一種耐熱重組腈水合酶基因、編碼酶、工程菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種來自根瘤菌的耐熱重組腈水合酶基因、編碼酶、工程菌，以及該基 因工程菌在制備酰胺化合物和降解除草劑一敵草腈中的應(yīng)用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 腈化合物是一類含有氰基（-CN)的有機化合物。在化工領(lǐng)域，腈化合物可以作為 重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于化學(xué)品酰胺和羧酸及其衍生物的有機合成中。然而，采用化學(xué) 法轉(zhuǎn)化腈化合物通常需要強酸、強堿和高壓等條件，勢必對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。與化學(xué)水 解法相比，生物催化法反應(yīng)條件溫和（常溫、常壓和中性PH值），同時對環(huán)境污染的壓力較 小。更重要的是，由酶介導(dǎo)的生物催化法能實現(xiàn)化學(xué)、區(qū)域和對映體選擇性等優(yōu)點，提高其 原子經(jīng)濟利用率。另外，腈化合物可以作為除草劑應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)領(lǐng)域。然而，腈化合物通常 具有細(xì)胞毒性，大量使用勢必將在環(huán)境中大量積累，而如何從環(huán)境中去除將更加嚴(yán)峻。腈化 合物的生物轉(zhuǎn)化過程中主要涉及到腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶。其中，腈水合酶可以催化 腈水合生成酰胺，而酰胺酶進一步將酰胺催化水解產(chǎn)生羧酸化合物；而腈水解酶可以直接 將腈化合物轉(zhuǎn)化為羧酸化合物。
[0003] 在自然界中，生產(chǎn)腈水合酶的微生物分布非常廣泛，如紅球菌、假單胞菌、諾卡 氏菌、假諾卡氏菌、產(chǎn)堿桿菌、棒狀桿菌等。其中，一些微生物已經(jīng)用于丙烯酰胺、煙酰胺 等化合物的工業(yè)化生產(chǎn)中，如專利號為US007405064B2的專利公開了一種野生睪丸酮叢 毛單胞菌5-MGAM-4D ;專利號ZL88106735的專利公開了一種野生玫瑰色紅球菌Jl ;專 利號為ZL86100062的專利公開了一種紅球菌S-6、氧化節(jié)桿菌和黃色微桿菌；專利號為 ZL99106291. 4的專利公開了一種野生嗜熱假諾卡氏菌JCM3095。目前，該領(lǐng)域的主要研宄 針對野生菌株進行篩選和培育，以達到工業(yè)生產(chǎn)的要求。然而，在腈水合酶的基因簇中往往 同時含有酰胺酶基因，從而可以轉(zhuǎn)化丙烯酰胺和煙酰胺為丙烯酸和煙酸，嚴(yán)重影響到目標(biāo) 產(chǎn)物的純度和實際產(chǎn)率。另外，已報道的腈水合酶具有穩(wěn)定性差、對底物和產(chǎn)物的耐受性低 等問題。隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，采用基因工程手段構(gòu)建腈水合酶的基因工程菌株，不 僅可以從源頭阻斷酰胺的進一步水解，保證酰胺產(chǎn)品的高質(zhì)量；而且可以采用蛋白質(zhì)工程 技術(shù)手段對其進行定向改造，提高腈水合酶的某些特性，如穩(wěn)定性和底物耐受性等。同時， 從基因分子水平進行分析，目前已報道的腈水合酶基因序列具有很高的同源度，如來源于 Rhodococcus屬的鐵型腈水合酶的序列同源度大于95%。因此，開發(fā)基因序列多樣性的腈 水合酶基因具有較高的研宄價值和應(yīng)用潛力。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種耐熱重組腈水合酶基因、編碼酶、載體、工程菌及其在催化 腈化合物生成酰胺和生物降解除草劑--敵草腈中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明涉及一種耐熱重組腈水合酶基因，所述耐熱重組腈水合酶基因由SEQ ID NO. 2所示α亞基（氨基酸序列為SEQ ID NO. 5所示）、SEQ ID NO. 3所示β亞基（氨基 酸序列為SEQ ID NO. 6所示）和SEQ ID NO. 4所示活化元件（氨基酸序列為SEQ ID NO. 7 所示）依次連接組成，由于在β亞基基因上游的SD序列比較弱，不利于核糖體的結(jié)合和后 續(xù)的蛋白翻譯，人工添加一段強SD序列，實現(xiàn)該亞基的高效表達，因此優(yōu)選β亞基上游依 次連接SEQ ID NO. 8所示的大腸桿菌SD序列和SEQ ID NO. 9所示間隔序列。
[0007] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7所 示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸 序列同源性在90%以上，且具有相同的酶活力，均可實現(xiàn)本發(fā)明目的，屬于本發(fā)明保護范圍 之列。
[0008] 由于核苷酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和 SEQ ID NO. 4所示多核苷酸的變體，只要其與該多核苷酸具有90%以上同源性，均可實現(xiàn)本 發(fā)明目的，屬于本發(fā)明保護范圍之列。
[0009] 本發(fā)明還涉及一種由所述的耐熱腈水合酶基因編碼的耐熱重組腈水合酶，所述耐 熱重組腈水合酶為SEQ ID NO. 2所示α亞基基因編碼的SEQ ID NO. 5所示氨基酸序列、SEQ ID NO. 3所示β亞基基因編碼的SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列和SEQ ID NO. 4所示活化元 件基因編碼的SEQ ID NO. 7所示氨基酸序列依次連接構(gòu)成。
[0010] 本發(fā)明提供一種由所述耐熱重組腈水合酶基因構(gòu)建的重組載體。
[0011] 本發(fā)明提供一種由所述耐熱重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。
[0012] 本發(fā)明還提供一種所述耐熱重組腈水合酶基因在制備耐熱重組腈水合酶中的應(yīng) 用，所述的應(yīng)用為：在SEQ ID NO. 3所示β亞基基因序列的上游添加 SEQ ID NO. 8(aaggag) 所不的大腸桿菌SD序列和SEQ ID NO. 9 (atatacc)所不間隔序列，形成含SD序列和間隔 序列的β亞基，將SEQ ID NO. 2所示α亞基、含SD序列和間隔序列的β亞基和SEQ ID NO. 4所示活化元件依次連接，合成含有SD序列和間隔序列的耐熱重組腈水合酶基因片段， 將含有SD序列和間隔序列的耐熱重組腈水合酶基因片段與載體連接，構(gòu)建含有SD序列和 間隔序列的耐熱重組腈水合酶基因片段的重組載體，再將重組載體轉(zhuǎn)化宿主菌，獲得的重 組基因工程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離獲得含耐熱重組腈水合酶的菌體細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明涉及一種所述的耐熱重組腈水合酶在催化腈化合物（優(yōu)選3-氰基吡啶） 生成酰胺（優(yōu)選煙酰胺）中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用為：以含耐熱重組腈水合酶基因的重組 基因工程經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后獲得的濕菌體為催化劑，以PH5. 0?8. 0的磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)， 以3-氰基吡啶為底物，在25°C下進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，獲得含煙酰胺的反應(yīng)液，將反應(yīng)液 分離純化，獲得煙酰胺；所述催化劑的用量以濕菌體的重量計為10?50g/L緩沖液（優(yōu)選 22. 4g/L)，所述底物的終濃度為0· 2?I. Omol/L緩沖液（優(yōu)選0· 8mol/L) 〇
[0014] 本發(fā)明還提供一種所述的耐熱重組腈水合酶在生物降解除草劑一敵草腈中的應(yīng) 用，具體所述的應(yīng)用為：以含耐熱重組腈水合酶基因的重組基因工程經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后獲得的 濕菌體為催化劑，以PH5. 0?8. 0的磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，以敵草腈（2, 6-二氯苯甲腈） 為底物，在25°C下進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，獲得含2, 6-二氯苯甲酰胺的反應(yīng)液，將反應(yīng)液分 離純化，獲得2, 6-二氯苯甲酰胺；所述催化劑的用量以濕菌體的重量計為10?50g/L緩沖 液（優(yōu)選25. 2g/L)，所述底物的終濃度為0· 05?0· 5mol/L緩沖液（優(yōu)選0· 2mmol/L)。
[0015] 本發(fā)明所述催化劑按如下方法制備：將含耐熱重組腈水合酶基因的重組基因工程 種接于含100 μ g/ml Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)10?14h ;取培養(yǎng)液 以體積濃度5 %的接種量轉(zhuǎn)接至含50 μ g/ml Kan的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm振 蕩培養(yǎng)至菌體密度（OD6J達到0. 6-1. 0時，加入IPTG至終濃度為0. ImM，18?37°C下誘導(dǎo) 12?18h，將誘導(dǎo)培養(yǎng)液離心，收集濕菌體，即獲得催化劑。
[0016] 本發(fā)明所述催化劑更優(yōu)選按如下步驟制備：將基因工程菌E. coli pET28a (+) -NH05甘油保藏菌種接于5mL含100 μ g/ml Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C， 200rpm振蕩培養(yǎng)10?14h ;取2mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至IOOmL含50 μ g/ml Kan的新鮮LB液體培 養(yǎng)基中，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)至菌體密度（OD6J達到0. 8左右時，加入IPTG至終濃度為 0· ImM，18?37°C下誘導(dǎo)12?18h，在5000?IOOOOXg條件下離心5?IOmin收集細(xì)胞 (即催化劑），用磷酸緩沖液（50?200mM，pH5. 0?8. 0)洗滌兩次，重懸于磷酸緩沖液。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明實現(xiàn)了源自慢生型大豆 根瘤菌USDA 110中假定腈水合酶基因的功能表達，證明了一種重組腈水合酶的活化元件 在表達過程中的關(guān)鍵作用。同時，本發(fā)明提供了一種在大腸桿菌內(nèi)構(gòu)建重組腈水合酶基因 工程菌的方法，使腈水合酶基因在活化元件的參與下獲得具有高表達量和高活性的腈水合 酶。 (四）
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明慢生型大豆根瘤菌USDA 110和耐熱重組腈水合酶基因的PCR擴增 電泳圖；M :核酸Marker ;1 :慢生型大豆根瘤菌USDA 110基因組；2 :耐熱重組腈水合酶基因 的PCR擴增產(chǎn)物。
[0019] 圖2為本發(fā)明重組質(zhì)粒pET28a⑴-NH05的圖譜。
[0020] 圖3為本發(fā)明基因工程菌株E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NH05誘導(dǎo)表達產(chǎn)物 的SDS-PAGE電泳圖；M :低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)；I :E. coli BL21(DE3)/pET-28a(+)空載質(zhì)粒 對照菌體破碎上清液；2 :基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-NH05誘導(dǎo)后菌體破碎 液；3 :基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-NH05誘導(dǎo)菌體破碎上清液；4 :基因工程 菌E. coli BL21 (DE3)/pET28a (+)-NH05誘導(dǎo)菌體破胞沉淀，箭頭指示腈水合酶的位置。
[0021] 圖4為重組腈水合酶NH05純化的SDS-PAGE電泳圖；M :低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)；1 : 基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-NH05誘導(dǎo)后菌體破碎上清液；2 :重組腈水合酶 NH05經(jīng)鎳柱純化獲得的純酶液；3 :重組腈水合酶蛋白粉。 (五）
【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0023] DNA聚合酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶（Nde I、Hind III)和T4DNA連接酶菌購 自寶生物工程（大連）有限公司（Takara?)。
[0024] 細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收純化試劑盒購自康寧生 命科技有限公司（Axygen?)。
[0025] E. coli DH5a、E. coli BL21(DE3)和質(zhì)粒 pET-28a(+)購自 Novagen 公司；低分子 量蛋白質(zhì)