專利名稱：從脂肪族α，ω-二腈中制備內酰胺的制作方法
本申請系1997年5月7日提交的、申請?zhí)枮?7194702.3的、發(fā)明名稱與本申請相同的申請的分案申請。
1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及一種通過生物學和化學的結合技術從脂肪族α，ω-二腈中制備五元或六元環(huán)內酰胺的方法。更具體而言，使用一種具有脂肪族腈水解酶(EC 3.5.5.7)活性或者有腈水合酶(EC 4.2.1.84)和酰胺酶(EC 3.5.1.4)活性的結合的催化劑在水溶液中首先把脂肪族α，ω-二腈轉變成ω-腈基羧酸的銨鹽。然后，不分離中間體ω-腈基羧酸或ω-氨基羧酸，直接在水溶液中通過氫化作用把ω-腈基羧酸轉化成相應的內酰胺。當脂肪族α，ω-二腈在α-碳原子位也被不對稱地取代時，由于ω-腈基的水解作用具有98％以上的區(qū)域選擇性，腈水解酶產生了ω-腈基羧酸銨鹽，因而在后續(xù)的氫化作用中僅產生了兩種可能的內酰胺產物的一種。
2.相關領域描述通過各種化學方法，將腈容易地轉化成相應的羧酸，但這些方法一般需要強酸或強堿的反應條件及很高的反應溫度，且通常產生非所需的副產物和/或大量的作為非所需副產物的無機鹽。酶催化的水解作用把腈底物轉化成相應的羧酸的方法通常優(yōu)于化學法，這是因為這些方法經常在環(huán)境溫度下進行，不需要使用強酸或強堿的反應條件，以及不產生大量的非所需副產物。腈的酶催化水解作用優(yōu)于化學水解作用的另外一個優(yōu)點是對各種脂肪族二腈或芳香族二腈而言，酶催化的反應可以是高度的區(qū)域選擇性的，其中僅兩個腈基之一個被水解成相應的羧酸銨鹽。
在水溶液中，腈水解酶直接把腈轉化成相應的羧酸銨鹽而不形成酰胺中間體。用芳香族腈水解酶把芳香族腈水解成相應的羧酸銨鹽的方法已使用了許多年，但僅是最近才報道使用脂肪族腈水解酶。Kobayashi等(《四面體》(1990)，第46卷，5587-5590；《細菌學雜志》，(1990)，第172卷，4807-4815)描述了一種分離自紫紅紅球菌K22株的脂肪族腈水解酶，該酶把脂肪族腈催化水解為相應的羧酸銨鹽；幾種脂肪族α，ω-二腈也被水解，用靜止細胞作催化劑，以100％的摩爾轉化率將戊二腈轉變成4-氰基丁酸銨鹽。從睪丸酮叢毛單胞菌分離到一種腈水解酶，該酶能把一系列脂肪族α，ω-二腈轉化成相應的ω-腈基羧酸銨鹽或二羧酸二銨鹽(加拿大專利申請?zhí)朇A 2,103,616(1994/02/11)；S.Lévy-Schil等，《基因》，(1995)，第161卷，15-20)；水解己二腈在把5-氰基戊酸銨鹽完全轉變成己二酸二銨鹽前所獲得的5-氰基戊酸銨鹽的最大產量約為88％。
M.L.Gradley和C.J.Knowles(《(生物技術通訊》，(1994)，第16卷，41-46)報道應用具有脂肪族腈水解酶活性的紫紅紅球菌NCIMB11216的懸浮液水解幾種2-甲基烷基腈。得到了把(+/-)-2-甲基丁基腈完全轉變成2-甲基丁酸銨鹽的結果，而(+/-)-2-甲基己烷腈的水解似乎是對(+)對映體的對映結構特異性。C.Bengis-Garber和A.L.Gutman(《微生物學生物技術應用》，(1989)，第32卷，11-16)使用紫紅紅球菌NCIMB 11216作為催化劑水解幾種二腈。在該項工作中，將富馬腈和琥珀腈轉化成相應的ω-腈基羧酸銨鹽，而將戊二腈、己二腈和庚二酰腈轉化成相應的二羧酸二銨鹽。
聯(lián)合使用腈水合酶(NHase)和酰胺酶這兩種酶也能在水溶液中把脂肪族腈轉變成相應的羧酸銨鹽。此反應最初由腈水合酶把脂肪族腈轉化成酰胺，然后由酰胺酶接著把酰胺轉變成相應的羧酸銨鹽。已知大量的細菌種屬擁有不同的腈水合酶和酰胺酶活性譜，其中包括紅球菌屬、假單胞菌屬、產堿桿菌屬、節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬、桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬和微球菌屬。已將這些微生物的水懸液和所分離到的酶用于把腈轉化成酰胺和羧酸銨鹽。
P.Honicke-Schmidt和M.P.Schneider(化學協(xié)會雜志《化學通訊》(J.Chem.Soc.，Chem.Commun.)(1990)，648-650)用固定化的紅球菌屬種CH 5株分別把腈和二腈轉化成羧酸銨鹽和ω-腈基羧酸銨鹽。這些細胞含有腈水合酶和酰胺酶活性，把戊二腈轉變成4-氰基丁酸銨鹽，以92％的底物轉化率為基礎則有79％的分離產量。A.J.Blakely等(《FEMS微生物學通訊》(1995)，第129卷，57-62)用紅球菌屬AJ 270懸液的腈水合酶和酰胺酶活性區(qū)域特異地水解丙二腈和己二腈，僅產生相應的ω-腈基羧酸銨鹽。H.Yamada等(《發(fā)酵技術雜志》(1980)，第58卷，495-500)描述用含有腈水合酶和酰胺酶的假單胞菌屬種K9把戊二腈水解成4-氰基丁酰胺、4-氰基丁酸、戊二酸和氨的混合物。K.Yamamoto等(《發(fā)酵生物工程雜志》，1992，第73卷，125-129)描述使用含有腈水合酶和酰胺酶活性的棒狀桿菌屬種CH5細胞把反式1，4-二氰環(huán)己烷轉變成反式-4-氰基環(huán)己烷羧酸銨鹽，產量為99.4％。
J.L.Moreau等(《生物催化》，(1994)，第10卷，325-340)描述應用短桿菌屬種R 312(腈水合酶和酰胺酶活性)、通過形成5-氰基戊酸中間體，把己二腈水解成己二酸、己二酰二胺和己二酰胺酸(adipamic acid)。A.Kerridge等(《生物區(qū)域選擇性藥物化學》(Biorg.Medicinal Chem)(1994)，第2卷，447-455)報道使用短桿菌屬種R 312(腈水合酶和酰胺酶活性)，把前手性-3-羥基戊二腈衍生物水解成相應的(S)-氰酸銨鹽。歐洲專利178,106 B1(1993年3月31日)公開了如下方法使用來源于芽胞桿菌屬、桿菌屬、微球菌屬或短桿菌屬的單腈水解酶活性(定義為腈水解酶或腈水合酶/酰胺酶的組合)，把脂肪族二腈的氰基之一個選擇性地轉化成相應的羧酸、酰胺、酯或硫酯。除了具有腈水解酶活性或腈水合酶/酰胺酶活性的細菌催化劑的許多實施例外，Y.Asano等(《農業(yè)生物化學》，(1980)，第44卷，2497-2498)闡述了真菌節(jié)狀鐮孢TG-1把戊二腈水解成4-氰基丁酸銨鹽以及把2-甲基戊二腈水解成4-氰基戊酸銨鹽。
沒有發(fā)現現有技術描述在水溶液中脂肪族ω-腈基羧酸銨鹽的氫化作用直接產生相應的內酰胺。接近的相關技術是美國專利4,329,498描述用2號Raney鎳催化劑、在用氨飽和的無水乙醇溶液中粘康酸單腈的氫化形成6-氨基己酸(6-ACA)。除去氫化作用的催化劑后，把6-ACA乙醇溶液加熱到170℃-200℃可預期6-ACA環(huán)化形成己內酰胺。已報道用Raney鎳作催化劑，在1N的氫氧化鈉溶液中，通過氫化作用把β-喹喔啉基丙酸(E.C.Taylor等，《美國化學學會雜志》，(1965)，第87卷，1984-1990)或相關的2-(2-羧乙基)-3(4H)-喹喔酮(E.C.Taylor等，《美國化學學會雜志》，(1965)，第87卷，1990-1995)還原性環(huán)化產生相應的五元環(huán)內酰胺，只不過從產物混合物中除去催化劑和酸化產生的濾液之后進行。作者聲明對任何的這些還原作用，“內酰胺的形成只能在酸性溶液中進行”(1992頁，第二段)，可能需要質子化的羧酸而不是羧酸鹽的存在。美國專利4,730，040公開了一種制備己內酰胺的方法，該方法是在氫化作用催化劑存在下，把5-甲酰戊酸的水溶液和氨及氫反應，然后把氨從產物混合物中分離，并把產生的6-ACA溶液加熱到300℃。
以前的工作已公開了已將含腈水合酶和酰胺酶活性的單細胞用于把腈和二腈轉化成不同的酸性銨鹽?？墒牵瑳]有發(fā)現現有技術描述在本發(fā)明的氫化反應條件下(即在加過量的氫氧化銨水溶液中)，把脂肪族ω-氨基羧酸銨鹽環(huán)化成相應的內酰胺。接近的相關技術已有報道，在各種反應條件下，把脂肪族ω-氨基羧酸(但不是銨鹽)環(huán)化成相應的內酰胺。F.Mares和D.Sheehan(《化學工業(yè)工程學設計開發(fā)》(Ind.Eng.Chem.Process Des.Dev.)(1978)，第17卷，9-16)描述了用水或乙醇作溶劑，把6-氨基己酸(6-ACA)環(huán)化成己內酰胺的方法。在水中，低于1mol/kg(約1M)的濃度下環(huán)化反應是可逆的，且己內酰胺的濃度隨著溫度的增加而增加；在0.85mol/kg(約0.85M)的6-ACA和己內酰胺總濃度下，據報道己內酰胺的百分率從在180℃下的38.7％增加到在250℃下的92.2％。在乙醇中，200℃時可獲得的己內酰胺產量為98％，該報道認為這是由于反應移向有利于乙醇中6-ACA游離酸/游離胺形式的平衡，而不是在水中占優(yōu)勢的6-ACA分子內烷基銨羧酸鹽的形式。從6-ACA中產生己內酰胺的方法已在美國專利4,599,199中描述，其中將6-ACA在290℃～400℃的蒸汽存在下加到流化的氧化鋁床中。在甲苯中的氧化鋁或硅膠上通過脂肪族ω-氨基酸環(huán)化脫水合成五、六和七元環(huán)內酰胺、同時不斷除去反應中所產生的水的方法，已由A.Bladé-Font(《四面體通訊》，(1980)，第21卷，2443-2446)報道。據報道游離氨基(非質子化的)對環(huán)化脫水的發(fā)生是必需的。
沒有發(fā)現現有技術描述在含甲胺的水溶液中，脂肪族ω-腈基羧酸銨鹽的氫化作用直接產生相應的N-甲基內酰胺。接近的相關技術為用Raney鎳催化劑、在140℃，1000-2000psig的氫氣下、在水中通過乙酰丙酸和甲胺水溶液的氫化作用制備1，5-二甲基-2-吡咯烷酮(pyrrolidinone)(R.L.Frank等，《有機合成》，(1954)，Coll.第3卷，328-329)。然后由過濾產物混合物和蒸餾濾液以除去水和甲胺而將所產生的4-N-甲基氨基戊酸甲銨鹽環(huán)化成相應的內酰胺。N-烷基內酰胺也可通過含2-甲基戊二腈、伯烷基胺和氫化催化劑的水混合液的直接氫化作用產生，該方法產生1，3和1，5二烷基哌啶酮-2的混合物(美國專利5,449,780)。N-取代的2-吡咯烷酮(pyrrolidinones)可由如下方法制取把γ-戊內脂和烷基胺在110～130℃反應，然后加熱生成混合物至250～270℃，同時蒸餾去水(F.B.Zienty和G.W.Steahly，《美國化學學會雜志》，(1947)，第69卷，715-716)。
產生內酰胺或N-烷基內酰胺的上述方法受如下一種或多種缺點所妨礙使用當用水作溶劑時為獲得高產量的內酰胺所用的溫度超過250℃；為推動平衡移向內酰胺形成，需從反應混合物中除去水，調整反應混合物的pH到酸性值，以利于內酰胺的形成；或者使用有機溶劑，其中起始原料罕有可溶的。許多這些方法產生不需要的廢流，或產物混合物不易分離。有意義的進展將是如下的方法在水溶液中把脂肪族α，ω-二腈轉變成相應的內酰胺或N-甲基內酰胺，產量高，具有高度區(qū)域選擇性，幾乎不產生副產物或廢流，以及容易的回收產物的方法。
發(fā)明概述一種從脂肪族α，ω-二腈中制備五元環(huán)內酰胺或六元環(huán)內酰胺的方法，具有如下步驟(a)把在水溶液反應混合物中的脂肪族α，ω-二腈與-種酶催化劑接觸，該催化劑的特征為(1)脂肪族腈水解酶活性，或者(2)腈水合酶和酰胺酶活性的組合借此，脂肪族α，ω-二腈被轉化成α，ω-腈基羧酸銨鹽；(b)把從步驟(a)生成的含水產物混合物與氫和氫化作用催化劑接觸，由此將ω-腈基羧酸銨鹽直接轉變成相應的內酰胺，而不用分離中間體ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸銨鹽、銨鹽、ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸銨鹽；(c)從步驟(b)生成的含水產物混合物中回收內酰胺。
在步驟(b)前，可將氫氧化銨、氨氣或甲胺添加到步驟(a)的含水產物混合物中。該添加量是相應于存在的ω-腈基羧酸銨鹽的量的0～4摩爾當量。
本發(fā)明的進一步實施例方案使用具有通式NCCXa(R)(CH2)nCN的脂肪族α，ω-二腈，其中a＝0或1，當a＝1且R＝H、非取代或取代的烷基、或非取代或取代的鏈烯基、或非取代或取代的亞烷基，且其中n＝1或2時X＝氫。
本發(fā)明的進一步實施例方案是一種處理完整細胞催化劑從選擇區(qū)域選擇性的腈水解酶活性或腈水合酶活性，能催化脂肪族α，ω-二腈轉變成相應的ω-氰基羧酸銨鹽的方法。所處理的完整細胞催化劑的特征為兩種類型的活性(1)合乎需要的區(qū)域選擇性腈水解酶活性或區(qū)域選擇性的腈水合酶活性，和(2)不合乎需要的非區(qū)域選擇性的腈水解酶或腈水合酶活性。處理細胞的方法包括加熱完整細胞催化劑到約35℃～70℃的溫度，時間為10～120分鐘，其中將不合乎需要的非區(qū)域選擇性的腈水解酶活性或腈水合酶活性破壞，而將合乎需要的區(qū)域選擇性的腈水解酶或腈水合酶活性保留。
本發(fā)明的進一步實施例方案是使用酶催化劑，這些催化劑的形式為完整的微生物細胞、通透化的微生物細胞、微生物細胞提取物的一種或多種細胞組分、以及部分純化的酶或純化的酶。將這些酶催化劑固定在支持物上。具有脂肪族腈水解酶活性特征和用于本方法的微生物為敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72-PE-15(ATCC 55747)、敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)和敏捷食酸菌72W(ATCC55746)。以腈水合酶和酰胺酶活性的組合為特征且能在本方法中應用的微生物是睪丸酮叢毛單胞菌(Comomonas testosteroni)5-MGAM-4D(ATCC 55744)。
進一步的實施例方案是一種從脂肪族α，ω-二腈中制備五元環(huán)內酰胺或六元環(huán)內酰胺的方法，包括(a)和如下通式I或II的脂肪族α，ω-二腈接觸 或 其中R1和R2是H，且R3、R4、R5和R6獨自選自H、非取代或取代的烷基，或非取代或取代的鏈烯基、在含水反應混合液中含的酶催化劑選自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)、敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)、敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)和睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)，由此將脂肪族α，ω-二腈轉化成ω-腈基羧酸銨鹽；b)把步驟(a)中生成的含水產物混合物和氫及氫化作用催化劑接觸，由此將ω-腈基羧酸銨鹽直接轉化成相應的內酰胺，而不用分離中間體ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸銨鹽、ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸銨鹽；和c)從步驟(b)生成的含水產物混合物中回收內酰胺。
進一步的實施例方案是一種從脂肪族α，ω-二腈制備五元環(huán)內酰胺或六元環(huán)內酰胺的方法，包括(a)把如下通式I或II的脂肪族α，ω-二腈在水反應混合液中與睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)接觸； 或 其中R7、R8、R9、R10、R11和R12獨自選自H、非取代或取代的烷基，或非取代或取代的鏈烯基，其中任一個或二個R7或R8不是H；由此將脂肪族α，ω-二腈轉變成ω-腈基羧酸銨鹽；(b)把在步驟(a)生成的含水產物混合物與氫和氫化作用催化劑接觸，由此將ω-腈基羧酸銨鹽直接轉變成相應的內酰胺，而不用分離中間體ω-腈基羧酸、ω-腈基羧酸銨鹽、ω-氨基羧酸或ω-氨基羧酸銨鹽；和(c)從步驟(b)生成的含水產物混合物中回收內酰胺。
最后，提供新型的化合物如下通式III的化合物
其中M+是H+或者是NH4+P通式IV的化合物 其中M+是H+或者是NH4+。
生物學保藏簡述根據Budapest條約中的條款，申請者已進行了如下的生物學保藏保藏者鑒定參考 國際保藏部保藏號保藏日期睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D ATCC 55744 1996年3月8日敏捷食酸菌72-PF-17 ATCC 55745 1996年3月8日敏捷食酸菌72W ATCC 55746 1996年3月8日敏捷食酸菌72-PF-15 ATCC 55747 1996年3月8日在此所用的“ATCC”指的是美國典型培養(yǎng)物保藏中心，國際保藏部，位于12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，美國?！癆TCCNo.”是ATCC保藏培養(yǎng)物的登記號。
發(fā)明詳述開發(fā)了一種從脂肪族α，ω-二腈中高產量地制備內酰胺的方法，該法利用酶和化學反應的組合。假如α，ω-二腈被不對稱地取代，就能觀察到對兩種可能的內酰胺產物(

圖1)之一種的高度區(qū)域選擇性。
圖1 其中a＝0或1；X＝氫，當a＝1時；n＝1或2R＝H，非取代或取代的烷基、或非取代或取代的鏈烯基、或非取代或取代的亞烷基；R1＝H，-CH3本發(fā)明的產物在農業(yè)和藥物工業(yè)中能用作高價值的聚合物、溶劑和化學品的前體。當用水作溶劑時，本方法使用低于250℃的溫度，獲得了高產量的內酰胺。相應于以前眾所周知的生產內酰胺的化學法，要求權利保護的本發(fā)明幾乎不產生廢物，并允許用容易的方法回收產物。
在本申請中，除非在別處具體說明，使用下列縮寫和定義“酶催化劑”指的是特征為腈水解酶活性或腈水合酶活性和酰胺酶活性組合的催化劑。該催化劑可能的形式為完整的微生物細胞、通透化的微生物細胞、一種或多種微生物細胞提取物的細胞組分、部分純化的酶或純化的酶。
“氫化作用催化劑”指的是能加速氫化作用而其本身不被消耗或不發(fā)生化學變化的物質。
“含水產物混合物”被用于指含有從相應的方法步驟所生成的含水產物混合物。
A.高產量及高度區(qū)域選擇性地把脂肪族α，ω-二腈轉化成相應的ω-腈基羧酸銨鹽。
本方法的第一步是用酶催化劑，把脂肪族α，ω-二腈轉化相應的ω-腈基羧酸銨鹽。酶催化劑要么具有腈水解酶活性，要么具有兩種酶腈水合酶(NHase)和酰胺酶活性的組合，其中前者是腈水解酶把α，ω-二腈直接轉化成相應的ω-腈基羧酸銨鹽(反應式1)；而后者是由腈水合酶起始把脂肪族α，ω-二腈轉變成ω-腈烷基酰胺，然后由酰胺酶接著把ω-腈烷基酰胺轉變成相應的ω-腈基羧酸銨鹽(反應式2) 從暴露在脂肪族腈或脂肪族二腈的土壤樣品中分離得到新型的微生物敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)，它能利用2-乙基琥珀腈作為氮源。當使用微生物的完整細胞催化劑水解不對稱取代的2-烷基-α，ω-二腈、例如2-甲基戊二腈(2-MGN)或2-乙基琥珀腈時，得到產物混合物。在水解反應整個過程中，除了所需的ω-腈基羧酸外，產生了相應的二羧酸單酰胺和二羧酸。已發(fā)現在合適的緩沖液中，50℃下短時間加熱敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的懸液可失活完整細胞催化劑的不合乎需要的腈水合酶活性，該水合酶催化劑可催化產生不合乎需要的二羧酸單酰胺(進一步由酰胺酶轉變成相應的二羧酸)。用這種方法，制備的完整細胞催化劑含有腈水解酶活性，由于ω-腈基的水解，腈水解酶把2-烷基-α，ω-二腈僅轉變成ω-腈基羧酸銨鹽。
熱處理敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的懸液50℃下1小時所產生的微生物完整細胞催化劑，能把2-甲基戊二腈(2-MGN)水解成4-氰基戊酸(4-CPA)銨鹽，把2-亞甲基戊二腈(2-MEGN)水解成4-氰基-4-戊酸(4-CPEA)銨鹽，或者把2-乙基琥珀腈(2-ESN)水解成3-氰基戊酸(3-CPA)銨鹽，水解作用具有極為高度的區(qū)域選擇性，如在完全轉化二腈時，通過腈基的水解作用至少產生98％產量的ω-腈基羧酸銨鹽(表1)
表1α，ω-二腈ω-腈/酸銨鹽濃度(M)產量(％)2-MGN 4-CPA(NH4+) 0.10 99.3″ ″ 0.40 99.4″ ″ 1.00 99.4″ ″ 1.85 98.8″ ″ 2.00 98.92-MEGN 4-CPEA(NH4+) 1.25 100″ ″ 2.00 1002-ESN 3-CPA(NH4+) 0.10 100″ ″ 0.40 100″ ″ 1.00 100″ ″ 1.25 100目前還沒有非酶學方法能僅把脂肪族二腈的一個腈基選擇性地水解成酰胺基或羧酸基而完全轉化二腈。如果為了獲得對單酰胺或單酸水解產物的高度選擇性而上述的反應以不完全轉化(轉化率＜20％)的方式進行，那么就需要分離步驟，把產物從未反應的二腈中分離出來，在后續(xù)的反應中重新循環(huán)二腈。典型的非酶促水解反應包括在提高溫度下加熱腈或二腈溶液，常常需要存在強酸或強堿，而上述的酶催化反應在環(huán)境溫度下的水溶液及中性pH中進行，不用添加酸或堿。
已經制備了兩種敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的突變株，它們僅產生非常低水平的不合需要的腈水合酶活性，該腈水合酶導致不合需要的副產物形成。這些突變株、敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC55747)和敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)在用作催化劑前不需要熱處理細胞就能把脂肪族α，ω-二腈水解成相應的ω-腈基羧酸銨鹽。通過用未處理和熱處理的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)和未處理的敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)突變株水解2-MGN而產生4-CPA和2-甲基戊二酸(2-MGA)的產量比較，在表2中顯示
表2[2-MGN]4-CPA 2-MGA催化劑(M)(％產量)(％產量)敏捷食酸菌72W，未處理 0.10 62.734.6敏捷食酸菌72W，熱處理 0.10 99.30.7敏捷食酸菌72-PF-15，未處理0.10 96.83.6敏捷食酸菌72W，熱處理 0.40 99.40.6敏捷食酸菌72-PF-15，未處理0.40 98.81.2敏捷食酸菌72W，熱處理 1.00 98.71.3敏捷食酸菌72-PF-15，未處理1.00 99.20.8當用熱處理過的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)作催化劑水解非取代的α，ω-二腈琥珀腈(SCN，1.25M)或戊二腈(GLN，1.5M)的水溶液時，產生了相應的ω-腈基羧酸銨鹽3-氰基丙酸(3-CPRA)和4-氰基丁酸(4-CBA)，產量分別為99.7％和92.3％，相應的二羧酸是唯一觀察到的副產物。當將該相同的催化劑用于把己二腈(ADN)轉化成5-氰基戊酸(5-CPA)銨鹽時，己二酸(ADA)二銨鹽是主要產物(產量＞50％)。敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)及敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)均不適用于作高產量地制備5-CPA銨鹽的催化劑。
將從暴露于脂肪族腈或脂肪族二腈的土壤樣品中分離并能以不同的腈或酰胺作氮源生長的30多種不同的微生物培養(yǎng)物用于高選擇性地產生5-CPA的篩選。分離到了第二種新型微生物睪丸酮絲毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)(用2-甲基戊二酰胺(methylglutaranide)作氮源)，該菌含有幾種腈水合酶和酰胺酶活性。當用完整細胞催化劑水解ADN時，生成的產物混合物主要由ADA二銨鹽、己二酰二胺(ADAM)和己二酰胺酸(adipamic acid)(ADMA)組成，僅觀察到微量的5-CPA銨鹽。再次發(fā)現50℃下短時間加熱此種微生物可較大程度地失活不合需要的腈水合酶活性，使該微生物催化劑保留下把ADN轉化成5-氰基戊酰胺的腈水合酶活性和把5-氰基戊酰胺轉變成5-CPA銨鹽的酰胺酶活性。熱處理睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D 50℃1小時形成一種微生物細胞催化劑，該催化劑產生5-CPA，產量高達97％，完全轉化ADN。
通過熱處理消除不需要的腈水合酶而同時留下相對熱穩(wěn)定的腈水解酶活性或腈水合酶活性以把二腈轉變成氰酸，這種可能性以前未被人知曉，也不可能預測，因為腈水解酶或腈水合酶的溫度穩(wěn)定性是未知的?？梢灶A期在35℃～70℃溫度下熱處理10～120分鐘將產生所述的有用效應。
B.五或六元環(huán)內酰胺的制備已經發(fā)現一種方法，可高產量地制備五元環(huán)或六元環(huán)內酰胺，該法把在水溶液中酶催化水解脂肪族α，ω-二腈產生的ω-腈羧酸銨鹽產物混合物直接氫化而實現。在氫化作用步驟前，這種方法不需要從水解反應的產物混合物中分離ω-腈羧酸銨鹽，也不需要在氫化作用前把ω-腈羧酸銨鹽轉變成游離酸(例如，4-CPA銨鹽轉變成4-CPA)，或者不需要從氫化作用產物混合物中分離生成的ω-氨基羧酸銨鹽和環(huán)化前把銨鹽轉化成游離羧酸。
用酶催化劑從脂肪族α，ω-二腈中生產含ω-腈基羧酸銨鹽的含水產物混合物后(反應式3)，移去酶催化劑，在合適的氫化作用催化劑存在下把生成的水溶液和氫及加有化學計量學上過量的氨(如氫氧化銨)反應，可預期產生含有脂肪族ω-氨基羧酸銨鹽的水溶液(反應式4) 有必要在腈氫化成相應的胺的過程中使用過量的氨，從而通過產物ω-氨基羧酸限制亞氨中間體(在腈基氫化成胺的過程中產生)的還原性烷基化，這種烷基化導致形成二聚體并喪失產量。這種技術已有文獻詳細描述(De Bellefon等，《英國科學回顧目錄》(Catal.Rev.Sci.Eng)(1994)，第36卷，459～506)并由腈氫化作用領域的技術人員普遍使用。
依據現有技術，可以預期必須將由ω-腈基羧酸銨鹽氫化作用產生的ω-氨基羧酸銨鹽在可進行熱誘導的環(huán)化反應以產生所需的內酰胺前(反應式6)轉變成游離酸并加以分離(反應式5)。根據Mares等的報道(同上)，在水中濃度低于1.0mol/kg(約1.0M)時，6-氨基己酸(6-ACA)(反應式6，n＝3，R＝H)和己內酰胺以可逆的平衡混合物存在，己內酰胺的濃度隨著溫度的增加而增加。在0.85mol/kg(約0.85M)的6-ACA和己內酰胺總濃度下，據Mares等報道己內酰胺的百分比從180℃時的18.7％增加到250℃時的92.2％。
在這種情況下，盡管存在所加的過量的氨(如氫氧化銨)和反應混合物的pH為9～10，但是不能認為6-ACA銨鹽在氫化作用溫度低于200℃時會環(huán)化產生明顯數量的己內酰胺。6-氨基己酸的羧酸基和質子化的胺基的pKa′值分別為4.373和10.804(Lange′s化學手冊，J.A.Dean，主編，第14版，(1992)，McGraw-Hill，NY.p8.22(如6-氨基己酸))，NH4+的pKa為9.25。在反應混合物pH為9～10時，能計算出至少99.97％的6-ACA在溶液中以羧酸銨鹽存在，此外，大約一半的6-氨基己酸銨鹽的胺基也被質子化。因此，不能認為在本發(fā)明的氫化作用條件下，顯著量的6-ACA銨鹽會環(huán)化產生己內酰胺，其中在反應式(7)中表示的從環(huán)化反應中間物中取代氫陰離子(-OH)是不利的
當5-CPA銨鹽(通過酶水解ADN制備)水溶液的氫化作用在0M～2.0M NH4OH存在下、溫度70℃～160℃進行時，可觀察到5-CPA完全轉變成6-ACA銨鹽，幾乎不形成副產物，正如預期的那樣，得到的己內酰胺(生成七元環(huán)的內酰胺)的產量小于3％(表3)表3溫度5-CPA銨鹽 [NH4OH]時間5-CPA轉化己內酰胺(℃)(M) (M)(h) 率(％) (％)70 1.0 0 2 100 0.770 1.0 1.02 100 0.770 1.0 1.52 94 0.870 1.0 2.02 84 0.8120 1.0 0 2 99 0.9120 1.0 1.02 100 0.9120 1.0 1.52 97 1.0120 1.0 2.02 97 1.1160 1.0 0 2 97 2.5160 1.0 1.02 84 2.3160 1.0 1.52 97 3.0160 1.0 2.02 95 2.7在與由酶水解ADN制備5-CPA銨鹽的氫化作用相同的氫化反應條件下，當處理通過混合真正的6-ACA和氫氧化銨制備的水溶液時，也可得到小于3％產量的己內酰胺。在70℃下，5-CPA銨鹽的氫化作用制備的水溶液中，環(huán)化6-ACA銨鹽在高于200℃的溫度時可設法實現，該法首先除去氫化作用催化劑，然后在280℃時加熱約1.0M 6-ACA銨鹽產物混合物2小時即可。產生的己內酰胺的量小于18％(表4)。這些結果說明在過量的氨存在下，通過5-CPA銨鹽水溶液的直接氫化作用只能獲得非常低產量的己內酰胺。根據6-ACA銨鹽進行環(huán)化反應的不可預測性，尤其是存在過量的氫氧化銨時，這種結果是可預期的。
表4溫度6-ACA銨鹽 [NH4OH]時間己內酰胺(℃)(M) (M)(h) (％)280 1.0 0 2 17.8280 1.0 1.02 17.2280 1.0 1.52 11.0280 1.0 2.02 9.0280 1.0 2.52 3.1也可預期當3-氰基戊酸(3-CPA)銨鹽(由酶水解2-乙基琥珀腈(2-ESN)制備)或4-氰基戊酸(4-CPA)銨鹽(由酶水解2-甲基戊二腈(2-MGN)制備)在過量的氨存在下70℃～160℃氫化時，會產生相應的ω-氨基羧酸銨鹽；在進行環(huán)化反應成相應的內酰胺前(如5-CPA銨鹽的情況)，這些鹽類必須作游離酸予以分離。雖然羧酸的pKa值和產物4-氨基-3-乙基丁酸或5-氨基-4-甲基戊酸的質子化胺的機能沒有報道，但是有充分理由設想這些pKa與6-ACA異構體的pKa相似。
未曾預料到的是，在Raney鎳和過量的銨存在下，在pH 9～10、溫度70℃～180℃時，把3-CPA銨鹽(由酶水解2-ESN產生)的水溶液氫化作用2小時，直接產生相應的4-乙基吡咯烷-2-酮內酰胺(4-EPRD)產量達91％(表5)。4-EPRD的產量也隨所添加的氫氧化銨(除了已經作為羧酸銨鹽存在的銨離子濃度外添加)的濃度的增加而增加，這表明為了限制眾所周知的產生二聚體和聚合物的還原性烷基化反應，需要添加氨進行單腈酸銨鹽的水溶液的氫化作用(表6)。
表5溫度3-CPA銨鹽[NH4OH] 重量％時間3-CPA4-EPRD(℃)(M) (M)Raney Ni (h) (％轉化率) (％產量)70 1.0 2.05 2 71.5120 1.0 2.05 2 55 22.7140 1.0 2.05 2 71 55.4140 1.0 2.0102 100 89.9160 1.0 2.05 2 100 90.1160 1.0 2.0102 100 91.3180 1.0 2.05 2 100 86.1180 1.0 2.0102 100 90.0表6溫度3-CPA銨鹽 [NH4OH]重量％時間3-CPA 4-EPRD(℃)(M) (M)Raney Ni (h) (％轉化率) (％產量)160 1.0 0 5 2 99 80.1160 1.0 1.05 2 99 87.6160 1.0 2.05 2 100 90.1160 1.0 3.05 2 100 85.4180 1.0 0 5 2 100 75.1180 1.0 1.05 2 100 85.8180 1.0 2.05 2 100 88.5180 1.0 3.05 2 100 90.0在Raney鎳和過量的氨存在下，在pH 9～10、160℃時把4-CPA銨鹽(由酶水解2-MGN制備)的水溶液氫化作用2小時，直接產生相應的5-甲基-2-哌啶酮內酰胺(5-MPPD)，產量高達96％(表7)
表7溫度4-CPA銨鹽 [NH4OH]重量％時間4-CPA 5-MPPD(℃)(M) (M)Raney Ni (h) (％轉化率) (％產量)160 1.0 0 5 2 100 85.6160 1.0 2.05 3 100 96.4180 1.0 2.05 2 100 91.4180 1.0 3.05 2 100 89.53-氰基丙酸(3-CPRA)或4-氰基丁酸(4-CBA)銨鹽(由酶水解相應的α，ω-二腈產生)的水溶液的氫化作用分別產生相應的2-吡咯烷酮(pyrrolidinone)內酰胺和2-哌啶酮內酰胺，產量分別為91.0％和93.5％。4-氰基-4-戊烯酸(4-CPEA)銨鹽(由酶水解2-亞甲基戊二腈產生)的水溶液的氫化作用產生腈和碳-碳雙鍵的氫化作用而產生5-甲基-2-哌啶酮，產量達85％。
為限制腈氫化成胺過程中的還原性烷基化而加過量的氨(如氫氧化銨)到氫化反應中，也能發(fā)生幾種形成副產物的另外反應(De Bellefon等，《英國科學回顧目錄》(Catal.Rev.Sci.Eng.)，(1994)，第36卷，459-506)。從腈制備酰胺或羧酸的普通方法是在酸或堿催化劑存在下加熱腈混合水溶液，該方法在本領域的技術人員中眾所周知。因此，在本發(fā)明所用的氫化作用條件下，可預期的單腈羧酸銨鹽的競爭反應會是腈基的堿催化水解，而產生二羧酸單酰胺銨鹽或二羧酸二銨鹽。在氫化反應過程中產生了這些不需要的酰胺/酸和二羧酸銨鹽副產物，但是與內酰胺的產量相比較，它們的產量非常低。
在存在的過量氨和產物內酰胺之間的第二個形成副產物的反應可能產生內酰胺和預期的氨解產物即ω-氨基羧酰胺的平衡混合物。在本反應條件下得到高產量的五元和六元環(huán)內酰胺表明內酰胺產物的氨解作用(或堿催化水解)不明顯。
除了從脂肪族α，ω-二腈中產生內酰胺外，在4-CPA或3-CPA銨鹽水溶液的氫化作用中，通過甲胺對氨的取代反應制備N-甲基-內酰胺。將1～4當量的甲胺(質子化胺的pKa為10.62)加到含有1當量銨離子(pKa 9.25)的4-CPA水溶液中預計產生明顯數量的游高氨(由于在水中質子化甲胺和銨離子的pKa相對差異)。然后這種游離氨與參與在腈基的氫化作用過程中產生的中間體亞胺反應的非質子化甲胺競爭，導致產生分別為5-氨基-4-甲基戊酸銨鹽和5-N-甲基氨基-4-甲基戊酸銨鹽的混合物，結果環(huán)化分別產生5-MPPD和1，5-二甲基-2-哌啶酮(1，5 DMPD)。
已發(fā)現由1.0M 4-CPA銨鹽水溶液氫化作用產生的5-MPPD和1，5-DMPD的相對產量依賴于所選用的催化劑。Raney鎳和氫化鋁上的釕分別產生作為主要的內酰胺產物的5-MPPD，甚至在3.0M甲胺存在下也是如此，而在相同的甲胺濃度下用5％Pd/C或4.5％Pd/0.5％Pt/C作催化劑時，1，5-DMPD是主要的產物。當用5％Pd/C作催化劑時，1，5-DMPD的產量隨著甲胺濃度的增加而增加(表8)。
用Pd/C催化劑在140℃下，在1.0M 3-CPA銨鹽水溶液氫化作用中，2.0M甲胺對氨的取代分別產生了4-乙基-1-甲基吡咯烷-2-酮(4-EMPRD)和4-EPRD，產量分別為69.8％和20.4％，轉化率為96％。
表8溫度4-CPA(NH4+) CH3NH2催化劑 時間4-CPA 1，5-DMPD 5-MPPD(℃)(M) (M) (h) (％轉化率) (％轉化率) (％產量)160 1.0 3.0 Ra-Ni 2 100 19.268.5160 1.0 3.0 RuAl2O32 100 19.063.5140 1.0 3.0 Pd/C 2 99 83.40160 1.0 1.0 Pd/C 2 100 53.50160 1.0 1.25Pd/C 2 100 68.30160 1.0 1.5 Pd/C 2 100 76.40160 1.0 2.0 Pd/C 2 100 81.50160 1.0 3.0 Pd/C 2 100 81.77.8160 1.0 4.0 Pd/C 2 100 88.41.9180 1.0 3.0 Pd/C 2 97 73.06.6160 1.4 2.3 Pd/Pt/C 2 99 94.03.1
優(yōu)選的實施例方案描述方法和材料用作制備ω-腈基羧酸的微生物催化劑分離到了兩種微生物用作微生物催化劑以把脂肪族α，ω-二腈轉變成相應的ω-腈基羧酸，這些微生物是敏捷食酸菌72W(ATCC55746)和睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)。
從在得克薩斯州Orange收集的土壤中分離到了敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)。標準的富集步驟用下列培養(yǎng)基進行(E2基礎培養(yǎng)基，pH 7.2)E2基本培養(yǎng)基g/LKH2PO1.4NaH2PO40.69檸檬酸鈉 0.1CaCl2·2H2O 0.025KCl0.5NaCl 1.0MgSO4·7H2O 0.5FeSO4·7H2O 0.05CoCl2·6H2O 0.01MnCl2·4H2O 0.001ZnCl20.0005NaMoO4·2H2O0.0025NiCl2·6H2O 0.01CuSO4·2H2O 0.005生物素 0.0002葉酸 0.0002鹽酸吡哆醇 0.001核黃素 0.0005鹽酸硫胺素 0.00005煙酸 0.0005泛酸 0.0005維生素B120.00001對氨基苯甲酸 0.0005
將下列補充物加到E2基礎培養(yǎng)基中，以進行上述的富集過程菌株 富集的氮源其它補充物敏捷食酸菌72W 0.2％(v/v)乙基琥珀腈 0.3％(v/v)甘油最初篩選菌株在加濃的腈培養(yǎng)基上根據生長情況和產生的氨進行。分離體通過重復過BactoBrain Heart Infusion Agar(Difco，Detroit，Michigan)、接著從富集的腈中篩選產生的氨而純化。純化的菌株用革蘭氏陰性測試板、在Biolog測試系統(tǒng)(Hayward，CA，美國)上，根據它們的碳源利用特點加以鑒別。
為測定腈水解活性，將含10g/L葡萄糖的E2基礎培養(yǎng)基用于培養(yǎng)敏捷食酸菌72W。給培養(yǎng)基補加25mM(±)-2-甲基戊二腈。給10ml體積的補充E2培養(yǎng)基接種0.1ml冷凍貯存培養(yǎng)物。在搖床上以250rpm、室溫(22-25℃)下生長過夜后，將10ml接種物加到在2L培養(yǎng)瓶的990ml新鮮培養(yǎng)基中。以引起培養(yǎng)基中氣泡形成的足夠高的速度搖動，室溫下培養(yǎng)細胞過夜。細胞通過離心收集，用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)/15％甘油洗滌一次，將濃縮的細胞糊狀物立即在干冰上冷凍并貯存在-65℃下。將10mM己二腈也用在1升發(fā)酵液中。經16-20小時的生長后停止發(fā)酵。細胞懸液冷卻到4℃，離心收獲細胞，用含15％甘油的0.05M磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)洗滌一次后，將細胞在-60℃冷凍。將解凍的細胞糊狀物用于檢測腈水解活性。所需要的微生物特性是能區(qū)域特異地攻擊二腈化合物而不干擾酰胺酶活性的腈水解活性。微生物容易發(fā)生突變。某些突變可能對所需的腈基轉變是有利的。因此，甚至天然菌株的突變株可能用于實現本發(fā)明的方法。
將標準富集程序步驟也用于睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D，該菌用E2基礎培養(yǎng)基，pH 7.2，將該培養(yǎng)基由上述標準基礎培養(yǎng)基的維生素濃度的十分之一來修飾。下列補充物加到修飾過的E2基礎培養(yǎng)基中以進行富集過程菌株富集氮源 其它補充物睪丸酮叢毛單胞菌2-甲基戊二酰胺 甘油(0.6％)5-MGAM-4D (MGAM；1.0％w/v)
最初篩選菌株在加濃的腈基酰胺培養(yǎng)基上根據生長的情況進行。用以上培養(yǎng)基、通過重復過瓊脂板而純化分離物。純化的菌株根據它們的碳源利用特點，用革蘭氏陰性測試板在Biolog測試系統(tǒng)(Hayward，CA，美國)上進行。
為測定腈水解活性，將含6.0g/L葡萄糖或甘油修飾過的E2基礎培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細胞材料。給培養(yǎng)基添加1.0％MGAM。用一個250ml非隔板式搖動培養(yǎng)瓶，其中含50ml補充過的E2培養(yǎng)基，用0.2ml的冷凍貯存培養(yǎng)物接種，在搖床上以200rpm速度、在30℃下培養(yǎng)72小時。細胞通過離心收集，用10ml的20mM KH2PO4(pH 7.0)洗滌。在含20mMKH2PO4(pH 7.0)和0.1M的甲基戊二腈或甲基戊二酰胺的10ml反應液中，用HPLC技術從區(qū)域特異性水解作用方面篩選細胞。所需的微生物特性是能區(qū)域特異攻擊二腈化合物而不干擾酰胺酶活性的腈水解活性。微生物容易發(fā)生突變。某些突變可能對所需的腈基轉變是有利的。因此，甚至天然菌株的突變株可用于實現本發(fā)明的方法。
本發(fā)明不局限于上面提到的具體生物，而是包括應用保留所需特性的變異株和其突變株。通過已知的各種方法如X-射線輻射、紫外線輻射和化學誘變劑，上述變異株和突變株能從親本菌株中產生。
為產生生物催化劑以闡明方法(實施例1-26)，可用下列培養(yǎng)基。
菌株 培養(yǎng)基72-PF-15 Lauria-Bertani培養(yǎng)基(Bacto胰化白胨，10g/L+Bacto酵母提取物，5g/L+NaCl，10g/L)+0.5％(w/v)六水琥珀酸鈉72W E2+1％(w/v)葡萄糖+0.4％(w/v)己二酰二胺5-MGAM-4D E2+1％(w/v)葡萄糖+0.2％(w/v)丙酰胺為啟動生長，給10ml合適的培養(yǎng)基用0.1ml冷凍貯存培養(yǎng)物進行接種。在28℃、250rpm搖動生長過夜后，將生長細胞懸液轉移到在2L培養(yǎng)瓶中的1L的相同培養(yǎng)基中，28℃下?lián)u動繼續(xù)生長。然后將1L生長細胞懸液加到在10L發(fā)酵罐中的9L相同培養(yǎng)基中，繼續(xù)生長。發(fā)酵罐的參數條件是≥80％氧飽和度、25℃、pH 7.2、300-1000rpm。20～91小時后，將發(fā)酵罐冷卻到8-12℃，加甘油至終濃度為10％。細胞材料通過離心收獲。將濃縮的糊狀細胞立即在干冰上冷凍，到使用前一直貯存在-70℃。在E2基礎培養(yǎng)基中針對細胞生長，用作碳源和氮源的許多其它補充物在本領域的技術人員中眾所周知?？梢詫⑦@些以及復雜的營養(yǎng)培養(yǎng)基用于產生生物催化劑。不能認為上面所述的具體培養(yǎng)基是限制性的。
缺乏腈水合酶活性的敏捷食酸菌72W突變株的篩選在2-MGN水解成4-CPA過程中，將具有減低產生不合需要的2-甲基戊二酸副產物能力的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)突變株以不能利用2-MGN作碳和能源的特點為依據篩選出來。具體而言，將生長在LB/琥珀酸鹽培養(yǎng)基(1％(w/v)Bacto-胰化蛋白胨(Difco，Detroit，Michigan，美國)，0.5％(w/v)Bacto-酵母提取物(Difco)，1％(w/v)NaCl，0.5％(w/v)六水琥珀酸鈉)中的敏捷食酸菌72W過夜培養(yǎng)物與10μg/ml誘變劑N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍接觸約30分鐘。這導致培養(yǎng)物中活細胞降低999％。將誘變過的細胞在無菌的1M磷酸鈉鹽緩沖液(pH 7.2)中離心而洗去誘變劑。將洗滌過的細胞重新懸浮在LB/琥珀酸鹽培養(yǎng)基中并在30℃下生長過夜。然后，將細胞在無菌的50mM磷酸鈉鹽緩沖液(pH 7.2)中離心洗滌，重新懸浮在含0.2％(v/v)2-甲基戊二腈和抗生素環(huán)絲氨酸(0.2mg/ml)哌拉西林(40μg/ml)的E2極限培養(yǎng)基(沒有葡萄糖)中。將細胞在30℃下培養(yǎng)過夜并重新在無菌的50mM磷酸鈉鹽緩沖液(pH 7.2)中洗滌。將洗滌過的細胞鋪展在含非選擇培養(yǎng)基的瓊脂平板上，培養(yǎng)基即為E2極限培養(yǎng)基(沒有葡萄糖)，添加以0.2％(v/v)2-甲基戊二腈和0.5％(w/v)六水琥珀酸鈉，鋪皿的濃度為每平板40-100個菌落形成單位。將平板在30℃下溫育約48h，以使菌落形成。將形成的菌落影印到含選擇培養(yǎng)基E2極限培養(yǎng)基(沒有葡萄糖)添加0.2％(v/v)2-MGN的瓊脂平板上。將平板在30℃下約溫育48h，以使菌落形成。具有所需特性的突變體不能在選擇培養(yǎng)基上生長良好。因此，48h后比較影印過的平板，將顯示為僅在非選擇培養(yǎng)基上生長的菌株保存作進一步測定。
從89個平板中檢查了共約5，120個菌落，鑒別出了19個具有所需特性的菌株。這些突變菌株在液體的E2極限培養(yǎng)基(沒有葡萄糖)添加0.2％(v/v)2-MGN中生長以作進一步測定。將顯示為在這種培養(yǎng)基中少量或沒有生長的菌株在由E2極限培養(yǎng)基(沒有葡萄糖)添加0.2％(v/v)2-MGN和0.5％(w/v)六水琥珀酸鈉組成的液體培養(yǎng)基生長過程中，篩選它們產生2-甲基戊二酸的能力。該方法的結果是，將兩種突變株、鑒定為敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)和敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)選為進一步開發(fā)利用，因為它們極大地減少了產生2-甲基戊二酸的能力。
脂肪族α，ω-二腈的水解反應含脂肪族ω-腈基羧酸銨鹽的水溶液通過相應的脂肪族α，ω-二腈與合適的酶催化劑(在上述A部分確認)水懸液混合而制備。不用任何預處理，可將完整的微生物細胞用作催化劑?？晒┻x擇的方法有，可將它們固定在聚合物基質(如藻酸鹽珠或聚丙烯酰胺凝膠(PAG)顆粒)中或不溶性的固體支持物(如硅藻土)上，以便于回收和重新利用催化劑。把細胞固定在聚合物基質中或不溶性固體支持物上的方法已廣泛報道且在本領域的技術人員中眾所周知。也可將腈水解酶或者腈水合酶和酰胺酶從整個細胞中分離并直接用作催化劑，或把酶固定在聚合物基質中或不溶性的支持物上。這些方法也已廣泛報道且在本領域的技術人員中眾所周知。
在本發(fā)明中用作起始原料的某些脂肪族α，ω-二腈僅是中度水溶性的。它們的溶解度也依賴于水相中溶液的溫度和鹽濃度(緩沖液和/或ω-腈基羧酸銨鹽)。例如，將己二腈確定為溶解度的極限約為0.60M(25℃，20mM磷酸鹽緩沖液，pH 7)，在相同的條件下，將2-甲基戊二腈確定為溶解度的極限約為0.52M。在這種情況下，產生比起始的α，ω-二腈溶解度極限更大濃度的ω-腈基羧酸銨鹽的水溶液是使用開始時包括兩相的反應混合物實現的，兩相是指含酶催化劑和溶解的α，ω-二腈的水相和有機相(不溶解的α，ω-二腈)。隨著反應進行，二腈溶于水相中，最后得到了單一相的產物混合物。
在反應混合液中，酶催化劑的濃度依賴于酶催化劑的特殊性催化活性和選擇獲得所需的反應速率。用作水解反應催化劑的微生物細胞的濕細胞重量一般范圍為每ml總反應體積0.001克～0.100克濕細胞，優(yōu)選的范圍是每ml 0.002克～0.050克濕細胞。用已知重量的微生物細胞催化劑、通過測定25℃下把0.10M二腈底物溶液轉變成所需的ω-腈基羧酸產物的速率來確定微生物細胞的比活性(IU/克濕細胞wt.)。將酶活性的一個IU(國際單位)定義為每分鐘把1微摩爾底物轉變成產物所需要的酶活性的量。
選定的水解反應溫度使反應速度和酶催化劑活性穩(wěn)定性最優(yōu)化。反應溫度的范圍可恰在懸液冷凍點(約0℃)以上至60℃，優(yōu)選的反應溫度范圍為5℃～35℃。微生物細胞催化劑懸液可通過把細胞懸浮在蒸餾水中來制備，或者通過懸浮在維持反應起始pH 5.0～10.0，優(yōu)選的為6.0～8.0的緩沖水溶液中來制備。當反應進行時，由于從二腈的相應腈基功能形成羧酸銨鹽，所以反應混合液的pH可能會變化。不用控制pH，反應能進行到完全轉變二腈，或者在整個反應過程中加合適的酸或堿而維持所需的pH。
在α，ω-二腈完全轉變的產物混合物中，脂肪族ω-腈基羧酸銨鹽的最終濃度可從0.001M到脂肪族ω-腈基羧酸銨鹽的溶解度極限。從代表性而言，ω-腈基羧酸銨鹽的濃度范圍為0.10M～2.0M。酶催化劑通過離心和/或過濾回收后，可將水解反應的產物混合物直接用于后續(xù)的氫化反應中。通過用濃鹽酸調整反應混合液的pH為2.0～2.5，用氯化鈉飽和生成溶液以及用合適的有機溶劑、如乙酸乙酯、乙醚、或二氯甲烷提取ω-腈基羧酸的方法，也可將ω-腈基羧酸從產物混合物中(除去催化劑后)分離出來。然后，將有機提取物合并，用合適的干燥劑(如硫酸鎂)攪拌，過濾，除去溶劑(如，通過旋轉蒸發(fā)器)，以高產量和高純度(代表性純度為98-99％)地產生所需的產物。如果需要，可將產物進一步通過重結晶法或蒸餾法純化。
ω-腈基羧酸銨鹽的氫化作用/環(huán)化作用催化氫化作用是從脂肪族腈制備脂肪族胺的優(yōu)選方法。在本發(fā)明中，將在氫化作用過程中產生的ω-氨基羧酸環(huán)化成相應的五元或六元環(huán)內酰胺。ω-腈基羧酸銨鹽的水溶液(通過對酶水解相應的脂肪族α，ω-二腈而產生的含水產物混合物的離心和過濾制備)首先和濃縮的氫氧化銨及水混合，以產生含1～4個化學計量當量的所加氫氧化銨的溶液。加氫氧化銨是限制在氫化作用過程中由產物ω-氨基羧酸引起的ω-腈基羧酸的還原性烷基化作用。相對于在反應混合液中存在的ω-腈基羧酸的數量，2～3倍化學計量上過量的氫氧化銨是優(yōu)選的用量，可獲得所需內酰胺的最適產量?？蛇x擇的是，氨氣也能替代加到反應混合液中的氫氧化銨。在氫化作用反應混合液中，ω-腈基羧酸銨鹽的初始濃度范圍可以為5～20溶液重量百分比，優(yōu)選的范圍為7.5～12.5重量百分比。
為制備N-甲基內酰胺，用甲胺替代氫氧化銨或氨，相對于在反應混合液中存在的ω-腈基羧酸的數量，使用濃度為1～4個化學計量當量。為獲得所需的N-甲基內酰胺的最適產量，相對于在反應混合液中存在的ω-腈基羧酸的數量，3～4倍化學計量上過量的甲胺是優(yōu)選的用量。
然后，向上述的氫化作用反應混合液中加以合適的氫化反應催化劑，將生成的混合物在壓力下和氫氣一起加熱而把ω-腈基羧酸銨鹽轉變成相應的五元或六元環(huán)內酰胺。適用于本目的的氫化作用催化劑包括(但不局限于)各種鉑類金屬，如依、鋨、銠、釕、鉑和鈀，還有各種其它的過渡金屬如鈷、銅、鎳和鋅。催化劑可能沒有支持物(例如Raney鎳或氧化鉑)，或者可能是有支持物的(例如，在碳上的鈀，在氧化鋁上的鉑，或在硅藻土上的鎳)。
所用的氫化作用催化劑為在所選擇的反應條件下足以得到所需的反應速度和起始原料的總轉化率的最低濃度。這種濃度容易由試驗確定。所用的催化劑的量，以催化劑的重量份表示為每100份用于反應的ω-腈基羧酸中占0.001～20或更多份。代表性而言，上樣到反應混合液中的催化劑為1％～10％(催化劑重量/ω-腈基羧酸重量)，上樣催化劑3％～5％為優(yōu)選的用量。在加有氨以產生內酰胺所進行的反應中，Raney鎳(例如，促Cr-Raney鎳催化劑(Grace Davison Raney 2400活性金屬催化劑))是一種優(yōu)選的催化劑，而加有甲胺以產生N-甲基內酰胺所進行的反應中，在碳上的5％或10％的鈀或在碳上的4.5％鈀/0.5％鉑是優(yōu)選的催化劑。
氫化反應溫度和壓力變化很大。一般來說，溫度范圍可為45℃～200℃，優(yōu)選的為70℃～180℃。一般來說，氫氣壓力范圍從約大氣壓～100個大氣壓，優(yōu)選的為30～60個大氣壓。氫化作用在不調整反應混合液pH的情況下進行，一般來說，加了過量的氫氧化銨、氨或甲胺后，pH為9～12。在這種pH范圍內，準確的pH值可通過加任一種合適的、非干擾的堿或酸來調整到所需的pH。合適的堿包括(但不局限于)氫氧化堿金屬、碳酸鹽、碳酸氫鹽和磷酸鹽，而合適的酸包括(但不局限于)鹽酸、硫酸或磷酸。
在水解反應中微生物細胞催化劑的裂解或來自催化劑制備時存在的沾染物可能把抑制催化劑活性的化合物導入到氫化作用反應混合液中(如硫醇類)。當把經微生物水解產生的ω-腈基羧酸銨鹽混合液的氫化作用與氫化作用前從水解產物混合物中分離和純化的相同的ω-腈基羧酸水溶液的氫化作用相比較時，未觀察到抑制或失活氫化作用催化劑的現象。
由先過濾混合液回收氫化作用催化劑的方法，可將內酰胺或N-甲基內酰胺容易地從氫化作用產物混合物中分離，然后將產物直接從生成的水濾液中蒸餾。在環(huán)化反應過程中產生的或加到反應混合物中的氨也能用這種蒸餾法回收，循環(huán)使用，避免了作為廢產物的不合需要的無機鹽出現。內酰胺或N-甲基內酰胺也可通過下列方法回收過濾氫化作用混合液，用濃鹽酸調濾液的pH約為7并用氯化鈉飽和，用有機溶劑如乙酸乙酯、二氯甲烷或乙醚提取內酰胺或N-甲基內酰胺(水浴或連續(xù)提取)，然后通過蒸餾法或結晶法從有機提取液中回收。在所附的實施例中，報道用這種方法所分離的產量是非優(yōu)化的，該方法僅用于得到純化產物，以分析和確認化學同一性。
在下列用作進一步說明本發(fā)明但不局限于此的實施例中，脂肪族α，ω-二腈的％重獲率或在微生物水解反應中形成的水解產物的％產量是根據在反應混合液中存在的α，ω-二腈的初始數量得到(除非別處注明)并用折射率檢測儀和Supelcosil LC-18-DB柱(25cm×4.6mm直徑)或Bio-Rad HPX-87H柱(30cm×7.8mm直徑)的高壓液相色譜法測定。由ω-腈基羧酸銨鹽水溶液的氫化作用產生的內酰胺和N-甲基內酰胺的產量是依據在反應混合液中存在的ω-腈基羧酸銨鹽的初始濃度得到(除非別處注明)并用DB-1701毛細管柱(30m×0.53mm ID，1微米膜厚)的氣相色譜法測定。
實施例14-氰基戊酸(銨鹽)首先，將冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細胞(冷凍前預先50℃熱處理1h)0.60克(濕細胞重量)放入一支15ml的聚丙烯離心管中，然后加12ml的磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)。將細胞融化和懸浮后，將生成的懸液離心并丟棄上清液。將生成的細胞沉淀重懸浮在總體積12ml的相同磷酸鹽緩沖液中。將重0.1081g(0.114ml，1.00mmol，0.100M)的2-甲基戊二腈加入到第二支15ml的聚丙烯離心管中，然后加9.89ml的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的細胞懸液(0.494g細胞濕重量)，將生成的懸液在旋轉平臺上27℃時混合。吸取樣品(0.300ml)并離心，然后把0.180ml的上清液放入MilliporeUltrafree-MC濾膜裝置(10K MWCO)中并和0.020ml的0.750MN-甲基丙酰胺水溶液(HPLC外標準溶液)混合。加足量的1.0M HCl把樣品的pH降低到約2.5，過濾生成的溶液，用HPLC分析。1.0h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC產量分別為99.3％和0.7％，沒有剩余2-甲基戊二腈。
實施例2(比較性的)4-氰基戊酸(銨鹽)用在冷凍前沒有在50℃被熱處理1h的敏捷食酸菌72W(ATCC55746)細胞重復在實施例1中描述的步驟。1.0h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC產量分別為62.7％和34.6％，沒有剩余2-甲基戊二腈。
實施例34-氰基戊酸(銨鹽)首先，將冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細胞(在冷凍前預先在50℃熱處理1h)1.136克(細胞濕重量)放入一支50ml的聚丙烯離心管中，接著加21.6ml的磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)。將細胞融化懸浮后，離心生成的懸液并丟棄上清液。將生成的細胞沉淀重懸浮于總體積22.7ml的相同磷酸鹽緩沖液中。將重0.4355g(0.458ml，4.00mmol，0.403M)的2-甲基-戊二腈加入一支15ml的聚丙烯離心管中，然后加9.54ml的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細胞懸液(0.477g細胞濕重量)，將生成的懸液在旋轉平臺上27℃時混合。用蒸餾水按1∶4稀釋樣品(0.300ml)，然后離心，將0.180ml上清液放入MilliporeUltrafree MC濾膜裝置(10K MWCO)中并和0.020ml的0.750MN-甲基丙酰胺水溶液(HPLC外標準溶液)混合。加足量的1.0MHCl，把樣品的pH降低到約2.5，過濾生成的溶液并用HPLC分析。4.0h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC產量分別為99.4％和0.6％，沒有剩余2-甲基戊二腈。
實施例44-氰基戊酸(銨鹽)除了在一支15ml的聚丙烯離心管中將1.086g(1.143ml，10.04mmol，兩相反應，1.00M產物)的2-甲基戊二腈和8.86ml的熱處理敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細胞懸液(0.443g細胞濕重量)在旋轉平臺上27℃時混合外，重復實施例3中所描述的步驟。用蒸餾水按1∶10稀釋樣品(0.300ml)，然后離心，將0.180ml的上清液放入MilliporeUltrafree-MC濾膜裝置(10K MWCO)中并和0.020ml的0.750MN-甲基丙酰胺(HPLC外標準溶液)混合。加足量的1.0M HCl，把樣品的pH降低到約2.5，過濾生成的溶液并用HPLC分析。15.25h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC產量分別為98.7％和1.3％，沒有剩余2-甲基戊二腈。
實施例54-氰基戊酸(銨鹽)用沒有在50℃熱處理1h的敏捷食酸菌突變株72-PF-15(ATCC 55747)的懸液重復在實施例1中描述的步驟。3.0h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC產量分別為96.8％和3.6％，沒有剩余2-甲基戊二腈。
實施例64-氰基戊酸(銨鹽)用沒有在50℃熱處理1h的敏捷食酸菌突變株72-PF-15(ATCC 55747)的懸液重復在實施例3中所描述的步驟。將0.4355g(0.458ml，4.00mmol，0.403M)的2-甲基戊二腈和9.54ml的敏捷食酸菌突變株72-PF-15細胞懸液(0.477g細胞濕重量)的混合液在一支15ml聚丙烯離心管中于旋轉平臺上27℃時混合。6.0h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC產量分別為98.8％和1.2％，沒有剩余2-甲基戊二腈。
實施例74-氰基戊酸(銨鹽)用沒有在50℃熱處理1h的敏捷食酸菌突變株72-PF-15(ATCC 55747)的懸液重復實施例4中所描述的步驟。將1.086g(1.143ml，10.04mmol，1.00M)的2-甲基戊二腈和8.86ml的敏捷食酸菌突變株72 PF-15(ATCC 55747)細胞懸液(0.443g細胞濕重量)的混合液在一支15ml的聚丙烯離心管中在旋轉平臺上于27℃時混合。15.25h后，4-氰基戊酸和2-甲基戊二酸的HPLC產量分別為99.2％和0.8％，沒有剩余2-甲基戊二腈。
實施例84-氰基戊酸的分離將重150g(細胞濕重量)的冷凍敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細胞(冷凍前未預先在50℃熱處理1h)加入到一個裝備有磁攪拌棒的2L的三角燒瓶中。然后加磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)至總體積1.50L。細胞被融化和懸浮后，將生成的懸液在水浴中加熱至50℃1h，然后在冰/水浴中冷卻到10℃，離心，丟棄上清液。形成的細胞沉淀通過重懸浮在1.50L同樣的磷酸鹽緩沖液中、接著離心的方法洗滌一次。將洗滌過的細胞沉淀轉移到一個裝備有磁攪拌棒的4L的三角燒瓶中，然后懸浮在總體積2.5L的磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)中。隨著攪拌的同時，加129.6g(136.4ml，1.20mol，0.400M)的2-甲基戊二腈，用同樣的磷酸鹽緩沖液把終體積調整到3.00L。在25℃下攪拌混合液，在一定的時間間隔吸取樣品并用HPLC分析。21.5h后，4-氰基戊酸(4-CPA)和2-甲基戊二酸的HPLC產量分別為99.5％和0.5％，沒有剩余的2-甲基戊二腈。
離心反應混合液，回收細胞沉淀以作重新使用，將形成的上清液傾析并用Amicon 2.5L備有YM-10濾膜(10K MWCO)的濾膜裝置過濾。將濾液放入4.0L的燒瓶中，用6N HCl調溶液的pH至2.5。然后在溶液中一邊攪拌一邊加入氯化鈉，直到飽和為止，將1.0L部分的生成溶液用4×500ml乙醚提取。將合并的乙醚提取液干燥(MgSO4)，過濾，在減壓下通過旋轉蒸發(fā)器把溶液濃縮到1.0L。然后，在溶液中加入1.2L己烷和0.200ml乙醚，將產生的溶液冷卻到-78℃。將生成的白色結晶固體通過快速真空過濾并用300ml冷(5℃)己烷洗滌而分離出來。在高真空下(150毫托)移去殘留的溶劑，產生了120.3g(分離產量79％)的4-氰基戊酸(熔點31.9-32.6℃)。
實施例94-氰基戊酸(銨鹽)將從實施例8回收的細胞沉淀重新用在幾個連續(xù)的3.0L批反應中，以把2-甲基戊二腈水解成4-氰基戊酸銨鹽。在2-甲基戊二腈的濃度大于0.400M、超過了二腈在細胞水懸液中的溶解度時，這些反應作為兩相的水/有機混合物進行，直到剩余的2-甲基戊二腈能溶在反應混合液中為止。下表列出了產生的4-CPA銨鹽的最終濃度和4-CPA及2-甲基戊二二酸的產量百分比。根據細胞催化劑的干重(1克濕重＝0.20克干重)計，每克干重的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)產生了86g 4-CPA。
時間 [4-CPA(NH4)]4-CPA 2-MGArxn#(h) (M) (％產量)(％產量)1 230.4099.50.52 220.4099.10.93 461.0099.20.84 501.0099.40.65 991.8598.81.26 261 2.0098.91.1實施例103-氰基戊酸(銨鹽)首先，將冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)(冷凍前預先在50℃下熱處理1h)0.60克(細胞濕重)放入一支15ml的聚丙烯離心管中，然后加入10ml磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)。將細胞融化且懸浮后，離心形成的懸液，丟棄上清液。將產生的細胞沉淀重新懸浮在總體積10ml的相同磷酸鹽緩沖液中。將重0.1080g(0.112ml，1.00mmol，0.100M)的2-乙基琥珀腈加入到第二支15ml聚丙烯離心管中，加8.00ml的敏捷食酸菌72W細胞懸液(0.5g細胞濕重)，用磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)調整總體積至10.0ml，將生成的懸液在旋轉平臺上27℃時混合。吸取樣品(0.300ml)并離心，然后將0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中并和0.020ml、0.750M的N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外標準溶液)混合。過濾生成的溶液并用HPLC分析。1.0h后，3-氰基戊酸的HPLC產量為100％，沒有剩余2-乙基琥珀腈，也未觀察到其它副產物。
實施例113-氰基戊酸(銨鹽)用0.4337g(0.449ml，4.01mmol，0.401M)的2-乙基琥珀腈和8.00ml的熱處理過的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細胞懸液(0.5g細胞濕重)，在總體積10.0ml溶液中(用磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)調整)重復實施例10中所描述的步驟。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶4稀釋并離心，然后將0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中并和0.020ml的0.750M N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外標準溶液)混合。過濾產生的溶液并用HPLC分析。8.0h后，3-氰基戊酸的HPLC產量為100％，沒有剩余2-乙基琥珀腈，也未觀察到其它副產物。
實施例123-氰基戊酸(銨鹽)用1.087g(1.13ml，10.1mmol，兩相反應，1.01M產物)的2-乙基琥珀腈和8.00ml的熱處理過的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細胞懸液(0.5g細胞濕重)，在總體積10.0ml的溶液(用磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)調整)中重復在實施例10中所描述的步驟。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶10稀釋并離心，然后將0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中并和0.020ml的0.750M N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外標準溶液)混合。過濾產生的溶液并用HPLC分析。71h后，3-氰基戊酸的HPLC產量為100％，沒有剩余2-乙基琥珀腈，也未觀察到其它副產物。
實施例133-氰基戊酸的分離在裝備有磁攪拌棒的4.0L三角燒瓶中，放入161g冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細胞(冷凍前預先在50℃下熱處理1h)和27℃的1.60L磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)。隨著攪拌，將細胞融化并懸浮，然后，一邊攪拌，一邊加325g(336.0ml，3.00mole)的2-乙基琥珀腈，將混合液的總體積用磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)調整到2.40L。形成的混合液在27℃攪拌，吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶10稀釋，離心，然后將0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中并和0.020ml的0.750M N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外標準溶液)混合。過濾產生的溶液并用HPLC分析。183h后，3-氰基戊酸的HPLC產量為100％，沒有剩余2-乙基琥珀腈，也未觀察到其它副產物。離心反應混合液，回收細胞沉淀，可重復使用，將產生的2.3L的上清液傾析并用裝備有YM-10濾膜(10KMWCO)的Amicon 2.5L濾膜裝置過濾。在濾液中3-氰基戊酸銨鹽的濃度為1.26M。
將上述含1.26M 3-氰基戊酸銨鹽的300ml部分濾液用約60ml的6N HCl調pH至2.5，然后用氯化鈉飽和，用4×200ml的乙醚提取。將合并的有機提取液在硫酸鎂上干燥，過濾，通過在28℃、減壓下旋轉蒸發(fā)器除去溶劑。將生成的略帶黃色的粘油物28℃下在高度真空(50毫托)下攪拌，以移去殘余的溶劑，然后冷卻到-20℃2-3h，而產生成為白色結晶固體的3-氰基戊酸(45.9g，產量96％)；熔點33.0～34.0℃。
實施例143-氰基戊酸(銨鹽)用沒有在50℃熱處理過的敏捷食酸菌突變株72-PF-15(ATCC55747)的懸液，重復在實施例10中所述的步驟。1.0h后，3-氰基戊酸的HPLC產量為100％，沒有剩余2-乙基琥珀腈，也未觀察到其它副產物。
實施例153-氰基戊酸(銨鹽)用0.4325g(0.455ml，4.00mmol，6.400M)的2-乙基琥珀腈和8.00ml(0.5g細胞濕重)的沒有在50℃熱處理過的敏捷食酸菌突變株72-PF-15(ATCC 55747)的懸浮液，在總體積10.0ml溶液(用磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)調整)中重復在實施例14中所描述的步驟。25h后，3-氰基戊酸的HPLC產量為100％，沒有剩余2-乙基琥珀腈，也未觀察到其它副產物。
實施例163-氰基戊酸(銨鹽)用1.087g(1.14ml，10.1mmol，兩相反應，1.01M產物)的2-乙基琥珀腈和8.00ml(0.5g細胞濕重)的沒有在50℃熱處理過的敏捷食酸菌突變株72-PF-15(ATCC 55747)的懸液，在總體積10.0ml溶液(用磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)調整)中重復實施例14中所描述的步驟。71h后，3-氰基戊酸的HPLC產量為76.6％，有25.1％剩余的2-乙基琥珀腈，未觀察到其它副產物。
實施例174-氰基-4-戊烯酸的分離在裝備有磁攪拌棒的500ml的三角燒瓶中，放入50.0g冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細胞(冷凍前預先在50℃熱處理1h)和在27℃、450ml的磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)。隨著攪拌，將細胞融化并懸浮、然后離心、丟棄上清液。將細胞沉淀重新懸浮在1.0L燒瓶中的總體積863ml的磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)中，然后在27℃下一邊攪拌一邊加133g(137.0ml，1.25mole)的2-亞甲基戊二腈。在2-亞甲基戊二腈的濃度大于0.400M、超過了二腈在細胞水懸液中的溶解度時，這些反應以兩相水/有機混合液的方式進行，一直進行到剩余的2-亞甲基戊二腈可溶于反應混合液中為止。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶10比例稀釋，離心，然后將0.150ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)，和0.150ml的0.150M N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外標準溶液)混合。過濾產生的溶液并用HPLC分析。26h后，4-氰基-4-戊烯酸的HPLC產量為100％，沒有剩余的2-亞甲基戊二腈，也未觀察到其它副產物。離心反應混合液，回收細胞沉淀以重新使用，將上清液用裝備有YM-10濾膜(10K MWCO)的Amicon 2.5L濾膜裝置過濾。在濾液中4-氰基-4-戊烯酸銨鹽的最終濃度為1.298M。
將上述含有4-氰基-4-戊烯酸銨鹽產物混合物的100ml部分濾液用6N HCl調整到pH 2.7，用氯化鈉飽和，用4×100ml乙醚提取。將合并的有機提取液在硫酸鎂上干燥，過濾，通過28℃減壓下旋轉蒸發(fā)器把合并提取液的體積降低到100ml。在乙醚溶液中加入200ml己烷，將生成的溶液冷卻到-78℃。生成的白色結晶固體由快速真空過濾法分離并用100ml冷(5℃)己烷洗滌。將殘留的溶劑在高真空(150毫托)下除去而產生9.80g(60％分離產量)的4-氰基-4-戊烯酸(熔點26.5-27.0℃，貯存在-20℃)。
實施例184-氰基-4-戊烯酸(銨鹽)從實施例17(敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細胞)回收的細胞沉淀在把2-亞甲基戊二腈水解成4-氰基-4-戊烯酸銨鹽的第二次連續(xù)的1.0L批反應中重新使用。在2-亞甲基戊二腈的濃度大于0.400M、超過了二腈在細胞水懸液中的溶解度時，這些反應以兩相水/有機相混合液的方式進行，一直進行到剩余的2-亞甲基戊二腈可溶在反應混合液中為止。將細胞沉淀重新懸浮在1.0L燒瓶中的總體積781ml的磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)中，然后在27℃下，一邊攪拌一邊加212g(219.0ml，2.00mole)的2-亞甲基戊二腈。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶20稀釋，離心，然后將0.150ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中并與0.150ml的0.150M N-甲基丙酰胺的水溶液(HPLC外標準溶液)混合。過濾生成的溶液并用HPLC分析。53h后，4-氰基4-戊烯酸的HPLC產量為100％，沒有剩余2-亞甲基戊二腈，也未觀察到其它副產物。
實施例193-氰基丙酸(銨鹽)首先，將冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)(冷凍前預先在50℃熱處理1h)細胞0.50克(細胞濕重)放入一支15ml聚丙烯離心管中，接著加10ml的磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)。將細胞融化和懸浮后，離心形成的懸液，丟棄上清液。將產生的細胞沉淀重新懸浮在總體積10ml的同樣磷酸鹽緩沖液中。在第二支15ml的聚丙烯離心管中放入溶在總體積8.0ml的磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)中的0.3236g(4.00mmol，0.400M)的琥珀腈，然后加2.00ml的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細胞懸液(0.10g細胞濕重)，將產生的懸液在27℃下、旋轉平臺上混合。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶4比例稀釋，離心，然后將0.150ml的上清液被放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中，與0.015ml的0.1M HCl及0.150ml的0.100M丙酸的水溶液(HPLC外標準溶液)混合。過濾生成的溶液并用HPLC分析。3.0h后，3-氰基丙酸的HPLC產量為100％，沒有剩余的琥珀腈，也未觀察到其它副產物。
實施例203-氰基丙酸的分離在裝備有磁攪拌棒的500ml三角燒瓶中放入20.0g的冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細胞(冷凍前在50℃熱處理1h)和27℃下、200ml的磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)。隨著攪拌的同時，將細胞融化、懸浮、然后離心，丟棄上清液。重復該洗滌步驟。將生成的細胞沉淀重新懸浮在含101.1g(1.25mole，1.25M)的琥珀腈的總體積1.00L的磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)中，將產生的混合液在27℃下放在水浴中的1L燒瓶中攪拌。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶10稀釋，然后將0.150ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中并和0.015ml 0.1M HCl及0.150ml的0.100M丙酸水溶液(HPLC外標準溶液)混合。過濾產生的溶液并用HPLC分析。1.0h后，3-氰基丙酸和琥珀酸的HPLC產量分別為99.7％和0.3％，沒有剩余琥珀腈。離心產生的混合液，用裝備有YM-10濾膜(10KMWCO)的Amicon 2.5L濾膜裝置過濾。在濾液中3-氰基丙酸的終濃度為1.31M。
將含有上述的3-氰基丙酸銨鹽產物混合物的200ml部分濾液用6NHCl調整至pH 2.5，然后用氯化鈉飽和，用4×200ml乙醚提取。將合并的有機提取液在硫酸鎂上干燥、過濾，在減壓下通過旋轉蒸發(fā)器除去溶劑。將生成的無色油狀物溶于150ml乙醚中，然后加100ml己烷，把產生的溶液冷卻到-78℃。生成的白色結晶固體通過真空過濾法分離，在高真空下(150毫托)移去殘留的溶劑，可產生14.32g(55％分離產量)的3-氰基丙酸(熔點，49.5-51.0℃)。
實施例214-氰基丁酸(銨鹽)首先，冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)(冷凍前預先在50℃熱處理1h)0.50克(細胞濕重)放入一支15ml的聚丙烯離心管中，然后加10ml磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)。將細胞融化和懸浮后，離心產生的懸液，丟棄上清液。將產生的細胞沉淀重新懸浮在總體積10ml的相同磷酸鹽緩沖液中。在第二支15ml的聚丙烯離心管中放入溶在總體積6.0ml磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)中的0.3830g(4.03mmol，0.400M)戊二腈，然后加4.00ml的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細胞懸液(0.20g細胞濕重)，將產生的懸浮液在27℃、旋轉平臺上混合。吸取樣品(0.100ml)，用水按1∶4稀釋，然后將0.150ml的上清液被放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中，與0.015ml 0.1M HCl及0.150ml的0.150M乙酸鉀水溶液(HPLC外標準溶液)混合。過濾產生的溶液，用HPLC分析。4.0h后，4-氰基丁酸和戊二酸的HPLC產量分別為85.1％和8.2％，仍剩有5.7％戊二腈。
實施例224-氰基丁酸的分離在備有磁攪拌棒的250ml三角燒杯中放入15.0g冷凍的敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)細胞(冷凍前50℃熱處理1h)和27℃的135ml磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)。隨著攪拌的同時，將細胞融化并懸浮，然后離心，丟棄上清液。重復該洗滌步驟。將產生的細胞沉淀重新懸浮在總體積100ml的磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)中，將這種細胞懸液加入含有磁攪拌棒、42.78g(0.450mole)的戊二腈及157.2ml的磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)的500ml燒瓶中。將產生的含有1.5M戊二腈的混合液在27℃下攪拌。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶10稀釋，離心。然后，將0.200ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(0.22微米)中，與0.020ml的0.1M HCl及0.200ml的0.150M乙酸鉀水溶液(HPLC外標準溶液)混合。過濾產生的溶液并用HPLC分析。4.0h后，4-氰基丁酸銨鹽和戊二酸二銨鹽的HPLC產量分別為92.3％和7.7％，沒有剩余戊二腈。
離心反應混合液，用備有YM-10濾膜(10K MWCO)的Amicon2.5L濾膜裝置過濾上清液。將含有上面所述的4-氰基丁酸銨鹽產物混合物的濾液用6N HCl調整至pH 3.5，然后用氯化鈉飽和，用4×300ml乙醚提取。將合并的有機提取液在硫酸鎂上干燥，過濾，在減壓下通過旋轉蒸發(fā)器除去溶劑，接著在真空下(100毫托)攪拌產生35.3g(62％產量)的以停止結晶的白黃色油狀物的4-氰基丁酸。固體在1∶1乙酸乙酯/己烷5℃下重新結晶(熔點，39.6-40.2℃)。
實施例235-氰基戊酸(銨鹽)首先，將冷凍的睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC55744)細胞(冷凍前預先在50℃熱處理1h)2.0克(細胞濕重)放入一支50ml的聚丙烯離心管中，接著加30ml磷酸鉀緩沖液(20mM，pH7.0)。將細胞融化和懸浮后，離心產生的懸液，丟棄上清液。將產生的細胞沉淀重新懸浮在總體積30ml同樣的磷酸鹽緩沖液中。在第二支15ml的聚丙烯離心管中放入重0.1085g(0.114ml，1.00mmol，0.100M)的己二腈，然后加9.29ml的磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)和0.60ml的睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)細胞懸液(0.040g細胞濕重)，將產生的懸液在27℃下、旋轉平臺上混合。吸取樣品(0.300ml)，離心，然后將0.180ml的上清液被放入MilliporeUltrafree-MC濾膜裝置(10K MWCO)中，和0.020ml的0.750MN-乙基乙酰胺的水溶液(HPLC外標準溶液)混合，足量的1.0M HCl把樣品的pH降低到約pH 2.5。過濾產生的溶液并用HPLC分析。5.0h后，5-氰基戊酸、己二酰胺酸(adipamic acid)、己二酰二胺、己二酸的HPLC產量為96.6％、1.7％、1.4％和0.3％，沒有剩余己二腈。
實施例245-氰基戊酸(銨鹽)用0.4338g(0.457ml，4.01mmol，0.401M)的己二腈和3.0ml熱處理過的睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)細胞懸液(0.20g細胞濕重)，在總體積10.0ml的溶液中(用磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)調整)重復實施例23中所描述的步驟。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶4稀釋，離心，然后將0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(10K MWCO)中，和0.020ml的0.750M N-乙基乙酰胺水溶液(HPLC外標準溶液)混合，足量的1.0M HCl把樣品的pH降低到約pH 2.5。過濾產生的溶液并用HPLC分析。5.0h后，5-氰基戊酸、己二酰胺酸(adipamic acid)、己二酰二胺和己二酸的HPLC產量為94.0％、4.0％、0.6％和1.4％，沒有剩余己二腈。
實施例255-氰基戊酸(銨鹽)用1.084g(1.14ml，10.0mmol，兩相反應，1.00M產物)的己二腈和7.5ml熱處理過的睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC55744)細胞懸液(0.50g細胞濕重)，在總體積10.0ml溶液中(用磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)調整)重復實施例23中所述的步驟。吸取樣品(0.100ml)，用水以1∶10稀釋，離心，然后將0.180ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(10K MWCO)中，和0.020ml的0.750M N-乙基乙酰胺水溶液(HPLC外標準溶液)混合，足量的1.0M HCl把樣品的pH降低到約2.5。過濾產生的溶液并用HPLC分析。24.0h后，5-氰基戊酸、己二酰胺酸(adipamicacid)、己二酰二胺和己二酸的HPLC產量為90.0％、4.2％、0.0％和5.7％，沒有剩余的己二腈。
實施例265-氰基戊酸的分離在備有磁攪拌棒的2L三角燒瓶中放入在27℃1.72L磷酸鉀緩沖液(20mM，pH 7.0)中的4.0g睪丸酮叢毛單胞菌5-MGAM-4D(ATCC 55744)細胞(預先在50℃熱處理1h)的懸液。然后，一邊攪拌，一邊往懸液中加入270.4g(284.3ml，2.5mole，約1.25M最終產物濃度)的己二腈，在27℃下攪拌產生的混合液。吸取樣品(0.200ml)，用水以1∶5稀釋，離心，然后將0.200ml的上清液放入Millipore Ultrafree-MC濾膜裝置(10K MWCO)中，加足量的1.0M HCl，把樣品的pH降低到約pH 2.5。過濾產生的溶液并用HPLC分析。63h后，水解反應相當緩慢，因此加另外的10.0g相同的微生物細胞催化劑到混合液中。86h后，5-氰基戊酸、己二酰胺酸(adipamicacid)、己二酰二胺和己二酸的HPLC產量為88.2％、4.7％、6.6％和0.0％，沒有剩余己二腈。離心反應混合物，用備有YM-10濾膜(10KMWCO)的Amicon 2.5L濾膜裝置過濾上清液。
將上面所述的含有5-氰基戊酸銨鹽(1.13M)的200ml部分產物混合物濾液用6N HCl調整到pH 2.5，然后用氯化鈉飽和，用4×200ml乙醚提取。將合并的乙醚提取液在硫酸鎂上干燥，過濾，在減壓下通過旋轉蒸發(fā)器除去溶劑。將殘留的乙醚通過室溫下高真空(60毫托)中攪拌無色的液體5h除去，而產生27.32g(95％分離產量)的5-氰基戊酸。然后，將5-氰基戊酸在110-112℃、真空下(75毫托)蒸餾而毫無分解。
實施例27來自4-氰基戊酸銨鹽的5-甲基-2-哌啶酮在100ml刻度量筒中放入54.4ml含有1.85M 4-氰基戊酸銨鹽(0.1摩爾濃度的4-氰基戊酸銨鹽，通過酶水解2-甲基戊二腈產生；實施例9，從反應#5過濾產物混合液)的反應混合物水溶液，然后加12.9ml濃縮的氫氧化銨(29.3％NH3，0.2mole NH3)，將最終體積用蒸餾水調整至100ml。4-氰基戊酸銨鹽和加入的氫氧化銨的最終濃度分別為1.0M和2.0M。在產生的溶液中加入0.631g(5重量％/重量的4-氰基戊酸)的鉻促Raney鎳(Grace Davison Raney2400活潑金屬催化劑)，產生的混合液轉移到裝備有Dispersimax渦輪型推進器的300ml 314SS Autoclave Engineers EZE-Seal攪拌高壓鍋中。給反應器充氮氣后，將反應器中的內含物在500psig氫氣中以1000rpm攪拌并在160℃加熱3h。冷卻至室溫后，通過氣相色譜分析，最終反應混合液顯示5-甲基-2-哌啶酮的產量為96.4％，沒有剩余4-氰基戊酸銨鹽。
過濾產物混合液以除去催化劑，然后用6N HCl調pH至6.0，用氯化鈉飽和。用100ml二氯甲烷提取產生的溶液5次，將合并的有機提取液在硫酸鎂上干燥，過濾，在減壓下通過旋轉蒸發(fā)器除去溶劑，而產生無色的油狀物。在真空(0.1mmHg)中除去殘留的溶劑后，油狀物結晶形成白色固體，在-78℃下從150ml乙醚中重新結晶而產生6.69g(59％分離產量)的5-甲基-2-哌啶酮(熔點55.5-56.2℃)。
實施例28來自4-氰基戊酸的5-甲基-2-哌啶酮用12.71g(0.100mole)的結晶4-氰基戊酸(來自實施例8描述的分離物)和19.34ml濃縮的氫氧化銨(29.3％NH3，0.3mole NH3)，在總體積100ml溶液中重復實施例27所描述的反應。4-氰基戊酸銨鹽和氨的最終濃度分別為1.0M和2.0M。用氣相色譜分析最終的反應混合液顯示5-甲基-2-哌啶酮的產量為91.1％，沒有剩余4-氰基戊酸。
實施例29來自4-氰基戊酸銨鹽的5-甲基-2-哌啶酮含有1.0M 4-氰基戊酸銨鹽(來自實施例9、反應#5的過濾產物混合液)、0～3.0M氫氧化銨和5重量％或10重量％(相對于4-氰基戊酸的重量)選自促Cr Raney鎳催化劑(Raney 2400)、5％在碳上的鈀、10％在碳上的鈀、5％在氧化鋁上的釕或10％在氧化鋁上的釕的氫化作用催化劑的5ml含水反應混合物，其氫化作用在500psig氫氣、160℃或180℃下、在玻璃振搖器試管中進行，測定了產生的相應的5-甲基-2-哌啶酮內酰胺(5-MPPD)溫度[NH4OH] 重量％ 時間 ％4-CPA 5-MPPD(℃) 催化劑 (M) 催化劑 (h)轉化率(％)160Raney 2400 0 5 2 100 85.6160Raney 2400 2.0 5 2 100 96.4160Raney 2400 3.0 5 2 100 86.51605％Pd/C2.0 5 2 10016010％Pc/C 2.0 5 2 1401605％Ru/Al2O32.0 5 2 15016010％Ru/Al2O32.0 5 2 200180Raney 2400 2.0 5 2 100 91.4180Raney 2400 3.0 5 2 100 89.5實施例30來自3-氰基戊酸銨鹽的4-乙基吡咯烷-2-酮在100ml刻度量筒中放入含1.26M 3-氰基戊酸銨鹽(0.1mole的3-氰基戊酸銨鹽，由酶水解2-乙基琥珀腈產生；實施例13的過濾產物混合液)的79.4ml含水反應混合物，然后加12.9ml濃縮的氫氧化銨(29.3％NH3，0.2mole NH3)，用蒸餾水調整最終體積至100ml。3-氰基戊酸銨鹽和加入的氫氧化銨的終濃度分別為1.0M和2.0M。在產生的溶液中加入0.631g(5重量％/重量的3-氰基戊酸)的促鉻Raney鎳(GraceDavison Raney2400活潑金屬催化劑)，將產生的混合液轉移到裝備有Disperimax渦輪型推進器的300ml 314SS AutoclaveEngineers EZE-Seal攪拌高壓鍋中。給反應器充氮氣后，將反應器中的內含物在500psig氮氣下以1000rpm攪拌并在160℃加熱4h。冷卻到室溫后，由氣相色譜分析最終反應混合液顯示4-乙基吡咯烷-2-酮的產量為90.7％，沒有剩余3-氰基戊酸銨鹽。
實施例31來自3-氰基戊酸的4-乙基吡咯烷-2-酮用12.71g(0.100mole)的結晶3-氰基戊酸(來自實施例13所述的分離物)和19.34ml濃縮的氫氧化銨(29.3％NH3，0.3mole NH3)，在總體積100ml的溶液中重復實施例30所述的反應。3-氰基戊酸銨鹽和所加的氫氧化銨的最終濃度分別為1.0M和2.0M。用氣相色譜分析最終的反應混合液(反應時間2h)顯示4-乙基吡咯烷-2-酮的產量為92.1％，沒有剩余3-氰基戊酸。
過濾產物混合液以除去催化劑，然后用6N HCl調整pH到7.0，用氯化鈉飽和。用100ml二氯甲烷提取產生的溶液4次，將合并的有機提取液在硫酸鎂上干燥，過濾，在減壓下通過旋轉蒸發(fā)器除去溶劑，而產生無色的油狀物。在真空中(0.1mmHg)移去殘留的溶劑后，將油狀物溶在150ml的乙醚中，然后冷卻到-78℃。1h后，通過真空過濾法收集白色的已結晶的固體，而總共產生8.96g(79％分離產量)的4-乙基吡咯烷-2-酮(熔點40.5～41.5℃)。
實施例32除了用于氫化作用的溫度是140℃外，如上所述完全重復實施例30中所述的反應。通過氣相色譜法分析的最終反應混合物(4h反應時間)顯示4-乙基吡咯烷-2酮的產量為87.2％，沒有剩余3-氰基戊酸。
實施例33來自3-氰基戊酸銨鹽的4-乙基吡咯烷-2-酮除了應用1.262g(10重量％/重量的3-氰基戊酸)的促鉻Raney鎳(Grace Davison Raney2400活潑金屬催化劑)外，準確按照實施例30所描述的反應重復進行。用氣相色譜分析最終的反應混合液(反應時間1.5h)顯示4-乙基吡咯烷-2-酮的產量為91.0％，沒有剩余3-氰基戊酸。
實施例34來自3-氰基戊酸銨鹽的4-乙基吡咯烷-2-酮(溫度依賴性)含有1.0M 3-氰基戊酸(3-CPA)銨鹽(從實施例13來的過濾產物混合液)、2.0M氫氧化銨和5重量％或10重量％的促Cr-Raney鎳催化劑(Raney 2400)(相對于3-氰基戊酸的重量)的5ml含水反應混合物的氫化作用在500psig氫氣和溫度從70℃～180℃下在玻璃振搖器試管中進行2h，然后，用高壓液相色譜分析3-CPA的轉化率，用氣相色譜分析產生的4-乙基吡咯烷-2-酮溫度3-CPA銨鹽 [NH4OH]重量％時間3-CPA 4-EPRD(℃)(M) (M)Raney Ni (h) (％轉化率) (％產量)70 1.0 2.05 2 7 1.5120 1.0 2.05 2 55 22.7140 1.0 2.05 2 71 55.4140 1.0 2.0102 100 89.9160 1.0 2.05 2 100 90.1160 1.0 2.0102 100 91.3180 1.0 2.05 2 100 86.1180 1.0 2.0102 100 90.0實施例35來自3-氰基戊酸銨鹽的4-乙基吡咯烷-2-酮(NH4OH濃度依賴性)含有1.0M 3-氰基戊酸(3-CPA)銨鹽(來自實施例13的過濾產物混合液)、0～3.0M氫氧化銨和5重量％的促Cr-Raney鎳催化劑(Raney2400)(相對于3-氰基戊酸的重量)的5ml含水反應混合物的氫化作用在500psig氫氣和160℃或180℃溫度下在玻璃振搖器試管中進行2h，然后用高壓液相色譜分析3-CPA的轉化率，用氣相色譜分析產生的4-乙基吡咯烷-2-酮
溫度3-CPA銨鹽 [NH4OH]重量％時間3-CPA 4-EPRD(℃)(M) (M)Raney Ni (h) (％轉化率) (％產量)160 1.0 0 5 2 99 80.1160 1.0 1.05 2 99 87.6160 1.0 2.05 2 100 90.1160 1.0 3.05 2 100 85.4180 1.0 0 5 2 100 75.1180 1.0 1.05 2 100 85.8180 1.0 2.05 2 100 88.5180 1.0 3.05 2 100 90.0實施例36來自3-氰基戊酸銨鹽的4-乙基吡咯烷-2-酮(3-CPA濃度依賴性)將分別含有1.0M、1.5M或2.0M的3-氰基戊酸(3-CPA)(從實施例13過濾產物混合液中分離)和2.0M、3.0M或4.0M氫氧化銨的5ml含水反應混合物的氫化作用，用如5重量％的促Cr-Raney鎳催化劑(Raney 2400)(相對于3-氰基戊酸的重量)在500psig氫氣和160℃或180℃溫度下在玻璃振搖器試管中進行2h，然后用高壓液相色譜分析3-CPA的轉化率，用氣相色譜分析產生的4-乙基吡咯烷-2-酮溫度 3-CPA銨鹽 [NH4OH]重量％時間3-CPA 4-EPRD(℃) (M) (M)Raney Ni (h) (％轉化率) (％產量)1601.0 2.05 2 100 90.11601.5 3.05 2 99 76.11602.0 4.05 2 99 80.01801.0 2.05 2 100 88.51801.5 3.05 2 99 77.31802.0 4.05 2 99 84.1實施例37
來自5-氰基戊酸銨鹽的己內酰胺將含有1.0M 5-氰基戊酸(5-CPA)銨鹽(從酶水解己二腈制備，來自實施例26的過濾產物混合液)，0～2.5M氫氧化銨和5重量％的促Cr-Raney鎳催化劑(Raney 2400)(相對于5-氰基戊酸的重量)的5ml含水反應混合物的氫化作用在500psig氫氣和70℃～160℃溫度下在玻璃振搖器試管中進行2h，然后用高壓液相色譜分析5-CPA的轉化率，用氣相色譜分析產生的己內酰胺溫度5-CPA銨鹽 [NH4OH]時間5-CPA 己內酰胺(℃)(M) (M)(h) (％轉化率) (％產量)70 1.0 0 2 100 0.770 1.0 1.02 100 0.770 1.0 1.52 94 0.870 1.0 2.02 84 0.870 1.0 2.52 99 0.8120 1.0 0 2 99 0.9120 1.0 1.02 100 0.9120 1.0 1.52 97 1.0120 1.0 2.02 97 1.1160 1.0 0 2 97 2.5160 1.0 1.02 84 2.3160 1.0 1.52 97 3.0160 1.0 2.02 95 2.7通過在70℃下5-CPA銨鹽的氫化作用而制備的含水產物混合物中(如上所述)6-氨基己二酸(6-ACA)銨鹽的環(huán)化由下列方法在較高溫度下設法實現首先用過濾法除去氫化作用催化劑，然后在280℃下，加熱約1.0M 6-ACA銨鹽反應混合液2h
溫度6-ACA銨鹽(M) [NH4OH]時間己內酰胺(℃)(按上述方法制備)(M)(h) (％產量)280 1.0 0 2 17.8280 1.0 1.02 17.2280 1.0 1.52 11.0280 1.0 2.02 9.0280 1.0 2.52 3.1實施例38來自4-氰基戊酸銨鹽的1，5-二甲基-2-哌啶酮含有1.0M 4-氰基戊酸銨鹽(來自實施例9、反應#5的過濾產物混合液)、3.0M甲胺和5重量％或10重量％(相對于4-氰基戊酸的重量)選自促Cr-Raney鎳催化劑(Raney 2400)、5％在碳上的鈀、5％在氧化鋁上的鈀、5％在氧化鋁上的釕、或在碳上的4.5％鈀/0.5％鉑的氫化作用催化劑的5ml含水反應混合物，其氫化作用在500psig氫氣和160℃下，在玻璃振搖器試管中進行2h，然后分析產生的1，5-二甲基-2-哌啶酮(5-DMPD)和5-甲基-2-哌啶酮(5-MPPD)溫度重量％時間 4-CPA 5-DMPD5-MPPD(℃)催化劑 催化劑(h) (％轉化率) (％產量) (％產量)160 Raney 2400 52100 19.2 68.5160 Raney 2400 10 2100 21.7 69.1160 5％Ru/Al2O352100 19.0 63.5160 5％Pd/C 5299 81.7 7.8160 5％Pd/Al2O35293 77.2 4.6160 4.5％Pd/0.5％Pt/C5297 77.8 6.2實施例39來自4-氰基戊酸銨鹽的1，5-二甲基-2-哌啶酮含有1.0M 4-氰基戊酸銨鹽(來自實施例9、反應#5的過濾產物混合液)、1.0M～3.0M甲胺和5重量％(相對于4-氰基戊酸的重量)的5％在碳上的鈀的5ml含水反應混合物，其氫化作用在500psig氫氣和140℃下，在玻璃振搖器試管中進行2h，然后分析產生的1，5-二甲基-2-哌啶酮(5-DMPD)、5-甲基-2-哌啶酮(5-MPPD)和2-甲基戊二酸(2-MGA)溫度時間 [CH3NH2] 4-CPA 5-DMPD5-MPPD 2-MGA(℃) 催化劑 (h)(M) (％轉化率) (％產量) (％產量) (％產量)140 5％Pd/C2 1.0 100 53.3 0 0.7140 5％Pd/C2 1.25 100 65.8 0 0.7140 5％Pd/C2 1.5 99 74.5 0 0.8140 5％Pd/C2 2.0 98 80.2 0 1.0140 5％Pd/C2 3.0 99 83.4 0 1.1實施例40來自4-氰基戊酸銨鹽的1，5-二甲基-2-哌啶酮含有1.0M 4-氰基戊酸銨鹽(來自實施例9、反應#5的過濾產物混合液)、1.0M～4.0M甲胺和5重量％(相對于4-氰基戊酸的重量)的5％在碳上的鈀的5ml含水反應混合物，其氫化作用在500psig氫氣和160℃下，在玻璃振搖器試管中進行，然后分析產生的1，5-二甲基-2-哌啶酮(5-DMPD)、5-甲基-2-哌啶酮(5-MPPD)和2-甲基戊二酸(2-MGA)溫度 時間[CH3NH2] 4-CPA 5-DMPD5-MPPD 2-MGA(℃) 催化劑(h) (M) (％轉化率) (％產量) (％產量) (％產量)160 5％Pd/C 2 1.0 100 53.5 0 0.7160 5％Pd/C 2 1.25 100 68.3 0 0.8160 5％Pd/C 2 1.5 100 76.4 0 0.9160 5％Pd/C 2 2.0 100 81.5 0 1.8160 5％Pd/C 2 3.0 99 81.7 7.8 3.3160 5％Pd/C 2 4.0 99 88.4 1.9 2.6實施例41
來自4-氰基戊酸銨鹽的1，5-二甲基-2-哌啶酮含有1.0M 4-氰基戊酸銨鹽(來自實施例9、反應#5的過濾產物混合液)，3.0M～4.0M甲胺和5重量％(相對于4-氰基戊酸的重量)的5％在碳上的鈀或在碳上的4.5％鈀/0.5％鉑的5ml含水反應混合物，其氫化作用在500psig氫氣和180℃下，在玻璃振搖器試管中進行2h，然后分析產生的1，5-二甲基-2-哌啶酮(5-DMPD)、5-甲基-2-哌啶酮(5-MPPD)和2-甲基戊二酸(2-MGA)溫度 [CH3NH2]4-CPA 5-DMPD5-MPPD2-MGA(℃) 催化劑 (M) (％轉化率) (％產量) (％產量) (％產量)1805％Pd/C 3.0 97 73.0 6.6 -1804.5％Pd/0.5％Pt/C3.0 96 69.0 1.9 23.91805％Pd/C 4.0 95 66.6 2.6 33.5實施例42來自4-氰基戊酸銨鹽的1，5-二甲基-2-哌啶酮在100ml刻度量筒中放入54.4ml的含有1.84M 4-氰基戊酸銨鹽(0.1mole的4-氰基戊酸銨鹽，通過酶水解2-甲基戊二腈產生；實施例9，來自反應#5過濾產物混合液)的含水反應混合物，然后加25.8ml的40重量％甲胺(9.31g甲胺，0.3mole)，用蒸餾水調整最終體積至100ml。4-氰基戊酸銨鹽和甲胺的最終濃度分別為1.0M和3.0M。往產生的溶液中加入0.636g(5重量％重量的4-氰基戊酸)在碳粉末上的5％Pd，把產生的混合液轉移到裝備有Dispersimax渦輪型推進器的300ml 314SSAutoclave Engineers EZE-Seal攪拌高壓鍋中。在反應器中通入氮氣后，將反應器的內含物在500psig氫氣下以1000rpm攪拌并在160℃加熱4h。經取樣管移取樣品(約1.5ml)以分析整個反應過程。冷卻到室溫后，通過氣相色譜分析最終反應混合液顯示1，5-二甲基-2-哌啶酮的產量為72.8％，5-甲基-2-哌啶酮的產量為3.5％，2-甲基戊二酸的產量為19.9％，沒有剩余4-氰基戊酸銨鹽。
過濾產物混合液(取樣后61ml)而除去催化劑，然后用6N HCl調pH至7.0并用氯化鈉飽和。用100ml乙醚提取產生的溶液4次，將合并的有機相提取物在硫酸鎂上干燥，過濾，并在減壓下通過旋轉蒸發(fā)器除去溶劑而產生無色的液體。將該液體在3.5 Torr下蒸餾，并收集在70.0～71.5℃沸騰的級分，而產生4.65g(60％分離產量)的1，5-二甲基-2-哌啶酮(5-DMPD)。
實施例43來自3-氰基戊酸銨鹽的4-乙基-1-甲基吡咯烷-2-酮在100ml刻度量筒中放入79.4ml含有1.26M 3-氰基戊酸銨鹽(0.1mole的3-氰基戊酸銨鹽，通過酶水解2-乙基琥珀腈產生；實施例13過濾產物混合液)的含水反應混合物，然后加17.2ml的40重量％甲胺(6.21g甲胺，0.2mole)，用蒸餾水調整最終體積到100ml。3-氰基戊酸銨鹽和甲胺的最終濃度分別為1.0M和2.0M。往產生的溶液中加入0.636g(5重量％/重量的3-氰基戊酸)在碳粉末上的5％Pd，把產生的混合液轉移到裝備有Dispersimax渦輪型推進器的300ml 314SSAutoclave Engineers EZE-Seal攪拌高壓鍋中。在反應器中通入氮氣后，將反應器中的內含物在500psig氫氣下以1000rpm攪拌并在140℃加熱4h。經取樣管移取樣品(約1.5ml)以分析整個反應過程。冷卻到室溫后，通過氣相色譜分析最終反應混合液顯示4-乙基-1-甲基吡咯烷-2-酮的產量為69.8％，4-乙基吡咯烷-2-酮的產量為20.4％，沒有剩余3-氰基戊酸銨鹽。
過濾產物混合液(取樣后80ml)以除去催化劑，然后用6N HCl調整到pH 7.0并用氯化鈉飽和。用100ml二氯甲烷提取產生的溶液4次，將合并的有機提取液在硫酸鎂上干燥，過濾，在減壓下通過旋轉蒸發(fā)器除去溶劑而產生無色的液體。將該液體在16 Torr下分餾，收集在100℃沸騰的級分(5.15g，51％產量)。產生的4-乙基-1-甲基-吡咯烷酮-2-酮含有＜5％的4-乙基吡咯烷-2-酮不純物，所以將該液體在40 Torr下重蒸餾，并收集在128℃沸騰的級分而產生3.71g(37％分離產量)的4-乙基-甲基吡咯烷-2-酮(4-EMPRD)。
實施例44來自4-氰基-4-戊烯酸銨鹽的5-甲基-2-哌啶酮在100ml刻度量筒中放入77.0ml含有1.30M 4-氰基-4-戊烯酸銨鹽(0.1mole的4-氰基戊烯酸銨鹽，通過酶水解2-亞甲基戊二腈產生；實施例17)的含水反應混合物，然后加12.9ml濃縮的氫氧化銨(29.3％NH3，0.2mole NH3)，用蒸餾水調整最終體積到100ml。4-氰基-4-戊烯酸銨鹽和所加的氫氧化銨最終濃度分別為1.0M和2.0M。往產生的溶液中加入0.626g(5重量％/重量的4-氰基-4-戊烯酸)的鉻促Raney鎳(Grace Davison Raney2400活潑金屬催化劑)，把產生的混合液轉移到裝備有Dispersimax渦輪型推進器的300ml 314SS AutoclaveEngineers EZE-Seal攪拌高壓鍋中。在反應器中通入氮氣后，將反應器中的內含物在500psig氫氣下以1000rpm攪拌，并在50℃加熱5h，然后在160℃再加熱3h。冷卻到室溫后，通過氣相色譜分析最終反應混合液顯示5-甲基-2-哌啶酮的產量為85.0％，沒有剩余4-氰基-4-戊烯酸銨鹽。
實施例45來自3-氰基丙酸銨鹽的2-吡咯烷酮(Pyrrolidinone)在100ml的刻度量筒中放入78.5ml含有1.31M 3-氰基丙酸銨鹽(0.1mole的3-氰基丙酸銨鹽，通過酶水解琥珀腈產生；實施例20)的含水反應混合物，然后加19.4ml濃縮的氫氧化銨(29.3％NH3，0.3moleNH3)，用蒸餾水把最終體積調整到100ml。3-氰基丙酸銨鹽和所加的氫氧化銨的最終濃度分別為1.0M和3.0M。往產生的溶液中加入0.99g(10重量％/重量的3-氰基丙酸)的促鉻Raney鎳(Grace Davison Raney2400活潑金屬催化劑)，把產生的溶液轉移到裝備有Dispersimax渦輪型推進器的300ml 314SS Autoclave Engineers EZE-Seal攪拌高壓鍋中。給反應器通入氮氣后，將反應器中的內含物在500psig氫氣下以1000rpm攪拌，并在70℃加熱4.5h，然后180℃再加熱5h。用氣相色譜分析顯示2-吡咯烷酮(Pyrrolidinone)的產量為91.0％，沒有剩余3-氰基丙酸銨鹽。
實施例46來自4-氰基丁酸銨鹽的2-哌啶酮重復實施例22中所述的步驟。4.0h后，4-氰基丁酸銨鹽和戊二酸二銨鹽的HPLC產量分別為91.7％和7.5％，沒有剩余戊二腈。4-氰基丁酸銨鹽在離心和過濾過的反應混合液中的最終濃度為1.42M。在100ml刻度量筒中放入70.6ml(0.100mole的4-氰基丁酸銨鹽)的過濾含水產物混合物，然后加19.4ml的濃縮的氫氧化銨(29.2％NH3，0.3mole NH3)，用蒸餾水把最終體積調整到100ml。4-氰基丙酸銨鹽和所加的氫氧化銨最終濃度分別為1.0M和3.0M。往產生的溶液中加入1.13g(10重量％/重量的4-氰基丁酸)的促鉻Raney鎳(Grace Davison Raney2400活潑金屬催化劑)，把產生的溶液轉移到裝備有Dispersimax渦輪型推進器的300ml 31 4SS Autoclave Engineers EZE-Seal攪拌高壓鍋中。給反應器通入氮氣后，將反應器中的內含物在500psig氫氣下以1000rpm攪拌，并在70℃加熱3.5h。用氣相色譜分析顯示2-哌啶酮的產量為29.7％，沒有剩余4-氰基丁酸銨鹽。把溫度提高到180℃，再加熱2h，接著用氣相色譜分析樣品顯示2-吡咯烷酮(Pyrrolidinone)的產量為93.5％。
實施例47來自4-氰基戊酸銨鹽的5-甲基2-哌啶酮將含有1.85M 4-氰基戊酸銨鹽(0.1mole的4-氰基戊酸銨鹽，通過酶水解2-甲基戊二腈產生；實施例9，來自反應#5的過濾產物混合液)、5.6g的29％氫氧化銨水溶液和44ml D.I.水的50毫升混合水溶液轉移到300ml高壓鍋中。往該溶液中加入0.73g(3重量％，以4-氰基戊酸為主)在碳上的4.5％Pd/0.5％Pt催化劑。密封高壓鍋，用氮氣清洗三次，接著在100psig氫氣和緩慢攪拌下加熱至160℃。160℃時，把壓力提高到800psig，開始最大速度的攪拌。3小時后，冷卻反應器，排氣，用氮氣清洗。產物混合液氣相色譜分析顯示4-氰基戊酸的轉化率為96％且5-甲基-2-哌啶酮的產量為95.5％(99.5％選擇性)。
實施例48來自4-氰基戊酸銨鹽的1，5-二甲基-2-哌啶酮將含有1.85M 4-氰基戊酸銨鹽(0.2mole的4-氰基戊酸銨鹽，通過酶水解2-甲基戊二腈產生；實施例9，來自反應#5過濾產物混合液)，和14g(0.2mole)的40％甲胺水溶液的100毫升混合水溶液轉移到300ml高壓鍋中。往該溶液中加入在碳上的4.5％Pd/0.5％Pt催化劑。密封高壓鍋，用氫氣清洗3次，在100psig氫氣和緩慢攪拌下加熱反應液。在反應溫度下，提高壓力，開始最大速度的攪拌。一定的反應時間后，冷卻反應器，排氣，用氮氣清洗。將氣相色譜分析在不同的反應條件下幾種操作的產物混合液的結果總結如下溫度 H2裝入的催化劑 時間 4-CPA 5-DMPD5-MPPD(℃)(psig) (wt％)(h) (％轉化率) (％產量) (％產量)
175 300 7.439967.828.2160 500 10 29968.628.1145 500 10 29365.226.4實施例49來自4-氰基戊酸銨鹽的1，5-二甲基-2-哌啶酮用不同的在碳上的Pd催化劑，4-氰基戊酸銨鹽的氫化作用在5ml玻璃振搖器試管中在800psig下進行。將1.85M(7mmoles)5-氰基戊酸水溶液(來自實施例9、反應#5的過濾產物混合液)、0.88g(11.4mmoles)40％甲胺和選自5％Pd/C及4.5％Pd/0.5％Pt/C的催化劑共4毫升轉移到試管中并進行反應3小時。冷卻到25℃后，將氣相色譜分析在不同反應條件下產生的產物混合液的結果總結如下溫度 裝入的催化劑 時間 4-CPA 5-DMPD5-MPPD(℃) 催化劑 (wt％)(h)(％轉化率)(％產量) (％產量)1605％Pd/C1.2 2 9991.8 5.01604.5％Pd/0.5％Pt/C 0.7 2 9994.0 3.11505％Pd/C0.7 2 9992.5 2.權利要求
1.一種選擇兩種酶活性之一的方法，所述的酶活性選自區(qū)域選擇性水解酶活性或腈水合酶活性，這些酶活性能催化脂肪族α，ω-二腈轉化成相應的ω-氰基羧酸銨鹽，該方法包括把完整的細胞催化劑加熱到約35℃～70℃的溫度，持續(xù)10～120分鐘，完整的細胞催化劑的特征為合乎需要的區(qū)域選擇性腈水解酶活性或腈水合酶活性以及不合需要的非區(qū)域選擇性腈水解酶或腈水合酶活性，其中使不合需要的非區(qū)域選擇性的腈水解酶活性或腈水合酶活性變性，而將合乎需要的區(qū)域選擇性腈水解酶或腈水合酶活性保留。
全文摘要
本發(fā)明開發(fā)了一種從脂肪族α，ω－二腈中制備五元環(huán)或六元環(huán)內酰胺的方法。在該方法中，首先使用一種具有脂肪族腈水解酶(EC 3.5.5.7)活性或腈水合酶(EC 4.2.1.84)與酰胺酶(EC 3.5.1.4)活性組合的催化劑將脂肪族α，ω－二腈轉化成ω－腈基羧酸銨鹽的水溶液。然后，不分離中間體ω－腈基羧酸或ω－氨基羧酸，直接通過水溶液中的氫化作用將這種ω－腈基羧酸銨鹽轉化成相應的內酰胺。當脂肪族α，ω－二腈在α－碳原子位也被不對稱地取代時，由于ω－腈基的水解作用具有98％以上的區(qū)域選擇性，腈水解酶產生了ω－腈基羧酸銨鹽，因而在后續(xù)的氫化作用過程中僅產生兩種可能的內酰胺產物中的一種。本發(fā)明還提供了一種用于選擇合乎需要的區(qū)域選擇性腈水解酶或腈水合酶活性而破壞不合乎需要的活性的熱處理方法。
文檔編號C07D211/76GK1554768SQ20041004889
公開日2004年12月15日 申請日期1997年5月7日 優(yōu)先權日1996年5月17日
發(fā)明者R·迪科斯莫, R·D·法爾隆, J·E·加瓦甘, F·E·赫爾克斯, R 迪科斯莫, 加瓦甘, 法爾隆, 赫爾克斯 申請人:納幕爾杜邦公司