本發(fā)明涉及動物衛(wèi)生和食品檢驗技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測腸出血性大腸桿菌O157:H7的LAMP檢測用引物組及檢測方法。

背景技術(shù)：
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腸出血性大腸桿菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O157:H7于1982年在美國被首次發(fā)現(xiàn)，EHEC O157:H7是腸出血性大腸桿菌的主要血清型，世界衛(wèi)生組織于1997年將其列為新的食源性致病菌。EHEC O157:H7主要通過消化道傳播，臨床可引起出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥、血栓性血小板減少性紫癜等疾病。EHEC O157:H7引起的散發(fā)和暴發(fā)流行性病例在世界范圍內(nèi)不斷發(fā)生，1996年在日本大阪地區(qū)發(fā)生流行，患者逾萬，死亡11人，1999～2000年在中國江蘇、安徽等地發(fā)生了多起食源性感染EHEC O157:H7事件，導(dǎo)致l77人死亡，2006年9月美國又爆發(fā)了毒菠菜事件，原因是人食用了被EHEC O157:H7感染了的生菠菜而被感染。EHEC O157:H7的感染因具有暴發(fā)流行趨勢、強烈的致病性與致死性以及抗生素治療可能會加劇病情等特點，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。

對于突發(fā)性傳染病，快速檢測和鑒定病原體是控制疫情的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的EHEC O157:H7的實驗室檢測方法主要包括選擇性培養(yǎng)、生化鑒定和免疫、毒素的細胞學(xué)試驗等，都存在費時費力、檢測時限長等弊端，而快速檢測方法常見的有基于分子水平的PCR法、多重PCR法、熒光PCR法及基因芯片技術(shù)，這些方法自動化程度高，在一定程度上彌補了傳統(tǒng)方法的不足。但除熒光PCR法外，擴增產(chǎn)物都需要開蓋暴露，容易導(dǎo)致假陽性，但對檢測人員要求高，且設(shè)備昂貴，不利于基層單位推廣應(yīng)用。因此，研究開發(fā)一種檢測快速、操作簡便、特異性高、靈敏度好、成本低廉、適于基層推廣的檢測方法，對EHEC O157:H7疫情的監(jiān)控將起到積極作用。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等人在2000年發(fā)明的一種新的恒溫核酸擴增技術(shù)。傳統(tǒng)的PCR技術(shù)離不開反復(fù)升降溫這個耗時耗能的過程，且反應(yīng)程序設(shè)定也較繁瑣。相比之下，LAMP技術(shù)克服了這些問題。根據(jù)LAMP技術(shù)的原理，它可實現(xiàn)在恒溫條件下(一般在60～65℃)快速連續(xù)擴增，實現(xiàn)了實驗過程快速、簡便，儀器設(shè)備簡單、便攜，檢測結(jié)果特異性強、靈敏度高的優(yōu)點。LAMP擴增結(jié)果觀察方式多，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果、肉眼觀察顏色變化及試紙條技術(shù)，也可使用實時熒光法和實時濁度法，通過實時熒光PCR儀或?qū)崟r濁度儀對擴增結(jié)果進行實時觀察。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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鑒于此，有必要設(shè)計一種檢測快速、操作簡便、特異性高、靈敏度好、成本低廉的用于檢測腸出血性大腸桿菌O157:H7的LAMP檢測用引物組，及利用該引物組檢測腸出血性大腸桿菌O157:H7的LAMP檢測方法。

一種用于檢測腸出血性大腸桿菌O157:H7的LAMP檢測用引物組，由內(nèi)引物對FIP/BIP和外引物對F3/B3組成，F(xiàn)IP、BIP、F3、B3具體如下：

一種利用前述引物組檢測腸出血性大腸桿菌O157:H7的LAMP檢測方法，包括以下步驟：

步驟1、提取待測樣品DNA；

步驟2、配制LAMP檢測反應(yīng)體系，反應(yīng)體系包括引物：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4；

步驟3、以步驟1中提取的DNA為模版進行LAMP擴增反應(yīng)，用實時濁度法鑒定擴增結(jié)果。

優(yōu)選的，LAMP檢測反應(yīng)體系具體為：2×反應(yīng)液RM 12～13uL，F(xiàn)IP、BIP各3.7～4.3uL，F(xiàn)3、B3各0.4～0.6uL，Bst DNA聚合酶0.9～1.2uL，待測樣品DNA1.8～2.2uL，補超純水至25uL。

優(yōu)選的，F(xiàn)IP、BIP的濃度是40umol/L，F(xiàn)3、B3的濃度是5umol/L。

優(yōu)選的，LAMP擴增反應(yīng)的反應(yīng)前的預(yù)熱溫度50.0℃，LAMP擴增反應(yīng)的反應(yīng)溫度為64.0℃且進行40min，LAMP擴增反應(yīng)的反應(yīng)后的酶失活溫度95℃進行2min。

上述的LAMP檢測方法中，檢測結(jié)果通過實時濁度儀實時測量濁度值來判斷核酸有無擴增。

本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，根據(jù)EHEC O157:H7抗原基因rfbE的序列，設(shè)計4條特異性LAMP引物，用來建立EHEC O157:H7LAMP檢測方法，結(jié)果表明，建立的LAMP檢測方法對EHEC O157:H7的檢測特異性良好，且方法的靈敏度高。與現(xiàn)有技術(shù)相比，使用本發(fā)明的引物組檢測樣品中的EHEC O157:H7，不受培養(yǎng)條件的限制，可在50min內(nèi)完成核酸的檢測；本發(fā)明對EHEC O157:H7定性檢測靈敏度可達到3.45×10⁴CFU/mL，優(yōu)于一般PCR檢測方法，其檢測靈敏度是普通PCR的10倍。

附圖說明：

附圖1是LAMP引物篩選試驗圖，NO.1-5分別為空白對照、rfbE-1引物組、rfbE-2引物組、rfbE-3引物組和rfbE-4引物組。

附圖2是60℃時溫度對LAMP反應(yīng)的影響試驗圖。

附圖3是61℃時溫度對LAMP反應(yīng)的影響試驗圖。

附圖4是62℃時溫度對LAMP反應(yīng)的影響試驗圖。

附圖5是63℃時溫度對LAMP反應(yīng)的影響試驗圖。

附圖6是64℃時溫度對LAMP反應(yīng)的影響試驗圖。

附圖7是65℃時溫度對LAMP反應(yīng)的影響試驗圖。

附圖8是30min時時間對LAMP反應(yīng)的影響試驗圖。

附圖9是40min時時間對LAMP反應(yīng)的影響試驗圖。

附圖10是50min時時間對LAMP反應(yīng)的影響試驗圖。

附圖11是60min時時間對LAMP反應(yīng)的影響試驗圖。

附圖12是引物特異性鑒定試驗圖，NO.2-8依次為EHEC O157:H7、致病性大腸埃希氏菌、致瀉性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、單增李斯特菌、痢疾志賀菌、金黃色葡萄球菌擴增曲線；Left反應(yīng)槽的NO.1和Right反應(yīng)槽的NO.9均為空白對照。

附圖13是是引物特異性鑒定試驗圖，NO.10-16依次為宋氏志賀菌、鮑氏志賀菌、阪崎桿菌、甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌擴增曲線；Left反應(yīng)槽的NO.1和Right反應(yīng)槽的NO.9均為空白對照。

附圖14是LAMP反應(yīng)靈敏度試驗圖，NO.1為空白對照，NO.2-8分別是菌液濃度為3.45×10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、10^-1CFU/ml。

附圖15是普通PCR反應(yīng)靈敏度試驗圖，M為DL1000Marker，N為空白對照，泳道1-7分別是菌液濃度為3.45×10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、10^-1CFU/ml。

具體實施方式：

以下敘述中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

一、引物設(shè)計

按照LAMP引物設(shè)計原則，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的EHEC O157:H7抗原基因rfbE基因組序列，進行多序列比對，尋找一段高度保守區(qū)作為擴增對象，然后通過分子生物學(xué)軟件LAMPD Designer5設(shè)計4組引物，采用HPLC純化方式。合成后的引物用超純水稀釋成100pmol/pL溶液，-20℃保存?zhèn)溆?。各引物序列見?。

表1 EHEC O157:H7的LAMP檢測用引物

二、檢測標(biāo)準(zhǔn)方法的建立

細菌基因組DNA快速抽提試劑盒為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品，LAMP擴增體系的2×反應(yīng)液RM、Bst DNA聚合酶為榮研生物科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

日本榮研LT-16alpha恒溫擴增基因檢測系統(tǒng)，ABI Veriti 96Well Thermal Cycler核酸擴增儀、Biorad GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)。

EHEC O157:H7實驗用標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國工業(yè)微生物保存中心和北京路橋技術(shù)股份有限公司(見表2)。

表2實驗用菌種名稱及編號

1、樣品DNA的提取

樣品為EHEC O157:H7、致病性大腸埃希氏菌、致瀉性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、單增李斯特菌、痢疾志賀菌、金黃色葡萄球菌、宋氏志賀菌、鮑氏志賀菌、阪崎桿菌、甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌14株標(biāo)準(zhǔn)菌株的液體純培養(yǎng)物。

DNA的提取方法按照DNA提取試劑盒說明書中關(guān)于細菌DNA提取要求進行，具體步驟如下：

(1)吸取1mL過夜培養(yǎng)的細菌菌液，加入1.5mL離心管中，室溫8000rpm離心1min，棄上清，收集菌體。加入400uL Buffer Digestion，震蕩混勻。65℃水浴1h至細胞完全裂解。

(2)加入200uL Buffer PB，充分顛倒混勻，-20℃冰箱放置5min。

(3)室溫10000rpm離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中。

(4)加入等體積的異丙醇，顛倒5～8次使之充分混勻，室溫靜置2-3min。室溫10000rpm離心5min，棄上清。

(5)加入1mL75％乙醇，顛倒漂洗1～3min，10000rpm離心2min，棄上清。

(6)重復(fù)步驟5一次。

(7)開蓋室溫倒置5～10min至殘留的乙醇完全揮發(fā)。

(8)得到的DNA用50～100uLTE Buffer溶解。

獲得的DNA模板的260/280比值均在1.8-2.0之間,濃度在200-500ng/uL。提取的DNA質(zhì)量和濃度較高，適合后續(xù)的擴增反應(yīng)。

2、LAMP反應(yīng)體系

反應(yīng)體系為：2×反應(yīng)液RM 12.5uL，內(nèi)引物FIP、BIP各4uL，外引物F3、B3各0.5uL，Bst DNA聚合酶1uL，DNA模版2.O uL，補水至25uL。

內(nèi)引物FIP、BIP的濃度是40umol/L，外引物F3、B3的濃度是5umol/L。

DNA模版由各細菌的培養(yǎng)物提取而得。

3、最優(yōu)引物的篩選

將表1的4組引物(rfbE-1、rfbE-2、rfbE-3、rfbE-4)以EHEC O157:H7 DNA為模板，在榮研LT-16alpha恒溫擴增基因檢測系統(tǒng)上同時進行LAMP反應(yīng)，并設(shè)空白對照，如附圖1所示。

擴增反應(yīng)的程序為：反應(yīng)溫度為63℃，反應(yīng)時間為50min，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。結(jié)果顯示，引物組rfbE-3擴增開始時間(Tt值)最早(見附圖1)，且曲線峰值高度(Df)值較高，引物組rfbE-3擴增開始時間(Tt值)和曲線峰值高度(Df值)具體數(shù)值見表3。

表3 LAMP引物篩選試驗Tt值和Df值

4、LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

4.1、反應(yīng)溫度的優(yōu)化：以上述篩選的最優(yōu)引物組rfbE-3作為擴增引物，以EHEC O157:H7 DNA為模板，95℃酶失活2min，做6組對照，分別將反應(yīng)混合物放在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃反應(yīng)條件下進行LAMP反應(yīng)，并設(shè)空白對照，附圖2～7分別為60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃擴增曲線圖，Left反應(yīng)槽的NO.1和Right反應(yīng)槽的NO.9均為空白對照，反應(yīng)時間為50min，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)溫度為62℃時,擴增效果最好，各反應(yīng)組擴增開始時間(Tt值)和曲線峰值高度(Df值)具體數(shù)值見表4。因此，引物組rfbE-3擴增反應(yīng)的最佳溫度為62℃。

表4 LAMP反應(yīng)溫度優(yōu)化試驗Tt值和Df值

4.2、反應(yīng)時間的優(yōu)化：以上篩選的最優(yōu)引物組rfbE-3作為擴增引物，以EHEC O157:H7 DNA為模板，以上述最優(yōu)62℃為反應(yīng)溫度，95℃酶失活2min，做4組對照，分別將反應(yīng)混合物放在30min、40min、50min、60min反應(yīng)條件下進行LAMP反應(yīng)，并設(shè)空白對照，附圖8～11分別為30min、40min、50min、60min擴增曲線圖，Left反應(yīng)槽的NO.1和Right反應(yīng)槽的NO.9均為空白對照，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)時間為40℃時，擴增效果最好，用時最短，各反應(yīng)組擴增開始時間(Tt值)和曲線峰值高度(Df值)具體數(shù)值見表5。因此，引物組rfbE-3擴增反應(yīng)的最佳溫度為40min。

表5 LAMP反應(yīng)時間優(yōu)化試驗Tt值和Df值

通過反復(fù)實驗驗證，對EHEC O157:H7的LAMP反應(yīng)條件進行調(diào)整，調(diào)整優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)溫度為64℃，反應(yīng)時間為40min，95℃酶失活2min。

三、引物的特異性鑒定:

為了驗證設(shè)計引物對EHEC O157:H7檢測的特異性，用第二部分(檢測標(biāo)準(zhǔn)方法的建立)所述反應(yīng)體系和優(yōu)化后條件，以13種非EHEC O157:H7細菌和一株陽性對照EHEC O157:H7細菌培養(yǎng)物提取的DNA為模板進行LAMP擴增檢測，并設(shè)置空白對照，NO.2-8(a)依次為EHEC O157:H7、致病性大腸埃希氏菌、致瀉性大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、單增李斯特菌、痢疾志賀菌、金黃色葡萄球菌擴增曲線圖，NO.10-16(b)依次為宋氏志賀菌、鮑氏志賀菌、阪崎桿菌、甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌擴增曲線圖，Left反應(yīng)槽的NO.1和Right反應(yīng)槽的NO.9均為空白對照，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。

檢測結(jié)果見附圖12～13，可以看出，只有以EHEC O157:H7細菌純培養(yǎng)物提取的DNA模板有擴增曲線出現(xiàn)，其他反應(yīng)孔均無擴增曲線出現(xiàn)，其它樣品為陰性。結(jié)果表明，引物組rfbE-3對EHEC O157:H7細菌具有專一性，可用于對EHEC O157:H7細菌的特異性檢測。

四、靈敏度實驗：

1、原菌液濃度的定量

經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的EHEC O157:H7菌液，用生理鹽水10倍系列稀釋，平板菌落計數(shù)，推算原菌液濃度。通過平板菌落計數(shù)法測得EHEC O157:H7原菌液濃度為3.45×107cfu/ml，菌落計數(shù)結(jié)果見表6。

表6腸出血性大腸桿菌O157：H7平板計數(shù)

2、模板的稀釋以及LAMP反應(yīng)：:將上一步驟中(原菌液濃度的定量)測得的原菌液依次做10倍梯度稀釋，稀釋度為10-1-10-7，分別標(biāo)記為1號、2號、3號、4號、5號、6號、7號，然后每個稀釋度取2uL作為模板,用第二部分(檢測標(biāo)準(zhǔn)方法的建立)所述反應(yīng)體系和條件進行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后讀取數(shù)值。同時，也使用傳統(tǒng)的PCR方法進行擴增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，進行35個循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物，反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物長度為196bp。

3、檢測結(jié)果見附圖14和附圖15，圖14中NO.1為空白對照，NO.2-8分別是菌液濃度為3.45×106、105、104、103、102、10、10-1CFU/ml；圖15中M為DL1000Marker，N為空白對照，泳道1-7分別是菌液濃度為3.45×106、105、104、103、102、10、10-1CFU/ml。結(jié)果表明：傳統(tǒng)的PCR擴增的敏感性測定結(jié)果1、2號泳道有特異性條帶，其它泳道無特異性擴增，即PCR的擴增的最低靈敏度為3.45×105CFU/ml。LAMP擴增反應(yīng)結(jié)果見附圖14，NO.1-3號反應(yīng)孔有擴增曲線出線，及LAMP擴增最低靈敏度為3.45×104CFU/ml，與普通PCR相比，靈敏度提高了10倍。

通過以上實驗最終確定了本發(fā)明的一種用于檢測腸出血性大腸桿菌O157:H7的LAMP檢測用引物組，由內(nèi)引物對FIP/BIP和外引物對F3/B3組成，F(xiàn)IP、BIP、F3、B3具體如下：

一種利用前述引物組檢測腸出血性大腸桿菌O157:H7的LAMP檢測方法，包括以下步驟：

步驟1、提取待測樣品DNA；

步驟2、配制LAMP檢測反應(yīng)體系，反應(yīng)體系包括引物：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，2×反應(yīng)液RM 12.5uL，F(xiàn)IP、BIP的濃度是40umol/L且各4uL，F(xiàn)3、B3的濃度是5umol/L且各0.5uL，Bst DNA聚合酶1.0uL，待測樣品DNA2.0uL，補超純水至25uL；

步驟3、以步驟1中提取的DNA為模版進行LAMP擴增反應(yīng)，LAMP擴增反應(yīng)的反應(yīng)前的預(yù)熱溫度50.0℃，LAMP擴增反應(yīng)的反應(yīng)溫度為64.0℃且進行40min，LAMP擴增反應(yīng)的反應(yīng)后的酶失活溫度95℃進行2min，用實時濁度法鑒定擴增結(jié)果。

序列表

<110>寧夏出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術(shù)中心

<120>用于檢測腸出血性大腸桿菌O157:H7的LAMP檢測用引物組及檢測方法

<170>PatentIn version 3.5

<160>4

<210>1

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

TGCCTATGTACAGCTAATCCTTGGTTTTATGACAAAACACTTTATGACCG 50

<210>2

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ATTGGCATGACGTTATAGGCTACTTTTGCTTGTTCTAACTGGGCTAA 47

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

GTGGAATGGTTGTCACGA 18

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

AGCAATTTCACGTTTTCGT 19