特異工程噬菌體檢測(cè)大腸桿菌o157的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)大腸桿菌0157的特異工程噬菌體及檢測(cè)大腸桿菌0157的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌0157是腸出血性大腸桿菌最主要的一種血清型。大腸桿菌0157進(jìn)入腸道大量繁殖后產(chǎn)生志賀樣毒素，損傷腸道表皮毛細(xì)血管，進(jìn)而引起纖維蛋白在多種器官內(nèi)沉著，引起出血性腸炎，最終可能發(fā)展為血小板減少和急性腎衰竭。大腸桿菌是重要的食源性病原菌，其中大腸桿菌0157是致病性最強(qiáng)的一種血清型。全世界每年都有因食用被大腸桿菌0157污染的食物而致病甚至死亡的報(bào)道，對(duì)人們的生命和健康造成極大的威脅。人對(duì)大腸桿菌0157的感染劑量很低，只需要10個(gè)活菌就可致病，對(duì)于免疫力低下的老人和小孩甚至更低。
[0003]噬菌體是一種細(xì)菌病毒，是世界上數(shù)量最龐大的非細(xì)胞生命，有細(xì)菌的地方就會(huì)有相應(yīng)噬菌體存在。噬菌體鑒定細(xì)菌的傳統(tǒng)方法就是噬菌體分型。噬菌體與宿主之間特異性的相互作用是噬菌體分型的基礎(chǔ)，能用不同類(lèi)型的噬菌體識(shí)別未知的細(xì)菌。在一個(gè)典型的噬菌體分型測(cè)試中，各種類(lèi)型宿主譜已知的噬菌體分別用來(lái)感染細(xì)菌樣品。如果這種細(xì)菌在噬菌體的宿主譜范圍內(nèi)，細(xì)菌將會(huì)被噬菌體侵染，在雙層瓊脂培養(yǎng)板中可觀察到由細(xì)胞裂解形成的噬菌斑。根據(jù)哪些種類(lèi)的噬菌體能成功形成噬菌斑，可對(duì)樣品中的菌株進(jìn)行分類(lèi)。
[0004]宿主菌破裂后釋放出子代噬菌體，可以用噬菌體數(shù)量的增加作為感染事件發(fā)生的指示物。因此在樣品中加入靶細(xì)菌特異性的噬菌體，再通過(guò)檢測(cè)噬菌體數(shù)量是否增加來(lái)判斷樣品中是否存在靶細(xì)菌。在開(kāi)始檢測(cè)時(shí)，先預(yù)計(jì)需要檢測(cè)哪種靶細(xì)菌，再加入它專(zhuān)一性的噬菌體。在宿主細(xì)胞裂解釋放子代噬菌體之前，加入病毒滅活劑以除去樣品混合物中的游離噬菌體。那些成功侵染宿主菌將其基因組注入宿主細(xì)胞的噬菌體因在細(xì)胞內(nèi)而被保護(hù)起來(lái)。中和混合物中的病毒滅活劑，并加入噬菌體的宿主細(xì)胞(輔助細(xì)胞)。孵育后，噬菌體在最初感染的靶細(xì)胞中復(fù)制，隨后細(xì)胞裂解釋放出子代噬菌體，子代噬菌體再次感染后加入的輔助細(xì)胞，在雙層瓊脂培養(yǎng)皿中形成噬菌斑。樣品中每個(gè)靶細(xì)菌都能形成一個(gè)噬菌斑。傳統(tǒng)的噬菌體分型法需要樣品中有足夠多數(shù)量的靶細(xì)菌以形成菌苔，而新型的噬菌體分型法只需要樣品中有少量的靶細(xì)菌就能進(jìn)行檢測(cè)，加入輔助細(xì)胞二次感染將初始的感染信號(hào)放大。以噬菌體擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的診斷試劑盒已經(jīng)開(kāi)始商業(yè)化使用，如結(jié)核分枝桿菌的抗藥性檢測(cè)，以及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)大腸桿菌0157的特異工程噬菌體及檢測(cè)大腸桿菌0157的方法。
[0006]一種用于同源重組噬菌體JLl的質(zhì)粒，它是由下述方法制備的: 1)用引物:
Pl:gcggggttaaagcggaaagtcaatP2:tcaacgcggtcaatagcac
以噬菌體JLl基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得其堿基序列如序列表SEQUENCE N0.1所不的■菌體幾I衣殼蛋白基因；
2)將衣殼蛋白基因插入PMD18-T載體中；
3)將插入了衣殼蛋白基因的PMD18-T載體和序列表SEQUENCEN0.2所示的熒光蛋白基因，用BssSI酶切后，連接，得PMD18-T-衣殼蛋白基因-綠色熒光蛋白基因-衣殼蛋白基因質(zhì)粒。
[0007]一種用于檢測(cè)大腸桿菌0157的特異工程噬菌體，它是用下述方法制備的:
將一種用于同源重組噬菌體JLl的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌0157感受態(tài)細(xì)胞中；接種到液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入噬菌體幾1，孵育10 min后，用雙層瓊脂法鋪板，篩選同源重組成功的噬菌體。
[0008]特異工程噬菌體檢測(cè)大腸桿菌0157的方法，將待檢樣品接種到液體LB培養(yǎng)基中，37°C恒溫水浴搖床200 rpm振蕩培養(yǎng)，直到0D600為0.2 ;加入一種用于檢測(cè)大腸桿菌0157的特異工程噬菌體懸浮液，浸染，熒光顯微鏡觀察樣品中是否有熒光出現(xiàn)。
[0009]本發(fā)明提供了特異工程噬菌體檢測(cè)大腸桿菌0157的方法，采用一種用于同源重組噬菌體幾I的質(zhì)粒，該質(zhì)粒是由下述方法制備的:以噬菌體幾I基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得其堿基序列如序列表I所示的噬菌體JLl衣殼蛋白基因；將衣殼蛋白基因插入pMD18-T載體中；將插入了衣殼蛋白基因的pMD18-T載體和序列表2所示的熒光蛋白基因，用BssSI酶切后，連接，得PMD18-T-衣殼蛋白基因-綠色熒光蛋白基因-衣殼蛋白基因質(zhì)粒。同源重組噬菌體幾1，用篩選同源重組成功的噬菌體，檢出大腸桿菌0157特異性強(qiáng)，檢出限可達(dá)14 CFU/ mLo
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為衣殼蛋白基因擴(kuò)增產(chǎn)物，其中:1，2為753bp噬菌體衣殼蛋白基因擴(kuò)增產(chǎn)物，M 為 DNA marker ；
圖2為pMD18-T-衣殼蛋白基因-綠色熒光蛋白基因-衣殼蛋白基因質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為同源重組后菌落PCR驗(yàn)證；M:DNA Marker ;1_3是以M13為引物從pMD18_T質(zhì)粒中擴(kuò)增的片段
圖4為重組成功后噬菌體PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖5為工程噬菌體檢測(cè)大腸桿菌0157的熒光顯微鏡照片；圖中綠色桿狀物體為被噬菌體侵染后的大腸桿菌0157發(fā)出的綠色焚光。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1大腸桿菌0157噬菌體JLl衣殼蛋白基因的擴(kuò)增
針對(duì)大腸桿菌0157噬菌體JLl衣殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物并對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其上游引物序列為:5’ - gcggggttaaagcggaaagtcaat ;下游引物序列為:5’ -tcaacgcggtcaatagcac。以■菌體JLl基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段全長(zhǎng)753bp，將該P(yáng)CR產(chǎn)物純化回收后連接到pMD18-T載體。該衣殼蛋白基因序列含有單一 BssSI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，其堿基序列如序列表SEQUENCE N0.1所示。
[0012]實(shí)施例2增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的擴(kuò)增
根據(jù)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(EGFP)序列設(shè)計(jì)如下引物，上游引物為:5’ -CACGAGatggtgagcagcaagggcgaggag，下游引物為 5’ -ttacttgtacagctcgtccatCTCGTG，其中上游引物的5’端和下游引物的3’端含有BssSI酶切位點(diǎn)。以含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pEGFP-ΝΙ為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增序列如序列表SEQUENCE N0.2所示。
[0013]實(shí)施例3將EGFP基因插入到含有噬菌體衣殼蛋白基因的pMD18-T載體上，構(gòu)建同源重組質(zhì)粒
將EGFP基因插入到含有噬菌體衣殼蛋白基因的pMD18-T載體上，構(gòu)建同源重組質(zhì)粒。
[0014]首先用限制性內(nèi)切酶BssSI對(duì)I中構(gòu)建的含有噬菌體衣殼蛋白基因的PMD18-T載體進(jìn)行酶切，然后將2中擴(kuò)增序列連接到酶切后的載體上。得到噬菌體衣殼蛋白基因-綠色熒光蛋白基因-噬菌體衣殼蛋白基因，構(gòu)建用于同源重組的質(zhì)粒(PMD18-T-衣殼蛋白基因-綠色熒光蛋白基因-衣殼蛋白基因質(zhì)粒)。
[0015]實(shí)施例4用于同源重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌0157感受態(tài)細(xì)胞用上述同源重組質(zhì)粒，對(duì)大腸桿菌0157感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其特征在于:
(I)將PMD18-T-衣殼蛋白基因-綠色熒光蛋白基因-衣殼蛋白基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌0157感受態(tài)細(xì)胞中。
[0016](2)將轉(zhuǎn)化成功的菌株加入甘油保菌液，_20°C低溫保存。
[0017]實(shí)施例5同源重組、篩選同源重組成功的噬菌體
將實(shí)施例4中轉(zhuǎn)化的大腸桿菌0157同噬菌體JLl同源重組
(I)將轉(zhuǎn)化有同源重組質(zhì)粒的大腸桿菌0157接種到液體LB培養(yǎng)基37 °C水浴搖床振蕩培養(yǎng)。
[0018](2)加入噬菌體幾1。37°C恒溫水浴箱中孵育10 min后，用雙層瓊脂法鋪板。
[0019](3)挑取培養(yǎng)皿中的噬菌斑，用噬菌體衣殼蛋白基因上游引物和下游引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選同源重組成功的噬菌體。
[0020]實(shí)施例6特異檢測(cè)大腸桿菌0157工程噬菌體檢測(cè)大腸桿菌0157
(I)將大腸桿菌0157接種到液體LB培養(yǎng)基中，37°C恒溫水浴搖床200 rpm振蕩培養(yǎng)，直到0D600約為0.2左右。
[0021](2)將菌液用生理鹽水10倍梯度稀釋?zhuān)咕芏葹?07、106、105、104、103、102、10、I CFU/ mL，用無(wú)菌的液體LB作為對(duì)照組，每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)平行。
[0022](3)取I mL實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組加入到1.5 mL的離心管中，再加入100 μ L噬菌體懸浮液，37°C恒溫水浴鍋中孵育10 min。離心完全棄上清，離心條件設(shè)定為轉(zhuǎn)速6000 rpm,溫度4°C，時(shí)間10 min。沉淀用100 yL生理鹽水重懸浮，37 °C恒溫培養(yǎng)箱中靜置10 min。
[0023](4)用熒光顯微鏡觀察各樣品中是否有熒光出現(xiàn)。
[0024]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示如圖5所示:
在實(shí)驗(yàn)組中有綠色大腸桿菌0157出現(xiàn)，表明該工程噬菌體已經(jīng)侵入到大腸桿菌0157中，并可以用熒光顯微鏡檢測(cè)得到，靈敏度實(shí)驗(yàn)表明，其靈敏度可達(dá)14 CFU/ mL。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于同源重組噬菌體幾I的質(zhì)粒，它是由下述方法制備的: 1)用引物:Pl:gcggggttaaagcggaaagtcaatP2:tcaacgcggtcaatagcac 以噬菌體JLl基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得其堿基序列如序列表I所示的噬菌體JLl衣殼蛋白基因； 2)將衣殼蛋白基因插入PMD18-T載體中； 3)將插入了衣殼蛋白基因的PMD18-T載體和序列表2所示的熒光蛋白基因，用BssSI酶切后，連接，得PMD18-T-衣殼蛋白基因-綠色熒光蛋白基因-衣殼蛋白基因質(zhì)粒。
2.一種用于檢測(cè)大腸桿菌0157的特異工程噬菌體，它是用下述方法制備的: 將權(quán)利要求1所述的一種用于同源重組噬菌體JLl的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌0157感受態(tài)細(xì)胞中；接種到液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入噬菌體幾1，孵育10 min后，用雙層瓊脂法鋪板，篩選同源重組成功的噬菌體。
3.特異工程噬菌體及檢測(cè)大腸桿菌0157的方法，將待檢樣品接種到液體LB培養(yǎng)基中，37°C恒溫水浴搖床200 rpm振蕩培養(yǎng)，直到0D600為0.2 ;加入權(quán)利要求2所述的一種用于檢測(cè)大腸桿菌0157的特異工程噬菌體懸浮液，浸染，熒光顯微鏡觀察樣品中是否有熒光出現(xiàn)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了特異工程噬菌體檢測(cè)大腸桿菌O157的方法，采用一種用于同源重組噬菌體JL1的質(zhì)粒，該質(zhì)粒是由下述方法制備的：以噬菌體JL1基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得其堿基序列如序列表1所示的噬菌體JL1衣殼蛋白基因；將衣殼蛋白基因插入pMD18-T載體中；將插入了衣殼蛋白基因的pMD18-T載體和序列表2所示的熒光蛋白基因，用BssSI酶切后，連接，得pMD18-T-衣殼蛋白基因-綠色熒光蛋白基因-衣殼蛋白基因質(zhì)粒。同源重組噬菌體JL1，用篩選同源重組成功的噬菌體，檢出大腸桿菌O157特異性強(qiáng)，檢出限可達(dá)104CFU/mL。
【IPC分類(lèi)】G01N21-64, C12N7-01, C12N15-70, C12N15-66
【公開(kāi)號(hào)】CN104561068
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410830594
【發(fā)明人】劉金華, 史艷宇, 薜力剛, 孟日增, 盧春梅, 劉韜
【申請(qǐng)人】吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月27日