本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種水稻隱性核雄性不育基因cyp704b2的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雄性不育系的發(fā)掘和利用是提高作物產(chǎn)量和獲取雜種優(yōu)勢(shì)的重要途徑。目前，主要的雜交育種方法有“三系法”和“兩系法”，二者在提高作物產(chǎn)量和保證國(guó)家糧食安全中發(fā)揮了非常重要的作用，但也都存在一些比較明顯的弊端。

比如，三系法的利用中不僅需要選育質(zhì)核互作的雄性不育系，受恢保關(guān)系的制約，同時(shí)還需要選育對(duì)應(yīng)的保持系和恢復(fù)系才能進(jìn)行繁種和制種，育種過程復(fù)雜、育種周期冗長(zhǎng)、育種效率和種質(zhì)資源利用率低下；以光溫敏不育系為基礎(chǔ)的兩系法雖然打破了恢保關(guān)系的限制，但光溫敏雄性不育材料的育性受到環(huán)境溫度和光照變化的影響，易導(dǎo)致繁種和制種失敗，造成兩系雜交法難以大量推廣應(yīng)用。單隱性核雄性不育基因控制的不育系恰好克服了“三系法”和“兩系法”的缺陷，其育性不受光溫條件影響，兼具三系法的穩(wěn)定性和兩系法配組靈活性的優(yōu)點(diǎn)，因而具有重要的潛在商業(yè)利用價(jià)值。

水稻材料1907是海南波蓮水稻基因科技有限公司于2013年6月在湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院用鈷60輻射秈稻材料9311后，經(jīng)多世代篩選而獲得的一個(gè)由單基因(cyp704b2)控制的無花粉型隱性核雄性不育、雌性可育的突變體材料。在該突變體中野生型CYP704B2基因編碼區(qū)第794個(gè)堿基后的GGG被替換為T，造成了移碼突變和翻譯提前終止，導(dǎo)致野生型CYP704B2蛋白C端339個(gè)氨基酸被Tyr-Ala-Val-Thr所取代，最終產(chǎn)生不育表型(龍湍，安保光，李新鵬，等.秈稻9311輻射誘變突變體庫的創(chuàng)建及其篩選.中國(guó)水稻科學(xué)，2016，30(1)：44-52)。

DNA分子標(biāo)記是指能反映生物個(gè)體或種群間基因組遺傳差異的特異DNA片段。對(duì)于基因組中核苷酸序列已知的小片段插入缺失類型的遺傳差異一般可使用特異引物PCR標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，例如STS(sequnce-tagged site)標(biāo)記，引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR標(biāo)記，CAPS(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences)標(biāo)記，dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)標(biāo)記等(管峰，艾君濤，楊利國(guó).一種SNP檢測(cè)新方法:四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù).生命的化學(xué)，2004，24(6)：514-516；王忠華，Redus MARC，賈育林.水稻抗稻瘟病基因Pi-ta共顯性分子標(biāo)記的建立.中國(guó)水稻科學(xué)，2005，19(6)：483-488；水稻紫色果皮的延遲遺傳及Pb基因功能標(biāo)記開發(fā).中國(guó)水稻科學(xué)，2014，28(6)：605-611；張亞東，周麗慧，鄭佳，等。2016，一種鑒定水稻粒長(zhǎng)基因qGL3等位基因變異的PCR分子標(biāo)記方法，專利號(hào)：CN103882145B；丁丹，張亞東，鄭佳.水稻粒長(zhǎng)基因GS3和qGL3功能標(biāo)記的設(shè)計(jì)及應(yīng)用.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，30(6)：1191-1197)。然而這些方法在實(shí)用性、檢測(cè)效率或使用成本上各自存在不同程度的局限性，因而不利于大規(guī)模、批量化的育種實(shí)踐運(yùn)用。

鑒于隱性核雄性不育材料在育種中潛在的巨大商業(yè)價(jià)值及運(yùn)用前景，針對(duì)基因中引起功能變異的堿基序列，設(shè)計(jì)與隱性核雄性不育、雌性可育表型完全一致且操作簡(jiǎn)便、分型快速、使用靈活、費(fèi)用低廉的分子標(biāo)記，將成為廣大育種者不可或缺的輔助育種工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)與不足，提供一種水稻隱性核雄性不育基因cyp704b2的分子標(biāo)記。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻隱性核雄性不育基因cyp704b2基因型的方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供利用上述分子標(biāo)記同時(shí)鑒定水稻的基因型和水稻是否存在隱性核雄性不育基因cyp704b2的方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種水稻隱性核雄性不育基因cyp704b2的分子標(biāo)記，其通過核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物擴(kuò)增得到。

本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記在鑒定水稻隱性核雄性不育基因cyp704b2基因型中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了用于檢測(cè)水稻隱性核雄性不育基因cyp704b2的特異性引物組合，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。

其中，SEQ ID NO.1所示的正向引物M1907-F₁：TGTCGGGTTTGGGGTTGAGATAGGG，SEQ ID NO.2所示的正向引物M1907-F₂:GGGTTTGGGGTTGAGATCTAAGCT，和SEQ ID NO.3所示的反向引物M1907-R:AGCGTGACGATGATGTTGGCAGC。

本發(fā)明上述引物組合是針對(duì)野生型CYP704B2基因的編碼區(qū)第794位堿基后GGG被替換為T的突變?cè)O(shè)計(jì)、篩選后獲得。M1907-F₁和M1907-F₂的3’末端堿基分別為GGG和GCT，只能分別與野生型和突變型完全配對(duì)。此外，M1907-F₁的5’端增加了不完全配對(duì)序列TGTC用以引入擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，M1907-F₁和M1907-F₂的3’端第四個(gè)堿基均引入C→A的突變用以擴(kuò)大M1907-F₁和M1907-F₂對(duì)目標(biāo)序列識(shí)別能力的差異。M1907-R為公共反向引物，可以分別與M1907-F₁和M1907-F₂配對(duì)擴(kuò)增出96bp和90bp的PCR產(chǎn)物。

本發(fā)明提供了前述特異性引物組合在鑒定水稻隱性核雄性不育基因cyp704b2基因型中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了前述特異性引物組合在鑒定特定水稻種質(zhì)資源中是否存在隱性核雄性不育基因cyp704b2的方法。

本發(fā)明提供了前述特異性引物組合在水稻種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了檢測(cè)水稻隱性核雄性不育基因cyp704b2基因型及其是否存在于某一特定水稻種質(zhì)資源中的方法，首先對(duì)待測(cè)樣本提取基因組DNA后，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物、SEQ ID NO.3所示的反向引物進(jìn)行PCR，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小進(jìn)行分析。

若擴(kuò)增產(chǎn)物只出現(xiàn)90bp條帶，則表明待測(cè)樣品具有純合突變基因型cyp704b2；若只出現(xiàn)96bp條帶，則表明待測(cè)樣品為純合野生基因型CYP704B2；若同時(shí)出現(xiàn)90bp和96bp條帶，則表明待測(cè)樣品為雜合基因型。

90bp條帶的參考序列如SEQ ID NO.4所示，96bp條帶的參考序列如SEQ ID NO.5所示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，由于水稻品種的差異，設(shè)計(jì)引物時(shí)預(yù)測(cè)的PCR產(chǎn)物序列只能作為參考序列，而從不同品種中擴(kuò)增出來的產(chǎn)物的序列可能和參考序列完全一致，也可能與參考序列有部分堿基差異，但這種差異通常不會(huì)影響標(biāo)記的使用。

進(jìn)一步地，PCR的反應(yīng)體系為：Biomiga的2×Bench Top^TM Taq master mix 4μL，10μM的兩個(gè)正向、一個(gè)反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 50ng，補(bǔ)ddH₂O至10μL；

PCR反應(yīng)條件為：94℃，4min；94℃、20s，63℃、20s，72℃、20s，共35個(gè)循環(huán)，接著72℃、5min，最后16℃，1min。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，是通過PAGE膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度進(jìn)行判斷，PAGE膠電泳條件為：6％PAGE膠，U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，電泳1h。

含有本發(fā)明所述的特異性引物組合的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明提供了上述含有SEQ ID NO.1-3所示引物的試劑盒在水稻隱性核雄性不育基因cyp704b2選育中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述含有SEQ ID NO.1-3所示引物的試劑盒在水稻種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明基于野生型CYP704B2基因編碼區(qū)第794位堿基后GGG被替換為T的突變，設(shè)計(jì)并開發(fā)了一種擴(kuò)增片段短，特異性強(qiáng)的三引物分子標(biāo)記。利用該標(biāo)記，只需通過簡(jiǎn)單的PCR即可完成對(duì)水稻隱性核雄性不育基因cyp704b2的基因分型，預(yù)測(cè)水稻是否不育。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、分型快速、結(jié)果準(zhǔn)確、成本低廉等優(yōu)勢(shì)，能提高性狀選擇效率，滿足大規(guī)模分子標(biāo)記輔助選擇的需求。

附圖說明

圖1是本發(fā)明分子標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)示意圖。包括一條公共的反向引物M1907-R，兩條正向引物M1907-F₁和M1907-F₂。其中，M1907-R可以分別與CYP704B2(野生型)和cyp704b2(突變型)基因序列完全匹配；M1907-F₁只能與CYP704B2基因序列完全匹配，M1907-F₂只能與cyp704b2基因序列完全匹配。M1907-F₁的5'端第一個(gè)堿基引入G→T的突變，3'端第四個(gè)堿基引入C→A的突變；M1907-F₂的3'端第四個(gè)堿基引入C→A的突變。GGG突變位點(diǎn)用方框標(biāo)出，引入的堿基突變用下劃線標(biāo)出。

圖2是用本發(fā)明分子標(biāo)記檢測(cè)12個(gè)水稻品種/品系的PAGE膠電泳圖。泳道1-12分別為1907、五豐B、華占、中香黃占、R51084、青豐1號(hào)B、南H197、福豐恢1658、S-127、9311、岳4B、H28B。PCR產(chǎn)物大小標(biāo)記在膠圖右側(cè)。

圖3是用本發(fā)明分子標(biāo)記檢測(cè)F₁和F₂群體PAGE膠電泳圖。泳道1-18為1907純合株/1907雜合株雜交F₁群體不同單株，19-30為1907/9311雜交F₂分離群體不同單株，31為1907，32為9311。PCR產(chǎn)物大小標(biāo)記在膠圖右側(cè)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；若未特別指明，實(shí)施例中所用試劑均為市售。

實(shí)施例1水稻隱性核不育基因cyp704b2的引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增片段分析

1、引物設(shè)計(jì)

參考野生型CYP704B2和突變型cyp704b2基因序列的差異設(shè)計(jì)了能夠鑒別隱性核雄性不育表型和正常育性表型的三引物組合：

M1907-F₁:TGTCGGGTTTGGGGTTGAGATAGGG(SEQ ID NO.1)，M1907-F₂:GGGTTTGGGGTTGAGATCTAAGCT(SEQ ID NO.2)，和M1907-R:AGCGTGACGATGATGTTGGCAGC(SEQ ID NO.3)(見圖1)。

2、擴(kuò)增片段分析

用上述引物組合對(duì)水稻隱性核雄性不育基因cyp704b2進(jìn)行擴(kuò)增，不育材料只能擴(kuò)出一條90bp的條帶，可育材料能擴(kuò)出一條96bp條帶，或者同時(shí)擴(kuò)出一條96bp和一條90bp條帶。90bp和96bp條帶的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

實(shí)施例2用本發(fā)明分子標(biāo)記鑒定水稻品種/品系的cyp704b2基因型

1、實(shí)驗(yàn)材料

1907、五豐B、華占、中香黃占、R51084、青豐1號(hào)B、南H197、福豐恢1658、S-127、9311、岳4B、H28B

2、水稻基因組DNA的提取

采用CTAB法提取水稻基因組DNA，具體步驟如下：在苗期取3cm長(zhǎng)的水稻葉片，在800μL抽提緩沖液[1.5％(w/v)CTAB，1.05mol/L NaCl，75mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，15mmol/L EDTA(pH 8.0)]中磨碎，收集到一個(gè)1.5mL離心管中。65℃水浴30min，間或顛倒混勻。加入800μL氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)，顛倒混勻15min。12000r/min室溫離心10min。吸上清450μL，轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5mL離心管中，加入2倍體積95％乙醇，混勻后-20℃沉淀30min。12000r/min離心15min。倒掉95％乙醇，用75％乙醇洗沉淀。倒掉75％乙醇，干燥后加100μL滅菌ddH₂O溶解DNA。

3、PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

利用實(shí)施例1篩選得到的特異性引物組合(M1907-F₁，M1907-F₂，M1907-R)對(duì)本實(shí)施例所述12個(gè)水稻品種/品系的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)體系為：Biomiga的2×Bench Top^TM Taq master mix 4μL，10μM的兩個(gè)正向、一個(gè)反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 50ng，補(bǔ)ddH₂O至10μL；

PCR反應(yīng)條件為：94℃，4min；94℃，20s，63℃，20s，72℃，20s，共35個(gè)循環(huán)；72℃，5min，16℃，1min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6％PAGE膠電泳檢測(cè)，電泳條件為：U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，電泳1h。電泳完成后用0.1％AgNO₃染色，觀片燈上觀察拍照。

4、結(jié)果與分析

用本發(fā)明實(shí)施例1的分子標(biāo)記的引物組合擴(kuò)增這12個(gè)品種/品系，發(fā)現(xiàn)只有1907擴(kuò)增出了一條90bp的帶，而所有其它品種/品系都只擴(kuò)增出了一條96bp的帶(見圖2)。這一結(jié)果表明自然條件下不存在與隱性核雄性不育系1907存在相同變異的水稻種質(zhì)，同時(shí)也印證了本發(fā)明分子標(biāo)記在鑒定水稻隱性核雄性不育基因cyp704b2基因型時(shí)的準(zhǔn)確性和可靠性。

實(shí)施例3用本發(fā)明分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇育種

1、實(shí)驗(yàn)材料

1907純合株/1907雜合株雜交F₁代18個(gè)單株，1907/9311雜交F₂代分離群體12個(gè)單株。

2、水稻基因組DNA的提取

參見實(shí)施例2。

3、PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

參加實(shí)施例2。

4、結(jié)果與分析

用本發(fā)明實(shí)施例1的分子標(biāo)記(特異性引物組合M1907-F₁、M1907-F₂和M1907-R通過PCR擴(kuò)增得到)在苗期檢測(cè)本實(shí)施例中30個(gè)單株的cyp704b2基因型，結(jié)果見圖3。1907純合株/1907雜合株雜交F₁代18個(gè)單株中有6個(gè)單株只擴(kuò)增出了90bp條帶，有12個(gè)單株同時(shí)擴(kuò)增出了90bp和96bp條帶；1907/9311雜交F₂代分離群體12個(gè)單株有2個(gè)只擴(kuò)增出了90bp條帶，1個(gè)只擴(kuò)增出了96bp條帶，9個(gè)同時(shí)擴(kuò)增出了90bp和96bp條帶。收種后對(duì)所述全部單株的育性進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)只擴(kuò)出90bp條帶的單株均為雄性不育，而剩余能擴(kuò)增出96bp條帶的單株雄性育性均正常。說明本發(fā)明分子標(biāo)記能有效跟蹤隱性核不育基因cyp704b2，并能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)水稻雄性育性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 海南波蓮水稻基因科技有限公司

<120> 一種水稻隱性核雄性不育基因cyp704b2的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130> KHP171110231.7TQ

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtcgggttt ggggttgaga taggg 25

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggtttgggg ttgagatcta agct 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcgtgacga tgatgttggc agc 23

<210> 4

<211> 90

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 4

gggtttgggg ttgagatcta agctgtcacc tgatctcccg gagaacagct ttgcccaggc 60

attcgacgct gccaacatca tcgtcacgct 90

<210> 5

<211> 96

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 5

tgtcgggttt ggggttgaga tagggacgct gtcacctgat ctcccggaga acagctttgc 60

ccaggcattc gacgctgcca acatcatcgt cacgct 96