培養(yǎng)用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種培養(yǎng)用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法，取新鮮發(fā)病的十字花科植物的根組織制成根腫菌菌液，在石英砂中播下十字花科種子，用MS基本培養(yǎng)液浸濕石英砂及種子，并在光照強(qiáng)度為100μmolphotons/(m2.s)、光照時(shí)間為16～18h、溫度為20～22℃、濕度為75%以上的條件下，培養(yǎng)至種子萌發(fā)，再生長(zhǎng)至長(zhǎng)出2片真葉的植株；在每株植株的根部施加根腫菌菌液進(jìn)行侵染，然后分階段將侵染的植株根系用生物顯微鏡觀察，直至侵染階段結(jié)束。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便且觀察結(jié)果清晰，占用空間小，試驗(yàn)成本低，具有操作安全、簡(jiǎn)單、重復(fù)性強(qiáng)，觀察方便、結(jié)果清晰的優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】培養(yǎng)用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物培養(yǎng)方法,尤其是一種培養(yǎng)被根腫菌侵染的十字花科植株的方法，以用于觀察根腫菌對(duì)十字花科植株侵染的過(guò)程，屬于植物病理學(xué)研究【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌ora brassicae Woron.)侵染引起的一種土傳真菌病害，在十字花科植物中危害嚴(yán)重。蕓薹根腫菌在侵染植株的過(guò)程中分為兩個(gè)階段，初侵染階段(或根毛侵染，即土壤中休眠孢子變成初級(jí)游動(dòng)孢子到達(dá)根毛表面后，穿過(guò)細(xì)胞壁侵入根毛內(nèi)部，這個(gè)階段被稱(chēng)為初侵染階段)和再侵染階段(或皮層侵染，即病原菌在根毛內(nèi)部形成次生原生質(zhì)團(tuán)，一部分細(xì)胞核裂解形成多核的游動(dòng)孢子囊，每個(gè)游動(dòng)孢子囊產(chǎn)生4~16個(gè)次游動(dòng)孢子，侵入主根皮層，這個(gè)過(guò)程叫做再侵染階段)，整個(gè)侵染過(guò)程主要在根部進(jìn)行，因此可通過(guò)對(duì)根毛部位的觀察對(duì)根腫菌的侵染過(guò)程進(jìn)行研究。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)根腫病方面的研究多集中于根腫病發(fā)病規(guī)律的調(diào)查與防治，而對(duì)根腫菌侵染過(guò)程的研究報(bào)道較少。在已有研究中，用于觀察根腫菌侵染過(guò)程的植物的培養(yǎng)主要采用土壤培養(yǎng)或水培養(yǎng)的方法，土壤培養(yǎng)法觀察時(shí)對(duì)植株破壞性大，干擾因素多，操作繁雜，觀察結(jié)果不清晰，且容易造成病害的傳播和污染，而用水培法則存在培養(yǎng)液容易污染，植株根系不發(fā)達(dá)等問(wèn)題，且根部容易腐爛，不利于觀察；在培養(yǎng)方法上存在不足，亟需改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決現(xiàn)有技術(shù)中干擾因素多、操作繁雜、觀察結(jié)果不清晰等問(wèn)題，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)被根腫菌侵染的十字花科植株的方法，并在培養(yǎng)過(guò)程中，取樣觀察根腫菌對(duì)十字花科植株侵染的過(guò)程。
[0005]本發(fā)明通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種培養(yǎng)用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于經(jīng)過(guò)下列各步驟:
(O取新鮮的被根腫菌侵染而發(fā)病的十字花科植物的根組織并攪碎，經(jīng)孔徑為25μπι的紗布過(guò)濾，將濾液于3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離9min，去上清液，然后在沉淀物中加入適量蒸懼水，于4000r/min的轉(zhuǎn)速離心分離12min,去上清液,再在沉淀物中加入適量蒸懼水，于4000r/min的轉(zhuǎn)速離心分離12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸餾水懸浮沉淀物，直至得到lX107CFU/mL的根腫菌菌液，保存于4°C下備用；
(2)在消毒石英砂中播下消毒十字花科種子，用MS基本培養(yǎng)液浸濕石英砂及種子，在光照強(qiáng)度為100 μ mo I photons/ (m2.s)、光照時(shí)間為16~18h、溫度為20~22°C、濕度為75%以上的條件下，培養(yǎng)至種子萌發(fā)，再生長(zhǎng)至長(zhǎng)出2片真葉的植株，其間每2天補(bǔ)加I次MS基本培養(yǎng)液，以保持石英砂及種子的濕潤(rùn)；
(3)在步驟(2)的每株植株的根部施加0.5mL步驟(1)的根腫菌菌液進(jìn)行侵染；
(4)從侵染后的第4天開(kāi)始，隨機(jī)取出部分步驟(3)所得的植株，并洗去植株根部的沙子，從根部選取大小均勻的根系，剪下I~2cm的包括根尖部分的須根，置于載玻片上，于生物顯微鏡下觀察，如此每隔2天取出部分步驟(3)所得植株，進(jìn)行一次顯微觀察，直至侵染階段結(jié)束。
[0006]所述步驟(2)的消毒石英砂是:用質(zhì)量濃度為20%的鹽酸浸泡24h，再用水沖洗至石英砂接近中性后，用高壓蒸汽滅菌處理15~30min的石英砂。
[0007]所述步驟(2)的消毒十字花科種子是:經(jīng)質(zhì)量濃度為2%的次氯酸鈉溶液消毒IOmin的種子。
[0008]所述步驟(2)的MS基本培養(yǎng)液是:經(jīng)常規(guī)高溫高壓滅菌后，再用濃度為0.lmol/L的HCl溶液將其pH值調(diào)節(jié)為6.2的MS基本培養(yǎng)液。
[0009]所述根腫菌為蕓薹根腫菌。
[0010]本發(fā)明應(yīng)用沙子-培養(yǎng)液體系對(duì)十字花科植株進(jìn)行培養(yǎng)和根腫菌侵染，侵染植株拔出沖洗后，即可進(jìn)行觀察，對(duì)根毛部位基本沒(méi)有損傷，根毛透明度高、通透性強(qiáng)，可清晰觀察到根腫菌在寄主根毛部位的整個(gè)發(fā)育過(guò)程，觀察后的植株仍可繼續(xù)存活，與傳統(tǒng)方法相比操作簡(jiǎn)單、觀察方便且清晰，能較早地觀察到病害的發(fā)生，對(duì)十字花科及其他植物對(duì)蕓薹根腫菌的抗性研究具有重要意義。
[0011]本發(fā)明操作簡(jiǎn)便且觀察結(jié)果清晰，且應(yīng)用常用用品和試劑，占用空間小，試驗(yàn)成本低，具有操作安全、簡(jiǎn)單，可操作性、可重復(fù)性強(qiáng)，觀察方便、結(jié)果清晰的優(yōu)點(diǎn)，能夠廣泛應(yīng)用于十字花科植物對(duì)蕓薹根腫菌的抗性鑒定中，從而加快根腫病抗性品種的篩選和應(yīng)用。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為侵染后第4 天根毛的顯微觀察結(jié)果；
圖2為侵染后第8天根毛的顯微觀察結(jié)果；
圖3為侵染后第10天根毛的顯微觀察結(jié)果；
圖4為侵染后第12天根毛顯微觀察結(jié)果；
圖5為侵染后第14天根毛顯微觀察結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0014]實(shí)施例1
(1)取新鮮的被蕓薹根腫菌侵染而發(fā)病的十字花科植物的根組織并攪碎，經(jīng)孔徑為25 μ m的紗布過(guò)濾,將濾液于3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離9min,去上清液,然后在沉淀物中加入適量蒸餾水，于4000r/min的轉(zhuǎn)速離心分離12min，去上清液，再在沉淀物中加入適量蒸餾水，于4000r/min的轉(zhuǎn)速離心分離12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸餾水懸浮沉淀物，直至得到I X 107CFU/mL的蕓薹根腫菌菌液，保存于4°C下備用；
(2)在消毒石英砂中播下消毒十字花科種子，用MS基本培養(yǎng)液浸濕石英砂及種子，在光照強(qiáng)度為100 μ mo I photons/ (m2.s)、光照時(shí)間為16h、溫度為22°C、濕度為75%以上的條件下，培養(yǎng)至種子萌發(fā)，再生長(zhǎng)至長(zhǎng)出2片真葉的植株，其間每2天補(bǔ)加I次MS基本培養(yǎng)液，以保持石英砂及種子的濕潤(rùn)；
所述消毒石英砂是:用質(zhì)量濃度為20%的鹽酸浸泡24h，再用水沖洗至石英砂接近中性后，用高壓蒸汽滅菌處理15min的石英砂；所述消毒十字花科種子是:經(jīng)質(zhì)量濃度為2%的次氯酸鈉溶液消毒IOmin的種子；
所述MS基本培養(yǎng)液是:經(jīng)常規(guī)高溫高壓滅菌后，再用濃度為0.lmol/L的HCl溶液將其pH值調(diào)節(jié)為6.2的MS基本培養(yǎng)液；
(3)在步驟(2)的每株植株的根部施加0.5mL步驟(1)的蕓薹根腫菌菌液進(jìn)行侵染；
(4)從侵染后的第4天開(kāi)始，隨機(jī)取出部分步驟(3)所得的植株，并洗去植株根部的沙子，從根部選取大小均勻的根系，剪下Icm的包括根尖部分的須根，置于載玻片上，于生物顯微鏡下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖1中可見(jiàn)根毛細(xì)長(zhǎng)，根毛管腔內(nèi)中空；如此每隔2天取出部分步驟(3)所得植株，進(jìn)行一次顯微觀察，直至侵染階段結(jié)束，結(jié)果見(jiàn)圖2-5，由圖2中可見(jiàn)根毛腫大，根毛管腔內(nèi)出現(xiàn)原生質(zhì)團(tuán)和游動(dòng)孢子囊，由圖3中可見(jiàn)根毛內(nèi)的游動(dòng)孢子囊開(kāi)始產(chǎn)生游動(dòng)孢子，由圖4中可見(jiàn)游動(dòng)孢子從游動(dòng)孢子囊中游出，由圖5中可見(jiàn)根毛腫大，根毛管腔內(nèi)中空。
[0015]實(shí)施例2
(1)取新鮮的被蕓薹根腫菌侵染而發(fā)病的十字花科植物的根組織并攪碎，經(jīng)孔徑為25 μ m的紗布過(guò)濾,將濾液于3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離9min,去上清液,然后在沉淀物中加入適量蒸餾水，于4000r/min的轉(zhuǎn)速離心分離12min，去上清液，再在沉淀物中加入適量蒸餾水，于4000r/min的轉(zhuǎn)速離心分離12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸餾水懸浮沉淀物，直至得到I X 107CFU/mL的蕓薹根腫菌菌液，保存于4°C下備用；
(2)在消毒石英砂中播下消毒十字花科種子，用MS基本培養(yǎng)液浸濕石英砂及種子，在光照強(qiáng)度為100 μ mo I photons/ (m2.s)、光照時(shí)間為18h、溫度為20°C、濕度為75%以上的條件下，培養(yǎng)至種子萌發(fā)，再生長(zhǎng)至長(zhǎng)出2片真葉的植株，其間每2天補(bǔ)加I次MS基本培養(yǎng)液，以保持石英砂及種子的濕潤(rùn)；
所述消毒石英砂是:用質(zhì)量濃度為20%的鹽酸浸泡24h，再用水沖洗至石英砂接近中性后，用高壓蒸汽滅菌處理20min的石英砂；
所述消毒十字花科種子是:經(jīng)質(zhì)量濃度為2%的次氯酸鈉溶液消毒IOmin的種子；
所述MS基本培養(yǎng)液是:經(jīng)常規(guī)高溫高壓滅菌后，再用濃度為0.lmol/L的HCl溶液將其pH值調(diào)節(jié)為6.2的MS基本培養(yǎng)液；
(3)在步驟(2)的每株植株的根部施加0.5mL步驟(1)的蕓薹根腫菌菌液進(jìn)行侵染；
(4)從侵染后的第4天開(kāi)始，隨機(jī)取出部分步驟(3)所得的植株，并洗去植株根部的沙子，從根部選取大小均勻的根系，剪下1.5cm的包括根尖部分的須根，置于載玻片上，于生物顯微鏡下觀察，如此每隔2天取出部分步驟(3)所得植株，進(jìn)行一次顯微觀察，直至侵染階段結(jié)束，從而可清晰地觀察到蕓薹根腫菌在寄主根毛部位的整個(gè)發(fā)育過(guò)程，其結(jié)果同圖1~圖5。
[0016]實(shí)施例3
(1)取新鮮的被蕓薹根腫菌侵染而發(fā)病的十字花科植物的根組織并攪碎，經(jīng)孔徑為25 μ m的紗布過(guò)濾,將濾液于3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離9min,去上清液,然后在沉淀物中加入適量蒸餾水，于4000r/min的轉(zhuǎn)速離心分離12min，去上清液，再在沉淀物中加入適量蒸餾水，于4000r/min的轉(zhuǎn)速離心分離12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸餾水懸浮沉淀物，直至得到I X 107CFU/mL的蕓薹根腫菌菌液，保存于4°C下備用；
(2)在消毒石英砂中播下消毒十字花科種子，用MS基本培養(yǎng)液浸濕石英砂及種子，在光照強(qiáng)度為100 μ mo I photons/ (m2.s)、光照時(shí)間為17h、溫度為21°C、濕度為75%以上的條件下，培養(yǎng)至種子萌發(fā)，再生長(zhǎng)至長(zhǎng)出2片真葉的植株，其間每2天補(bǔ)加I次MS基本培養(yǎng)液，以保持石英砂及種子的濕潤(rùn)；
所述消毒石英砂是:用質(zhì)量濃度為20%的鹽酸浸泡24h，再用水沖洗至石英砂接近中性后，用高壓蒸汽滅菌處理30min的石英砂；
所述消毒十字花科種子是:經(jīng)質(zhì)量濃度為2%的次氯酸鈉溶液消毒IOmin的種子；
所述MS基本培養(yǎng)液是:經(jīng)常規(guī)高溫高壓滅菌后，再用濃度為0.lmol/L的HCl溶液將其pH值調(diào)節(jié)為6.2的MS基本培養(yǎng)液；
(3)在步驟(2)的每株植株的根部施加0.5mL步驟(1)的蕓薹根腫菌菌液進(jìn)行侵染；
(4)從侵染后的第4天開(kāi)始，取出步驟(3)所得部分植株，并洗去植株根部的沙子，從根部選取大小均勻的根系，剪下2cm的包括根尖部分的須根，置于載玻片上，于生物顯微鏡下觀察，如此每隔2天取出部分步驟(3)所得植株，進(jìn)行一次顯微觀察，直至侵染階段結(jié)束，從而可清晰地觀察到蕓薹根腫菌在寄主根毛部位的整個(gè)發(fā)育過(guò)程，其結(jié)果同圖1~圖5。
【權(quán)利要求】
1.一種培養(yǎng)用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于經(jīng)過(guò)下列各步驟: (O取新鮮的被根腫菌侵染而發(fā)病的十字花科植物的根組織并攪碎，經(jīng)孔徑為25μπι的紗布過(guò)濾，將濾液于3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離9min，去上清液，然后在沉淀物中加入適量蒸懼水，于4000r/min的轉(zhuǎn)速離心分離12min,去上清液,再在沉淀物中加入適量蒸懼水，于4000r/min的轉(zhuǎn)速離心分離12min，去上清液，之后在沉淀物中加入蒸餾水懸浮沉淀物，直至得到I X 107CFU/mL的根腫菌菌液，于4°C下保存?zhèn)溆茫? (2)在消毒石英砂中播下消毒十字花科種子，用MS基本培養(yǎng)液浸濕石英砂及種子，在光照強(qiáng)度為100 μ mo I photons/ (m2.s)、光照時(shí)間為16~18h、溫度為20~22°C、濕度為75%以上的條件下，培養(yǎng)至種子萌發(fā)，再生長(zhǎng)至長(zhǎng)出2片真葉的植株，其間每2天補(bǔ)加I次MS基本培養(yǎng)液，以保持石英砂及種子的濕潤(rùn)； (3)在步驟(2)的每株植株的根部施加0.5mL步驟(1)的根腫菌菌液進(jìn)行侵染； (4)從侵染后的第4天開(kāi)始，隨機(jī)取出部分步驟(3)所得的植株，并洗去植株根部的沙子，從根部選取大小均勻的根系，剪下包括根尖部分在內(nèi)的I~2cm的側(cè)根，置于載玻片上，于生物顯微鏡下觀察，如此每隔2天隨機(jī)取出部分步驟(3)所得的植株，進(jìn)行一次顯微觀察，直至侵染階段結(jié)束。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于:所述步驟(2)的消毒石英砂是:用質(zhì)量濃度為20%的鹽酸浸泡24h，再用水沖洗至石英砂接近中性后，用高壓蒸汽滅菌處理15~30min的石英砂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的培養(yǎng)用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于:所述步驟(2)的消毒十字花科種子是:經(jīng)質(zhì)量濃度為2%的次氯酸鈉溶液消毒IOmin的種子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)用于觀察根腫菌侵染十字花科植株的方法，其特征在于:所述步驟(2)的MS基本培養(yǎng)液是:經(jīng)常規(guī)高溫高壓滅菌后，再用濃度為0.lmol/L的HCl溶液將其PH值調(diào)節(jié)為6.2的MS基本培養(yǎng)液。
【文檔編號(hào)】A01G1/00GK103931476SQ201410159860
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】吳麗艷, 龔亞菊, 李石開(kāi), 鮑銳, 黎志彬, 孔令明, 鐘利 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所