食品中致病菌檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種食品中致病菌檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器，屬于食品中致病 菌的檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物的快速檢測對臨床檢驗、食品安全以及環(huán)境監(jiān)測都是至關(guān)重要的。據(jù)WHO 估計，全世界每年發(fā)生食源性疾病數(shù)十億人，每年約有二百萬兒童死于腹瀉.其中66%以 上是由致病菌所致。食品中致病菌一般包括沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結(jié) 腸炎耶爾森氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸出血性大腸桿菌〇157:H7、副溶 血性弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌等，其中以沙門氏菌、大腸桿菌0157 :H7、李斯特 氏菌、副溶血弧菌等引起的食源性疾病尤為突出。因此，建立對食品中不同致病菌的快速、 準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、簡便的檢測方法，對保障食品安全十分必要。
[0003] 目前食品衛(wèi)生中常規(guī)的微生物檢測方法是增菌培養(yǎng)、平板計數(shù)法，由于其檢測周 期長、工作量大、容易造成誤差、漏檢率高、程序復(fù)雜等缺點已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測要求。 隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和分子細(xì)菌學(xué)研宄的開展，特別是免疫學(xué)、生物化學(xué)、分子生 物學(xué)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了一些較為先進(jìn)的、快速的檢測方法，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)、多重 PCR、熒光PCR、免疫學(xué)檢測、質(zhì)譜測定、DNA探針法等檢測方法，但是大都普遍存在儀器成本 昂貴、操作復(fù)雜等缺點，不易在實際應(yīng)用中普及和現(xiàn)場快速檢測和診斷。
[0004] 生物傳感器是近幾十年來發(fā)展起來的一種新的傳感器技術(shù)，它是利用生物活性材 料（酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原、生物膜等）與物理化學(xué)換能器（電化學(xué)、光學(xué)、機(jī)械、熱、 電、磁等）有機(jī)結(jié)合構(gòu)成的一種生物信息檢測分析工具。生物傳感器由于其獨特的優(yōu)勢， 如能在渾濁溶液中操作、選擇性好、靈敏度高等，其所測的信號通常是電信號的變化，可以 直接測量，便于儀器自動化、小型化和智能化。然而傳統(tǒng)的生物傳感器的分析操作步驟太 多、分析周期長、價格昂貴、體積大、昂貴的光學(xué)檢測設(shè)備及需要訓(xùn)練有素的專業(yè)人員才能 完成等。近年來，由于免疫磁珠技術(shù)的不斷進(jìn)展和微傳感器技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們提出了 將微納磁傳感器并結(jié)合磁性標(biāo)簽研制用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、毒物學(xué)等生物信息探測 的新型生物傳感器。利用磁傳感器并結(jié)合磁性標(biāo)簽用于探測生物分子的理念最早是由美 國海軍實驗室的Baselt等[BaseltD.R.,LeeG.U.，NatesanM.，MetzgerS.W.,Sheehan P.E.,ColtonR. ,Abiosensorbasedonmagnetoresistancetechnology,Biosens. Bioelectr. 17(1998)731.]于1998年提出的，由此開啟了磁生物傳感器研宄的熱潮。
[0005]經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Kurlyandskaya等（Kurlyandskaya G. V.，Sanchez M.L.，Hernando B.)在《Appl.Phys.Lett.》（美國應(yīng)用物理快報）《Vol.82，pp.3〇53,2〇〇3》 首次提出使用巨磁阻抗效應(yīng)傳感器來探測磁性納米粒子，并利用CoFeMoSiB非晶帶材制 備了探測裝置，成功實現(xiàn)了對商業(yè)FerroHuicf液體中磁性納米粒子以及Dynabeads1 M-450磁珠的探測。2007年，Kurlyandskaya等（A. Kumar, S. Mohapatra, V. F. Miyar, A. Cerdeira,J.A. Garcia, H. Srikanth,J.Gass and G. V. Kurlyandskaya)在〈〈Appl. Phys. Lett.》（美國應(yīng)用物理快報）《Vol. 91，pp. 143902, 2007》報道了利用巨磁阻抗效應(yīng)傳感器 對吞噬Fe304納米粒子的人體胚腎細(xì)胞（HEK293)進(jìn)行檢測，證明了巨磁阻抗效應(yīng)在生物醫(yī) 學(xué)檢測領(lǐng)域的可行性，但該研宄工作只是得到了巨磁阻抗效應(yīng)傳感器對Fe304磁性納米粒 子的響應(yīng)，沒有實現(xiàn)對細(xì)胞樣品的標(biāo)記和分型檢測。
[0006] 隨著微機(jī)電系統(tǒng)（MEMS)技術(shù)的發(fā)展，利用MEMS技術(shù)制備的微流控芯片已應(yīng)用于 生物與醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，而MEMS技術(shù)同樣可用來制造小型化、集成化的巨磁阻抗效應(yīng)傳感 器。將生物信息的固定與小型化巨磁阻抗效應(yīng)傳感器相結(jié)合構(gòu)建新型致病菌檢測系統(tǒng)，利 用磁性標(biāo)簽對致病菌進(jìn)行檢測，具有重要的研宄意義和臨床價值。通過文獻(xiàn)和專利檢索，沒 有發(fā)現(xiàn)關(guān)于將巨磁阻抗效應(yīng)傳感器用于致病菌檢測的相關(guān)研宄成果。
[0007] 中國專利申請?zhí)枮?01210397978. 7,公開號102937649A，該專利公開了一種血清 腫瘤標(biāo)志物檢測的微型化磁通門生物傳感器，包括微型化磁通門傳感器、生物芯片、施加軸 向磁場的螺線管線圈、以及與微型化磁通門傳感器連接的信號采集系統(tǒng)，其中：所述生物芯 片位于微型化磁通門傳感器的敏感軸上，所述生物芯片由位于玻璃基片上的Au膜、位于Au 膜上的生物敏感膜、位于生物敏感膜上的磁性標(biāo)簽組成。但是該發(fā)明專利只是針對血清腫 瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測，無法實現(xiàn)對致病菌的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種食品中致病菌檢測的巨磁阻抗 效應(yīng)生物傳感器。該巨磁阻抗效應(yīng)傳感器芯片采用MEMS加工工藝制作，與致病菌捕獲芯片 配套使用，與配套的檢測電路一起可實現(xiàn)整個系統(tǒng)的小型化，對致病菌的檢測，具有檢測芯 片面積大，檢測靈敏度高，不需要對生物樣本進(jìn)行增菌培養(yǎng)和PCR擴(kuò)增，可以直接檢測液體 食品中的致病菌，其檢測靈敏度為l〇-l〇〇CFU/ml。
[0009] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述食品中致病菌檢測的巨磁阻抗效應(yīng)生物傳感器包 括巨磁阻抗效應(yīng)傳感器芯片、致病菌捕獲芯片、施加軸向磁場的磁芯螺線管線圈、以及與 巨磁阻抗效應(yīng)傳感器連接的信號采集系統(tǒng)，其中：所述致病菌捕獲芯片由玻璃基片上的Au 膜、Au膜上修飾了一層生物敏感膜、生物敏感膜固定了致病菌單克隆抗體，致病菌單克隆抗 體捕獲帶有磁性標(biāo)簽的致病菌，致病菌與生物素修飾的致病菌單克隆抗體結(jié)合，致病菌通 過生物素與親和素作用與磁性標(biāo)簽相連，磁性標(biāo)簽為鏈酶親和素修飾的磁性納米粒子或由 其構(gòu)成的磁珠，采用磁分離技術(shù)對帶有磁性標(biāo)簽的致病菌進(jìn)行富集和分離。
[0010] 優(yōu)選地，上述的巨磁阻抗效應(yīng)傳感器芯片由位于玻璃基片上的F/Cu/F(F=軟磁 薄膜）多層膜構(gòu)成，Cu膜寬度小于軟磁薄膜F的寬度，傳感器外形呈曲折形結(jié)構(gòu)，并采用 MEMS工藝制作，其中軟磁薄膜F為NiFe薄膜或CoZrNb薄膜或CoFeSiB薄膜等。
[0011] 優(yōu)選地，所述的致病菌捕獲芯片上的Au膜為濺射的Cr/Au薄膜，用于修飾生物敏 感膜；所述的生物敏感膜可以連接各種致病菌單克隆抗體，致病菌單克隆抗體可以和被檢 測的致病菌結(jié)合。致病菌與生物素修飾的致病菌單克隆抗體結(jié)合，致病菌通過生物素與親 和素作用與磁性標(biāo)簽相連，磁性標(biāo)簽為鏈酶親和素修飾的磁性納米粒子或由其構(gòu)成的磁 珠，采用磁分離技術(shù)對致病菌進(jìn)行富集和分離。
[0012] 優(yōu)選地，所述施加軸向磁場的磁芯螺線管線圈為一繞制在PVC上的小型化磁芯螺 線管線圈，通過外接的直流電源產(chǎn)生軸向均勻磁場，磁場高達(dá)l〇〇〇e，而空心的螺線管是無 法達(dá)到的；巨磁阻抗效應(yīng)傳感器的敏感軸放置在磁芯螺線管線圈的軸向位置上，致病菌捕 獲芯片位于巨磁阻抗效應(yīng)傳感器芯片的上方，間距不超過100ym。
[0013] 優(yōu)選地，所述生物敏感膜連接各種致病菌單克隆抗體，致病菌單克隆抗體捕獲被 檢測的帶有磁性標(biāo)簽的致病菌。
[0014] 優(yōu)選地，所述的信號采集系統(tǒng)為HP4294A或E4991A阻抗分析儀或采用信號發(fā)生 器、交流恒流源、鎖相放大原理等構(gòu)成的信號采集系統(tǒng)，可測量磁性標(biāo)簽引起的阻抗大小 或電壓信號與檢測致病菌之間的關(guān)系。
[0015] 磁分離技術(shù)是以納米或微粒級的磁性顆粒為載體，利用結(jié)合于磁性顆粒表面修 飾的蛋白質(zhì)所提供的蛋白-蛋白之間的特異親和特性，在施加磁場的裝置控制下，通過免 疫親和吸附、清洗、解吸操作，從復(fù)雜的生物樣本中分離得到目標(biāo)生物分子，具有磁性分離 簡單方便、親和吸附高特異性及高敏感性等眾多優(yōu)點。本發(fā)明采用磁分離技術(shù)利用磁性標(biāo) 簽對致病菌進(jìn)行富集和分離，其具體操作過程殘見實施例。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0017] (1)本發(fā)明采用巨磁阻抗效應(yīng)傳感器檢測致病菌，芯片采用MEMS技術(shù)制作，具有 較大的傳感器芯片面積，傳感器具有高的磁場檢測靈敏度；
[0018] (2)致病菌捕獲芯片采用MEMS技術(shù)設(shè)計制作，致病菌捕獲芯片表面上的Au膜修飾 了生物敏感膜，生物敏感膜固定了致病菌單克隆抗體，致病菌單克隆抗體可以捕獲致病菌； 采用磁分離技術(shù)對致病菌進(jìn)行富集和分離，不需要對生物樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)和PCR擴(kuò)增， 致病菌與生物素修飾的致病菌單克隆抗體結(jié)合，致病菌通過生物素與親和素作用與磁性標(biāo) 簽相連，磁性標(biāo)簽為鏈酶親和素修飾的磁性納米粒子或由其構(gòu)成的磁珠。采用磁分離技術(shù) 將帶有磁性標(biāo)簽的致病菌從生物樣本中分離出來，大大縮短了檢測時間；
[0019] (3)生物樣品本身不帶磁性，能提供一個很低噪聲的磁測量環(huán)境，相對于熒光分 子、放射性同位元素、酶等標(biāo)簽，磁性標(biāo)簽非常穩(wěn)定；
[0020] (4)本發(fā)明中的食品中致病菌檢測系統(tǒng)具有檢測速度快、可重復(fù)使用、無特殊環(huán)境 和存放要求、體積小、靈敏度高等優(yōu)點，缺點是不能對固體樣品中的致病菌直接進(jìn)行檢測； 本發(fā)明的巨磁阻抗效應(yīng)傳感器不需要依賴于操作人員的生物學(xué)醫(yī)學(xué)經(jīng)驗以及龐雜、昂貴的 熒光檢測設(shè)備，就可實現(xiàn)特定的生化分析或致病菌檢測，這將有利于實現(xiàn)便攜式、成本低 廉、快速診