng)微滴。再小心地將反應(yīng)微滴轉(zhuǎn)移至96孔反應(yīng)板中，并封好鋁膜。

5、反應(yīng)程序

將裝有反應(yīng)微滴的96孔反應(yīng)板置于PCR儀中，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，55℃退火10s，68℃延伸20s，40個循環(huán)；擴增結(jié)束后進行98℃10min的酶熱失活。

6、讀數(shù)與結(jié)果分析

反應(yīng)結(jié)束后，將96孔板放入伯樂QX200微滴數(shù)字PCR儀中進行檢測，牛引物、探針擴增信號圖譜見圖3，豬引物、探針擴增信號圖譜見圖4，牛肉含量檢測結(jié)果見圖5，其中C02、D02分別為兩次重復(fù)試驗，M01為平均值，由檢測結(jié)果可知該樣品中的牛肉含量為45.1％。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何屬于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護范圍為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心

<120> 一種基于微滴式數(shù)字PCR的牛、豬源性成分定量檢測方法、引物和探針及試

劑盒

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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ccgatggatg tgttcagagc t 21

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<212> DNA

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<212> DNA

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tgggctttag ggcttccgaa tgtgaa 26

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<212> DNA

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cgagaccttc aacaccccag 20

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<212> DNA

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ggcgtacccc tcgtagatg 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgtgggtgac cccgtctccg ga 22