本發(fā)明涉及分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，涉及用于DNA
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是指一種快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑、試劑盒與其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)已經(jīng)逐漸被人群接受，腫瘤便是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)首要解決任務(wù)之一。說(shuō)起腫瘤、癌癥，雖然已經(jīng)不再像多年前一樣讓人談癌色變，但仍舊為人們所恐懼。成功治療腫瘤還是以早發(fā)現(xiàn)早治療為主，那么盡早檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)腫瘤便是首當(dāng)其沖的核心。液體活檢(Liquidbiopsy)的檢測(cè)方法，可以捕獲到進(jìn)入血液的其它細(xì)胞的DNA，從而替代了疾病的診斷，例如腫瘤。cfDNA是指外周血中游離的DNA片段，已有研究證實(shí)，腫瘤患者外周血中的cfDNA總量，要高于健康人。通過(guò)這一點(diǎn)，雖然不能武斷的說(shuō)cfDNA能成為腫瘤標(biāo)志物，但是cfDNA的含量增多，能起到一個(gè)較好的提示作用，作為一個(gè)初篩的手段?；赾fDNA的液態(tài)活檢中，盡管ctDNA在腫瘤診療中的應(yīng)用是當(dāng)下cfDNA最廣泛，研究最深入的分支。但是，cfDNA作為液態(tài)活檢，不只是局限于腫瘤學(xué)。例如，有研究報(bào)道對(duì)于接受器官移植手術(shù)的病人，可以通過(guò)監(jiān)測(cè)術(shù)后外周血中具有捐獻(xiàn)者基因特征，片段化的cfDNA含量變化，來(lái)評(píng)估移植器官的排斥情況。在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)中，采集孕婦外周血(5ml)，提取游離DNA，采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)，結(jié)合生物信息分析，得出胎兒是否存在基因異常情況，如患染色體非整倍體(21-三體又稱唐氏綜合征，18-三體，13-三體)的風(fēng)險(xiǎn)。由于cfDNA在外周血中含量低，而且在cfDNA提取過(guò)程中又極有可能損失部分核酸片段，因此更加會(huì)導(dǎo)致在下游的檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。但是科研人員往往只能通過(guò)分析下游測(cè)序得到的序列，才能檢測(cè)cfDNA的完整度，這極大影響了醫(yī)療診斷的時(shí)效性，也極大增高了成本。因而，如何能在進(jìn)行高通量測(cè)序前檢測(cè)cfDNA的完整度，成為目前業(yè)界研究人員需要盡快解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的就是針對(duì)以上現(xiàn)狀，提供一種快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑、試劑盒與其應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。為實(shí)現(xiàn)前述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：本發(fā)明實(shí)施例提供了一種快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑，其包含第一試劑、第二試劑、第三試劑和第四試劑中的至少一者；所述第一試劑包括具有SEQIDNO：1所示序列的第一引物和具有SEQIDNO：2所示序列的第二引物；所述第二試劑包括具有SEQIDNO：3所示序列的第三引物和具有SEQIDNO：4所示序列的第四引物；所述第三試劑包括具有SEQIDNO：5所示序列的第五引物和具有SEQIDNO：6所示序列的第六引物；所述第四試劑包括具有SEQIDNO：7所示序列的第七引物和具有SEQIDNO：8所示序列的第八引物。在一些較為具體的實(shí)施方案中，所述快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑包括第一試劑、第二試劑、第三試劑和第四試劑。在一些較為具體的實(shí)施方案中，所述第一試劑包括濃度為2uM～20uM的第一引物、濃度為2uM～20uM的第二引物，其余部分包含超純水。優(yōu)選的，所述第二試劑包括濃度為2uM～20uM的第三引物、濃度為2uM～20uM的第四引物，其余部分包含超純水。優(yōu)選的，所述第三試劑包括濃度為2uM～20uM的第五引物、濃度為2uM～20uM的第六引物，其余部分包含超純水。優(yōu)選的，所述第四試劑包括濃度為2uM～20uM的第七引物、濃度為2uM～20uM的第八引物，其余部分包含超純水。本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑盒，其包括前述快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑。在一些較為具體的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括PCR擴(kuò)增檢測(cè)的常規(guī)組件，所述PCR擴(kuò)增檢測(cè)的常規(guī)組件包括TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸混合物和超純水。本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種外周血游離核酸完整度的快速檢測(cè)方法，其包括：提供前述快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑或試劑盒；將待檢測(cè)的外周血游離核酸樣品，第一試劑、第二試劑、第三試劑和第四試劑中的至少一者以及PCR擴(kuò)增檢測(cè)的常規(guī)組件混合均勻，之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在一些較為具體的實(shí)施方案中，所述PCR擴(kuò)增的條件包括：預(yù)擴(kuò)增，包括：在90℃～100℃溫度條件下反應(yīng)1min～5min，優(yōu)選的，在95℃溫度條件下反應(yīng)3min；PCR循環(huán)，包括：首先進(jìn)行30～60個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括：依次在90℃～100℃下保溫10s～50s，55℃～72℃下保溫10s～50s，65℃～85℃下保溫10s～50s；其后，依次在90℃～100℃下保溫10s～50s，55℃～72℃下保溫10s～50s，90℃～100℃下保溫10s～50s，4℃保存。進(jìn)一步的，所述PCR循環(huán)包括：首先進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括：依次在95℃下保溫30s，60℃下保溫30s，72℃下保溫10s；其后，依次在95℃下保溫15s，65℃下保溫15s，95℃下保溫15s，4℃保存。優(yōu)選的，在所述PCR循環(huán)中，于60℃下保溫30s步驟和65℃下保溫15s步驟中分別設(shè)置熒光數(shù)據(jù)采集。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括：(1)本發(fā)明提供的快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑及試劑盒，能夠有效的檢測(cè)外周血游離核酸完整度，大大減少因外周血游離核酸完整度不夠而導(dǎo)致的下游檢測(cè)結(jié)果無(wú)效的風(fēng)險(xiǎn)，為外周血游離核酸的下游分子生物學(xué)分析打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)；且該試劑的穩(wěn)定性高，所用原料簡(jiǎn)單易得，價(jià)格低廉，制備簡(jiǎn)單，難度低，無(wú)需專門技術(shù)培訓(xùn)及特殊儀器設(shè)備，有利于推廣應(yīng)用；在應(yīng)用于DNA完整度檢測(cè)時(shí)，操作方便，檢測(cè)度較高。(3)本發(fā)明提供的外周血游離核酸完整度的快速檢測(cè)方法，通過(guò)設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物序列對(duì)外周血游離核酸中的特定區(qū)域進(jìn)行定量分析，再通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算對(duì)外周血游離核酸完整度進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估，可有效的檢測(cè)外周血游離核酸完整度。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明實(shí)施例1-4中不同平臺(tái)下對(duì)3份樣本進(jìn)行外周血游離核酸完整度檢測(cè)的結(jié)果對(duì)比示意圖。具體實(shí)施方式下文將對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作更為詳盡的解釋說(shuō)明。但是，應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。在對(duì)實(shí)例描述前，有必要提供一些備注說(shuō)明：采用不同廠家、不同批次的試劑會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異，屬于正?，F(xiàn)象。在進(jìn)行小規(guī)模實(shí)驗(yàn)時(shí)，為保證平行實(shí)驗(yàn)間的重復(fù)性，建議配置試劑后，充分混勻并分裝，以保證每次實(shí)驗(yàn)試劑的均一性。本發(fā)明實(shí)施例提供了一種快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑，其包含第一試劑、第二試劑、第三試劑和第四試劑中的至少一者。其中，所述第一試劑包括具有SEQIDNO：1所示序列的第一引物(oligo1)和具有SEQIDNO：2所示序列的第二引物(oligo2)；所述第二試劑包括具有SEQIDNO：3所示序列的第三引物(oligo3)和具有SEQIDNO：4所示序列的第四引物(oligo4)；所述第三試劑包括具有SEQIDNO：5所示序列的第五引物(oligo5)和具有SEQIDNO：6所示序列的第六引物(oligo6)；所述第四試劑包括具有SEQIDNO：7所示序列的第七引物(oligo7)和具有SEQIDNO：8所示序列的第八引物(oligo8)。在一些較為具體的實(shí)施方案中，所述快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑包括第一試劑、第二試劑、第三試劑和第四試劑。在一些較為具體的實(shí)施方案中，所述第一試劑的溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo12uM～20uM，Oligo22uM～20uM。更優(yōu)選的，所述第一試劑的溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo110uM，Oligo210uM。在一些實(shí)施方案之中，所述第二試劑的溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo32uM～20uM，Oligo42uM～20uM。更優(yōu)選的，所述第二試劑的溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo310uM，Oligo410uM。在一些實(shí)施方案之中，所述第三試劑的溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo52uM～20uM，Oligo62uM～20uM。更優(yōu)選的，所述第三試劑的溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo510uM，Oligo610uM。在一些實(shí)施方案之中，所述第四試劑的溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo72uM～20uM，Oligo82uM～20uM。更優(yōu)選的，所述第四試劑的溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo710uM，Oligo810uM。本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑盒，其包括前述快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑。在一些較為具體的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括PCR擴(kuò)增檢測(cè)的常規(guī)組件，所述PCR擴(kuò)增檢測(cè)的常規(guī)組件包括TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸混合物和超純水。其中具體的，所述第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑的用量為0.2uL～2uL，PCR擴(kuò)增檢測(cè)的常規(guī)組件的用量為5uL～10uL，超純水為0.2uL～5uL。其中更為具體的，所述第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑的用量為0.9uL，PCR擴(kuò)增檢測(cè)的常規(guī)組件的用量為7.5uL，超純水為1.6uL。本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種外周血游離核酸完整度的快速檢測(cè)方法，其包括：提供前述快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑或試劑盒；將待檢測(cè)的外周血游離核酸樣品，第一試劑、第二試劑、第三試劑和第四試劑中的至少一者以及PCR擴(kuò)增檢測(cè)的常規(guī)組件混合均勻，之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，所述待檢測(cè)的外周血游離核酸樣品的用量?jī)?yōu)選為0.2ng～5ng，更優(yōu)選為0.5ng。在進(jìn)行檢測(cè)之前，先將待檢測(cè)的外周血游離核酸樣品取出融化，融化溫度優(yōu)選為0℃～8℃，更優(yōu)選為4℃。在一些實(shí)施方案之中，本發(fā)明的完整度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)需設(shè)置NTC樣本，優(yōu)選的，所述NTC樣本為超純水。在一些較為具體的實(shí)施方案中，所述PCR擴(kuò)增的條件包括：預(yù)擴(kuò)增，包括：在90℃～100℃溫度條件下反應(yīng)1min～5min，優(yōu)選的，在95℃溫度條件下反應(yīng)3min；PCR循環(huán)，包括：首先進(jìn)行30～60個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括：依次在90℃～100℃下保溫10s～50s，55℃～72℃下保溫10s～50s，65℃～85℃下保溫10s～50s；其后，溶解曲線為：依次在90℃～100℃下保溫10s～50s，55℃～72℃下保溫10s～50s，90℃～100℃下保溫10s～50s，4℃保存。進(jìn)一步的，所述PCR循環(huán)包括：首先進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括：依次在95℃下保溫30s，60℃下保溫30s，72℃下保溫10s；其后，溶解曲線為：依次在95℃下保溫15s，65℃下保溫15s，95℃下保溫15s，4℃保存。優(yōu)選的，在所述PCR循環(huán)中，于循環(huán)體系中60℃下保溫30s步驟和溶解曲線中65℃下保溫15s步驟中分別設(shè)置熒光數(shù)據(jù)采集。所述外周血游離核酸完整度的快速檢測(cè)方法還包括對(duì)最后得到的結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。其中，結(jié)果數(shù)據(jù)分析使用以下算法：分別記錄第一試劑，第二試劑，第三試劑，第四試劑體系中儀器上所讀取的Cq值(有些機(jī)器命名為Ct值)，取該數(shù)值0.2～5為底數(shù)的指數(shù)冪，判斷指數(shù)冪的正確范圍，并評(píng)判基因檢出率，最后通過(guò)基因檢出率判斷完整度。具體的，所述結(jié)果數(shù)據(jù)分析使用以下算法：分別記錄待測(cè)樣本使用第一試劑，第二試劑，第三試劑，第四試劑體系中儀器上所讀取的Cq值(有些機(jī)器命名為Ct值)和NTC樣本使用第一試劑，第二試劑，第三試劑，第四試劑體系中儀器上所讀取的Cq值(有些機(jī)器命名為Ct值)，使用NTC樣本的Cq值減去待測(cè)樣本的Cq值，取該差值2為底數(shù)的指數(shù)冪，第一，第二，第三，第四分別對(duì)應(yīng)4個(gè)基因，判斷指數(shù)冪大于20視為該基因檢出，將基因檢出的個(gè)數(shù)除以4計(jì)算基因檢出率，基因檢出率大于50％，視為完整度合格。以下結(jié)合附圖和若干實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的解釋說(shuō)明。實(shí)施例11.試劑準(zhǔn)備：KAPASYBRFASTqPCRMasterMix(2×)；試劑A：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo110uM，Oligo210uM；試劑B：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo310uM，Oligo410uM；試劑C：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo510uM，Oligo610uM；試劑D：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo710uM，Oligo810uM。2.檢測(cè)用儀器：EcoqPCR儀(Illumina)。3.實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程：(1)將3個(gè)待測(cè)樣本分別取0.5ng，每個(gè)待測(cè)樣本做3個(gè)重復(fù)，N＝待測(cè)樣本數(shù)×3；(2)取4個(gè)1.5mlEP管，每個(gè)EP管上分別對(duì)應(yīng)下表中的試劑A/試劑B/試劑C/試劑D；(3)混合液準(zhǔn)備：(4)反應(yīng)體系：(5)向48孔板中每孔加入15μlQPCR反應(yīng)液；超純水為NTC樣本；(6)加完試劑后使用密封薄膜對(duì)板進(jìn)行正確密封，使用密封膜刮板將膜牢牢地壓在板表面；(7)將樣本板放入板式離心機(jī)，1000×g，離心5min；(8)離心完成后將48孔板放進(jìn)Eco系統(tǒng)中，蓋上儀器蓋子，設(shè)置反應(yīng)條件如下：設(shè)置完成后，點(diǎn)擊startrun開始按鈕，并保存實(shí)驗(yàn)文件qPCR，并根據(jù)記錄試劑A，試劑B，試劑C，試劑D體系中儀器上所讀取的Cq值(3個(gè)重復(fù)取平均)，將NTC樣本的Cq值減去待測(cè)樣本的Cq值，取該差值2為底數(shù)的指數(shù)冪，A、B、C、D分別對(duì)應(yīng)4個(gè)基因，判斷指數(shù)冪大于20視為該基因檢出，將基因檢出的個(gè)數(shù)除以4計(jì)算基因檢出率，基因檢出率大于50％，視為完整度合格。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表：樣本CqACqBCqCCqD2△CqA2△CqB2△CqC2△CqD檢出128.2326.5526.7830.1039.67128.8945.2517.3975％230.1131.2225.7832.3310.785.0690.513.7125％325.6826.8923.8828.81232.32101.83337.7942.5275％NTC33.5433.5632.2834.221.001.001.001.005.實(shí)驗(yàn)結(jié)論：樣本1完整度合格，樣本2完整度不合格，樣本3完整度合格。實(shí)施例21.試劑準(zhǔn)備：KAPASYBRFASTqPCRMasterMix(2×)；試劑A：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo110uM，Oligo210uM；試劑B：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo310uM，Oligo410uM；試劑C：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo510uM，Oligo610uM；試劑D：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo710uM，Oligo810uM。2.檢測(cè)用儀器：StepOnePlus(ABI)。3.實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程：(1)將3個(gè)待測(cè)樣本分別取0.5ng，每個(gè)待測(cè)樣本做3個(gè)重復(fù)，N＝待測(cè)樣本數(shù)×3；(2)取4個(gè)1.5mlEP管，每個(gè)EP管上分別對(duì)應(yīng)下表中的試劑A/試劑B/試劑C/試劑D；(3)混合液準(zhǔn)備：(4)反應(yīng)體系：(5)向96孔板中每孔加入15μlQPCR反應(yīng)液；超純水為NTC樣本；(6)加完試劑后使用密封薄膜對(duì)板進(jìn)行正確密封，使用密封膜刮板將膜牢牢地壓在板表面；(7)將樣本板放入板式離心機(jī)，1000×g，離心5min；(8)離心完成后將96孔板放進(jìn)StepOnePlus中，蓋上儀器蓋子，設(shè)置反應(yīng)條件如下：設(shè)置完成后，點(diǎn)擊startrun開始按鈕，并保存實(shí)驗(yàn)文件qPCR，并根據(jù)記錄試劑A，試劑B，試劑C，試劑D體系中儀器上所讀取的Cq值(3個(gè)重復(fù)取平均)，將NTC樣本的Cq值減去待測(cè)樣本的Cq值，取該差值2為底數(shù)的指數(shù)冪，A、B、C、D分別對(duì)應(yīng)4個(gè)基因，判斷指數(shù)冪大于20視為該基因檢出，將基因檢出的個(gè)數(shù)除以4計(jì)算基因檢出率，基因檢出率大于50％，視為完整度合格。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表：樣本CqACqBCqCCqD2△CqA2△CqB2△CqC2△CqD檢出128.9026.8627.4630.6433.46103.8128.3411.9475％230.5531.6326.1332.3310.623.8270.823.7025％325.7427.5624.6029.45298.8864.15204.7227.2275％NTC33.9634.0633.1334.421.001.001.001.005.實(shí)驗(yàn)結(jié)論：樣本1完整度合格，樣本2完整度不合格，樣本3完整度合格。實(shí)施例31.試劑準(zhǔn)備：KAPASYBRFASTqPCRMasterMix(2×)；試劑A：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo110uM，Oligo210uM；試劑B：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo310uM，Oligo410uM；試劑C：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo510uM，Oligo610uM；試劑D：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo710uM，Oligo810uM。2.檢測(cè)用儀器：ABI7500(ABI)。3.實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程：(1)將3個(gè)待測(cè)樣本分別取0.5ng，每個(gè)待測(cè)樣本做3個(gè)重復(fù)，N＝待測(cè)樣本數(shù)×3；(2)取4個(gè)1.5mlEP管，每個(gè)EP管上分別對(duì)應(yīng)下表中的試劑A/試劑B/試劑C/試劑D；(3)混合液準(zhǔn)備：(4)反應(yīng)體系：(5)向96孔板中每孔加入15μlQPCR反應(yīng)液；超純水為NTC樣本；(6)加完試劑后使用密封薄膜對(duì)板進(jìn)行正確密封，使用密封膜刮板將膜牢牢地壓在板表面；(7)將樣本板放入板式離心機(jī)，1000×g，離心5min；(8)離心完成后將96孔板放進(jìn)ABI7500中，蓋上儀器蓋子，設(shè)置反應(yīng)條件如下：設(shè)置完成后，點(diǎn)擊startrun開始按鈕，并保存實(shí)驗(yàn)文件qPCR，并根據(jù)記錄試劑A，試劑B，試劑C，試劑D體系中儀器上所讀取的Cq值(3個(gè)重復(fù)取平均)，將NTC樣本的Cq值減去待測(cè)樣本的Cq值，取該差值2為底數(shù)的指數(shù)冪，A、B、C、D分別對(duì)應(yīng)4個(gè)基因，判斷指數(shù)冪大于20視為該基因檢出，將基因檢出的個(gè)數(shù)除以4計(jì)算基因檢出率，基因檢出率大于50％，視為完整度合格。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表：樣本CqACqBCqCCqD2△CqA2△CqB2△CqC2△CqD檢出130.0327.3727.9231.6436.3372.8620.525.9775％231.1132.1627.1533.5117.132.6535.011.6325％327.4027.7025.3730.43224.8958.11120.1813.7975％NTC35.2134.5633.6335.351.001.001.001.005.實(shí)驗(yàn)結(jié)論：樣本1完整度合格，樣本2完整度不合格，樣本3完整度合格。實(shí)施例41.試劑準(zhǔn)備：KAPASYBRFASTqPCRMasterMix(2×)；試劑A：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo110uM，Oligo210uM；試劑B：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo310uM，Oligo410uM；試劑C：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo510uM，Oligo610uM；試劑D：溶劑為超純水，溶質(zhì)為以下終濃度物質(zhì)：Oligo710uM，Oligo810uM。2.檢測(cè)用儀器：LightCycler480(Roche)。3.實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程：(1)將3個(gè)待測(cè)樣本分別取0.5ng，每個(gè)待測(cè)樣本做3個(gè)重復(fù)，N＝待測(cè)樣本數(shù)×3；(2)取4個(gè)1.5mlEP管，每個(gè)EP管上分別對(duì)應(yīng)下表中的試劑A/試劑B/試劑C/試劑D；(3)混合液準(zhǔn)備：(4)反應(yīng)體系：(5)向96孔板中每孔加入15μlQPCR反應(yīng)液；超純水為NTC樣本；(6)加完試劑后使用密封薄膜對(duì)板進(jìn)行正確密封，使用密封膜刮板將膜牢牢地壓在板表面；(7)將樣本板放入板式離心機(jī)，1000×g，離心5min；(8)離心完成后將96孔板放進(jìn)LightCycler480中，蓋上儀器蓋子，設(shè)置反應(yīng)條件如下：設(shè)置完成后，點(diǎn)擊startrun開始按鈕，并保存實(shí)驗(yàn)文件qPCR，并根據(jù)記錄試劑A，試劑B，試劑C，試劑D體系中儀器上所讀取的Cq值(3個(gè)重復(fù)取平均)，將NTC樣本的Cq值減去待測(cè)樣本的Cq值，取該差值2為底數(shù)的指數(shù)冪，A、B、C、D分別對(duì)應(yīng)4個(gè)基因，判斷指數(shù)冪大于20視為該基因檢出，將基因檢出的個(gè)數(shù)除以4計(jì)算基因檢出率，基因檢出率大于50％，視為完整度合格。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表：樣本CqACqBCqCCqD2△CqA2△CqB2△CqC2△CqD檢出126.9825.3025.8028.8416.06305.6789.2241.5975％228.5929.9024.6131.265.2312.67203.397.8025％324.0125.4922.5127.94125.41269.00873.9177.49100％NTC30.9831.1530.0031.791.001.001.001.005.實(shí)驗(yàn)結(jié)論：樣本1完整度合格，樣本2完整度不合格，樣本3完整度合格。圖1是實(shí)施例1-4中不同平臺(tái)下對(duì)3份樣本進(jìn)行外周血游離核酸完整度檢測(cè)的結(jié)果對(duì)比示意圖。從以上實(shí)施例1-4和圖1可以明顯看到，4個(gè)實(shí)施例分別在4種不同的熒光定量PCR儀上使用該方法對(duì)同3份樣本進(jìn)行了完整度檢測(cè)，得到的結(jié)果高度一致。因此，本發(fā)明的一種快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑可以有效檢測(cè)外周血游離核酸的完整度，不受檢測(cè)平臺(tái)的限制，同時(shí)該試劑配制來(lái)源簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊人員培訓(xùn)，成本低廉。通過(guò)該試劑可有效的檢測(cè)外周血游離核酸的完整度，大大減少因外周血游離核酸完整度不夠而導(dǎo)致的下游檢測(cè)結(jié)果無(wú)效的風(fēng)險(xiǎn)，為外周血游離核酸的下游分子生物學(xué)分析打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。應(yīng)當(dāng)理解，上述實(shí)施例僅為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表<110>蘇州貝斯派生物科技有限公司<120>快速檢測(cè)外周血游離核酸完整度的試劑、試劑盒與其應(yīng)用<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1CGCATTCCTCATCCCAGTATG21<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2AAAGGACTTGGTGCAGAGTTCAG23<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>3CCCACCGCCTTCGACAT17<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4CCTGCTTACTGTGGGCTCTTG21<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>5CTCGCTTAACCAGACTCATCTACTGT26<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>6ACTTGGCTCAGCTGTATGAAGGT23<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7AGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTC24<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>8ATGTCTCGATCCCACTTAACTATCTT26當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3