結(jié)核分枝桿菌核酸快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種結(jié)核分枝桿菌核酸快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明選取針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特有的基因序列保守區(qū)段設(shè)計(jì)四條特異性引物，結(jié)合DNA聚合酶在恒溫條件下完成靶基因序列的擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的快速檢測(cè)，應(yīng)用于痰液或拭子樣本中結(jié)核分枝桿菌的快速檢測(cè)。本發(fā)明試劑盒程序化了操作步驟，實(shí)現(xiàn)了對(duì)痰液和拭子樣本中結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)，使操作過程簡(jiǎn)便和可控，檢測(cè)過程采用閉管檢測(cè)同時(shí)又加入了穩(wěn)定液防治氣溶膠的形成，解決了污染問題，結(jié)果更可靠。本發(fā)明試劑盒因快速、高敏、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)適合檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)和基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。
【專利說明】結(jié)核分枝桿菌核酸快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域中的檢測(cè)試劑盒，具體地說，本發(fā)明涉及一種結(jié)核分枝桿菌核酸快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原體。目前結(jié)核病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的一個(gè)重大的全球性公共衛(wèi)生問題，WHO已把結(jié)核病與AIDS、瘧疾一起共同列為人類的主要?dú)⑹郑哂懈咚劳雎?，高感染率，底遞降率等特點(diǎn)。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，有超過4億的感染人群。我國(guó)現(xiàn)有肺結(jié)核病人約500萬，每年約有13萬人死于該病。據(jù)研究，受感染的人群中，10%的人會(huì)發(fā)展成為結(jié)核病。因此，早期診斷、及時(shí)治療是有效控制結(jié)核病傳播蔓延，恢復(fù)結(jié)核病患者健康的關(guān)鍵。
[0003]目前，結(jié)核病的臨床診斷主要根據(jù)病史、胸片、痰培養(yǎng)、涂片抗酸染色等結(jié)果。其中傳統(tǒng)檢測(cè)方法存在靈敏度低、耗時(shí)長(zhǎng)等不足，容易對(duì)部分患者造成誤診或漏診。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)快速簡(jiǎn)便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定的單克隆抗體，否則準(zhǔn)確性不夠，僅能作為輔助檢測(cè)手段。因此能否提供快速、高敏、特異、簡(jiǎn)便、可靠、適合臨床應(yīng)用的檢測(cè)技術(shù)已成為國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。
[0004]分子生物學(xué)技術(shù)具有靈敏、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)，可以提高病源的檢出率，對(duì)我國(guó)及全球疾病防治有著重要 促進(jìn)作用。但是目前常用的分子生物手段中，PCR方法檢測(cè)程序相對(duì)復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求較高，同時(shí)電泳實(shí)驗(yàn)極易產(chǎn)生污染導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生；熒光PCR方法解決了污染問題，但因其昂貴的儀器設(shè)備也難進(jìn)行基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。
[0005]在結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)方法中，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌具有敏感性高，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，但該技術(shù)在臨床應(yīng)用過程中也存在易交叉污染、耗時(shí)長(zhǎng)等方面問題，除人為因素外，PCR技術(shù)在操作過程必須有高精密的溫度循環(huán)裝置；而熒光定量PCR雖然具有引物和探針的雙重特異性，與傳統(tǒng)PCR相比，在對(duì)結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的特異性上大為提高，但其檢測(cè)也易出現(xiàn)假陽(yáng)性，并需要昂貴的儀器，成本高，加大推廣應(yīng)用難度。所以，及時(shí)應(yīng)用生物技術(shù)的最新成果開發(fā)一種適于臨床推廣的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)試劑盒具有重要意義。
[0006]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是繼PCR技術(shù)后發(fā)展起來的一門新型的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，由Notomit等于2000年建立。該技術(shù)通過識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域和一種具有鏈置換的DNA聚合酶，在恒溫條件實(shí)現(xiàn)靶序列快速、高敏、特異的擴(kuò)增。該技術(shù)又因其不需要昂貴高精密的溫度循環(huán)裝置，只需在一個(gè)恒定的溫度下完成操作，大大降低了成本同時(shí)也節(jié)省了時(shí)間，更適合推廣應(yīng)用。顯然，開發(fā)結(jié)核分枝桿菌快速、高敏、特異、可靠、適合臨床應(yīng)用的一種試劑盒是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)核分枝桿菌核酸快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)特異性、靈敏性不高以及實(shí)驗(yàn)污染不易控制的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)過程的簡(jiǎn)單化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、快速化。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)試劑盒供現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和基層醫(yī)院使用。
[0009] 首先，本發(fā)明選取針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特有基因序列保守區(qū)段設(shè)計(jì)四條特異性引物，結(jié)合DNA聚合酶在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)靶基因序列的擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)。
[0010]本發(fā)明選取結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的保守基因片段，同時(shí)又參考卡介苗基因組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選取特定基因片段做為靶基因序列設(shè)計(jì)四條專用引物。該基因片段因其高度保守，并廣泛存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群中，而在卡介苗基因組序列中不存在該基因片段，因此該基因序列的選取既可以檢測(cè)出結(jié)核分支桿菌復(fù)合菌群所有菌種，又成功的區(qū)別開了結(jié)核分枝桿菌自然感染和人工卡介苗免疫，避免了人工卡介苗免疫假陽(yáng)性的產(chǎn)生，使檢測(cè)結(jié)果更可靠。
[0011]為進(jìn)一步縮短檢測(cè)時(shí)間、簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟，本發(fā)明對(duì)該檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了優(yōu)化。首先對(duì)痰液或拭子的處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，并采用煮沸法進(jìn)行核酸提取(裂解液中含有NP-40)，大大縮短了樣本核酸制備時(shí)間。
[0012]本發(fā)明還解決了核酸檢測(cè)易污染的問題，所采用的技術(shù)方案是閉管式預(yù)裝核酸染料檢測(cè)法。本發(fā)明采用的檢測(cè)管內(nèi)置擴(kuò)增反應(yīng)液和核酸染料，反應(yīng)結(jié)束后上下反復(fù)震蕩，在不打開管蓋的條件下實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)液與核酸染料的混合，同時(shí)檢測(cè)管內(nèi)還添加了穩(wěn)定液防止擴(kuò)增反應(yīng)過程中氣溶膠的形成，實(shí)現(xiàn)雙重保護(hù)，有效的消除了污染風(fēng)險(xiǎn)。
[0013]本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌核酸快速檢測(cè)試劑盒包括:
(1)洗滌管，內(nèi)裝樣本洗滌液；
(2)裂解管，內(nèi)裝樣本裂解液；
(3)檢測(cè)管，內(nèi)裝擴(kuò)增反應(yīng)液、核酸染料和穩(wěn)定液，檢測(cè)管每8管一組密封于鋁箔袋中；擴(kuò)增反應(yīng)液由以下組份組成:擴(kuò)增引物的外引物F3和B3各0.1~0.4 μ Μ,擴(kuò)增引物的內(nèi)引物 FIP 和 BIP 各 I ~2 μ M，dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 0.8 ~2.0mM, MgC124 ~10mM，Betaine0.6 ~1.2M, Tris-HCllO ~40mM，KCllO ~20mM，MgS041 ~4mM，(NH4)2S046 ~12mM, Triton X-1000.05%~1.0%，Bst DNA聚合酶8~20U ;核酸染料為分子生物學(xué)中常用的染料，包括GeneFinder?、SYBR Green或GelRed等；且核酸染料預(yù)先粘附于檢測(cè)管的管蓋內(nèi)側(cè)中央位置或檢測(cè)管的管壁內(nèi)側(cè)上方；穩(wěn)定液成份是石蠟油。
(4)陰性核酸管，內(nèi)裝無結(jié)核分枝桿菌基因非傳染DNA片段的陰性溶液；
(5)陽(yáng)性核酸管，內(nèi)裝有結(jié)核分枝桿菌基因非傳染DNA片段的陽(yáng)性溶液；
上述結(jié)核分枝桿菌核酸快速檢測(cè)試劑盒中所述的擴(kuò)增引物是根據(jù)結(jié)核分枝桿菌特有基因而設(shè)計(jì)的，其核苷酸序列如下:
外引物 F3:CGCAATCCAGGGAAATGTCA
外引物 B3:CCCAGTGACGTTGCCTTC
內(nèi)引物 FIP:ACGCCTCCGAACCGCTACCTTTTCCTCCTTGACGAGGGGAAG
內(nèi)引物 BIP:AATGGGACGCCACGGCTACCTTTTCATTGCCTGACCGGCTT
[0014]用本發(fā)明上述核酸快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)痰液或拭子樣本中結(jié)核分枝桿菌的方法，按下列步驟進(jìn)行:(1)樣本處理，估計(jì)痰液樣本的量，加入2-4倍體積的4%的NaOH溶液，充分混勻，室溫靜置液化10min-20min,使其充分液化；拭子樣本直接保存于拭子保存液中；
(2)樣本洗滌，取液化的痰液(或拭子沖洗液)樣本轉(zhuǎn)移到離心管中，離心去除上清液收集沉淀，用樣本洗滌液洗滌沉淀，離心收集沉淀；
(3)核酸提取，用樣本裂解液重懸上述沉淀，混勻，100°C溫浴裂解5-15min，立即置于冰上，然后離心，上清液即為樣本模板DNA ；
(4)加樣反應(yīng)，取出檢測(cè)管，分別標(biāo)記陰性對(duì)照管、檢測(cè)管和陽(yáng)性對(duì)照管，依次分別加入陰性溶液、步驟(3)上清液和陽(yáng)性溶液，60 - 65°C條下件保溫30-60min ；
(5)染料混合，上述步驟完成后，將上述陰性對(duì)照管、檢測(cè)管和陽(yáng)性對(duì)照管向下甩動(dòng)，使管中的擴(kuò)增反應(yīng)液與染料充分混合，離心使混合后的液體聚集于管底部；
(6)結(jié)果判讀，肉眼觀察擴(kuò)增反應(yīng)液顏色，如果擴(kuò)增反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色則該表示樣本的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，如果擴(kuò)增反應(yīng)液呈現(xiàn)橙黃色則表示該樣本的檢測(cè)結(jié)果為陰性。
在上述步驟中，結(jié)果判讀時(shí)應(yīng)依照陽(yáng)性對(duì)照管擴(kuò)增反應(yīng)液應(yīng)顯示為綠色，陰性對(duì)照管擴(kuò)增反應(yīng)液應(yīng)顯示為橙黃色，否則應(yīng)判定該實(shí)驗(yàn)無效。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0016]1.本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌核酸快速檢測(cè)試劑盒，應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)靶基因是否擴(kuò)增判斷靶基因序列的有無，因此具有高特異性，同時(shí)特殊靶基因序列的選取，可以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌自然感染和人工卡介苗免疫，本試劑盒對(duì)卡介苗的檢測(cè)結(jié)果報(bào)告為陰性；2.本發(fā)明試劑盒基于恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了試劑盒的快速，高敏特點(diǎn)，在不到I小時(shí)內(nèi)即可完成擴(kuò)增檢測(cè)，擴(kuò)增模板僅需很少；3.本發(fā)明試劑盒對(duì)痰液樣本和拭子樣本中的核酸提取過程分別進(jìn)行了優(yōu)化，使操作步驟簡(jiǎn)單化，規(guī)范化；4.本發(fā)明試劑盒只需在溫度恒定的設(shè)備中就能進(jìn)行反應(yīng)，不需要特殊設(shè)備要求，降低了檢測(cè)本低，核酸染料的添加使檢測(cè)結(jié)果肉眼即可判讀，結(jié)果更加明顯可靠；5.本發(fā)明試劑盒的整個(gè)檢測(cè)過程在全封閉不開蓋狀態(tài)下進(jìn)行，同時(shí)又添加了穩(wěn)定液，使得待測(cè)樣本的反應(yīng)和結(jié)果判讀過程均在物理封閉條件下完成(PCR管蓋和穩(wěn)定液雙重保護(hù))，所以本試劑盒有效的防止實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增物交叉污染，防止假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生，適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和基層醫(yī)院使用。
[0017]綜上，本發(fā)明試劑盒將核酸提取、DNA擴(kuò)增和結(jié)果判讀有機(jī)地融為一體，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)過程的簡(jiǎn)單化、快速化、程序化和標(biāo)準(zhǔn)化便于普及推廣。本發(fā)明試劑盒具有比PCR方法更高的靈敏性和特異性，檢測(cè)快速且成本低，檢測(cè)過程中擺脫了對(duì)大型儀器的依賴，特別適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和基層醫(yī)院使用；整個(gè)檢測(cè)過程是在閉管全封閉不開蓋的狀態(tài)下進(jìn)行同時(shí)添加了穩(wěn)定液，起到防止交叉污染和防止假陽(yáng)性的結(jié)果產(chǎn)生，大大提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的早期預(yù)測(cè)，對(duì)該疾病的防控意義重大，而具有很高的推廣和應(yīng)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0019]實(shí)施例1結(jié)核分枝桿菌核酸快速檢測(cè)試劑盒 本發(fā)明的試劑盒由以下部件組成
(I)洗滌管，I個(gè)，內(nèi)裝樣本洗滌液；(2)裂解管，I個(gè)，內(nèi)裝樣本裂解液；
(3)檢測(cè)管，內(nèi)裝擴(kuò)增反應(yīng)液、核酸染料和穩(wěn)定液，檢測(cè)管每8管一組密封于鋁箔袋中。擴(kuò)增反應(yīng)液由以下組份組成:擴(kuò)增引物的外引物F3和B3各0.1~0.4 μ Μ,擴(kuò)增引物的內(nèi)引物 FIP 和 BIP 各 I ~2 μ M，dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 0.8 ~2.0mM, MgC124 ~10mM，Betaine0.6 ~1.2M, Tris-HCllO ~40mM，KCllO ~20mM，MgS041 ~4mM，(NH4) 2S046 ~12mM, Triton X-1000.05%~1.0%，Bst DNA聚合酶8~20U ;核酸染料為分子生物學(xué)中常用的染料，包括GeneFinder?、SYBR Green或GelRed等；且核酸染料預(yù)先粘附于檢測(cè)管的管蓋內(nèi)側(cè)中央位置或檢測(cè)管的管壁內(nèi)側(cè)上方；穩(wěn)定液成份是石蠟油。
引物信息如下:
外引物 F3:CGCAATCCAGGGAAATGTC A
外引物 B3:CCCAGTGACGTTGCCTTC
內(nèi)引物 FIP:ACGCCTCCGAACCGCTACCTTTTCCTCCTTGACGAGGGGAAG
內(nèi)引物 BIP:AATGGGACGCCACGGCTACCTTTTCATTGCCTGACCGGCTT
(4)陰性核酸管，I管，內(nèi)裝無結(jié)核分枝桿菌基因非傳染DNA片段的陰性溶液；
(5)陽(yáng)性核酸管，I管，內(nèi)裝有結(jié)核分枝桿菌基因非傳染DNA片段的陽(yáng)性溶液；
(6)包裝盒(I個(gè))，內(nèi)裝一塊有多孔的海綿塊；
(7)使用說明書，1份。
[0020]實(shí)施例2本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌核酸快速檢方法 使用實(shí)施例1的檢測(cè)試劑盒，按如下步驟進(jìn)行:
(1)樣本洗滌，取Iml液化的痰液(或拭子沖洗液)樣本轉(zhuǎn)移到離心管中，12，000r/min離心5min去除上清液收集沉淀,用樣本洗漆液洗漆沉淀I次，12，000r/min離心5min收集
沉淀；
(2)核酸提取，用^(^!樣本裂解液重懸上述沉淀^混勻’^^^溫浴裂解^^^^立即置于冰上2min，然后8，000r/min離心5min，上清液即為樣本模板DNA ；
(3)加樣反應(yīng)，取出檢測(cè)管，分別標(biāo)記陰性對(duì)照管、檢測(cè)管和陽(yáng)性對(duì)照管，依次分別加入陰性溶液、步驟(3)上清液和陽(yáng)性溶液各2μ 1，65°C條下件保溫60min ；
(4)染料混合，上述步驟完成后，將上述陰性對(duì)照管、檢測(cè)管和陽(yáng)性對(duì)照管向下甩動(dòng)，使管中的擴(kuò)增反應(yīng)液與染料充分混合，離心使混合后的液體聚集于管底部；
(5)結(jié)果判讀，肉眼觀察擴(kuò)增反應(yīng)液顏色，如果擴(kuò)增反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色則該表示樣本的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，如果擴(kuò)增反應(yīng)液呈現(xiàn)橙黃色則表示該樣本的檢測(cè)結(jié)果為陰性。
在上述步驟中，結(jié)果判讀時(shí)應(yīng)依照陽(yáng)性對(duì)照管擴(kuò)增反應(yīng)液應(yīng)顯示為綠色，陰性對(duì)照管擴(kuò)增反應(yīng)液應(yīng)顯示為橙黃色，否則應(yīng)判定該實(shí)驗(yàn)無效。
[0021]實(shí)施例3使用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌核酸的靈敏度 分別用本發(fā)明試劑盒和常規(guī)PCR方法進(jìn)行鑒定
1、使用實(shí)施例1的檢測(cè)試劑盒，按如下步驟進(jìn)行:
(1)樣本處理，取分離純化的結(jié)核分枝桿菌一次稀釋為1.0X106、1.0X105、1.0X 104、1.0X 103、1.0XlO2U.0X 11CFUAiL,每個(gè)濃度做 3 個(gè)重復(fù)；
(2)樣本洗滌，分別取分離純化稀釋后的不同梯度濃度的結(jié)核分枝桿菌菌液各1ml，轉(zhuǎn)移到離心管中，12，000r/min離心5min去除上清液收集沉淀，用樣本洗滌液洗滌沉淀I次，12，OOOr/min離心5min收集沉淀；
(3)核酸提取，用100μI樣本裂解液重懸上述沉淀，混勻，100°C溫浴裂解lOmin，立即置于冰上2min，然后8，OOOr/min離心5min，上清液即為樣本模板DNA ；
(4)加樣反應(yīng)，取出檢測(cè)管，分別標(biāo)記陰性對(duì)照管、檢測(cè)管(1-18號(hào))和陽(yáng)性對(duì)照管，依次分別加入陰性溶液、步驟(3)上清液和陽(yáng)性溶液各2μ 1，65°C條下件保溫60min ；
(5)染料混合，上述步驟完成后，將上述陰性對(duì)照管、檢測(cè)管和陽(yáng)性對(duì)照管向下甩動(dòng)，使管中的擴(kuò)增反應(yīng)液與染料充分混合，離心使混合后的液體聚集于管底部；
(6)結(jié)果判讀，肉眼觀察擴(kuò)增反應(yīng)液顏色，表明陰性對(duì)照管擴(kuò)增反應(yīng)液為橙黃色，陽(yáng)性對(duì)照管擴(kuò)增反應(yīng)液為綠色；檢測(cè)管17號(hào)擴(kuò)增反應(yīng)液為橙黃色結(jié)果判讀為陰性；其他檢測(cè)管擴(kuò)增反應(yīng)液均為綠色，結(jié)果判讀為陽(yáng)性。
2、使用常規(guī)PCR檢測(cè)試劑盒
(I)樣本處理，樣本洗滌，核酸提取與實(shí)施例1中步驟一致；
⑵PCR引物，反應(yīng)采用本方法反應(yīng)中的外引物F3和B3 ；
(3)PCR反應(yīng)，PCR體系為25μI體系，反應(yīng)液由以下組份組成=IOXPCRbuffer2.5 μ I (PCR 反應(yīng)緩沖液，TAKARA 公司)，IOmM dNTPs2 μ I (TAKARA 公司)，引物 F3 和B3各Iul，Taq酶0.15 μ I (5U/μ 1，TAKARA公司)，模板DNA2 μ 1，最后用滅菌水補(bǔ)至25 μ I體積。
(4)反應(yīng)程序，95°C預(yù)變性5min;95°C變性30S，58°C退火30S，72°C延伸30S，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
(5)PCR產(chǎn)物取10μ I與I %瓊脂糖凝膠電泳，100V電壓30min，觀察；結(jié)果顯示，PCR檢測(cè)方法檢測(cè)樣本濃度為1.0X102、1.0xio1CFUAiL無目的條帶的擴(kuò)增，結(jié)果判讀為陰性；其他樣本濃度都有目的條帶的擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性。
由以上兩種方法比較可以看出，本發(fā)明的核酸快速檢測(cè)試劑盒靈敏度可到達(dá)1.0X 11CFUAiL的濃度，而常規(guī)PCR檢測(cè)方法的靈敏度為1.0X 103CFU/mL的濃度為陽(yáng)性，
1.0X 102CFU/mL以及以下濃度結(jié)果均顯示為陰性，經(jīng)對(duì)比，本發(fā)明的核酸快速檢測(cè)試劑盒靈敏度明顯高于PCR方法的靈敏度，能檢測(cè)出更低濃度含量的樣本。
[0022]實(shí)施例4用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的特異性
根據(jù)實(shí)施例3的方法,分別對(duì)分離純化的結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行鑒定。
檢測(cè)結(jié)果顯示，鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌檢測(cè)管擴(kuò)增反應(yīng)液均為橙黃色，即結(jié)果判讀為陰性；結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)管擴(kuò)增反應(yīng)液為綠色，結(jié)果判讀為陽(yáng)性。本結(jié)果與常規(guī)PCR結(jié)果一直，顯示出良好的特異性。
[0023]本發(fā)明所需的試劑和材料:引物由上海生物工程有限責(zé)任公司合成；甜菜堿(betaine)、dNTP、KCl、MgS04、(NH4)2S04、MgCl2, NP-40、購(gòu)自上海生物工程有限責(zé)任公司；購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；恒溫?cái)U(kuò)增用的BstDNA聚合酶購(gòu)自NEB公司；核酸染料Genef inder?購(gòu)自廈 門百維信生物科技有限公司。
【權(quán)利要求】
1.一種結(jié)核分枝桿菌核酸快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于該檢測(cè)試劑盒包括: (1)洗滌管，內(nèi)裝樣本洗滌液； (2)裂解管，內(nèi)裝樣本裂解液； (3)檢測(cè)管，內(nèi)裝擴(kuò)增反應(yīng)液、核酸染料和穩(wěn)定液，檢測(cè)管每8管一組密封于鋁箔袋中； (4)陰性核酸管，內(nèi)裝無結(jié)核分枝桿菌基因非傳染DNA片段的陰性溶液； (5)陽(yáng)性核酸管，內(nèi)裝有結(jié)核分枝桿菌基因非傳染DNA片段的陽(yáng)性溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于上述的核酸染料為分子生物學(xué)中常用的染料，包括 GeneFinder?、SYBR Green 或 GelRed。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于上述檢測(cè)管內(nèi)核酸染料預(yù)先粘附于檢測(cè)管的管蓋內(nèi)側(cè)中央位置或檢測(cè)管的管壁內(nèi)側(cè)上方。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于上述的擴(kuò)增反應(yīng)液由以下組份組成:擴(kuò)增引物的外引物F3和B3各0.1~0.4 μ M，擴(kuò)增引物的內(nèi)引物FIP和BIP各I~2 μ Μ，dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 0.8 ~2.0mM，MgC124 ~10mM，Betaine0.6 ~1.2M, Tris-HCllO ~40mM, KCllO ~20mM ，MgS041 ~4mM，(NH4) 2S046 ~12mM，Triton X-1000.05%~1.0%，Bst DNA聚合酶8~20U。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于擴(kuò)增反應(yīng)液中擴(kuò)增引物依據(jù)結(jié)核分枝桿菌east基因而設(shè)計(jì)的引物。
6.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于擴(kuò)增反應(yīng)液中擴(kuò)增引物的核酸序列如下:
外引物 F3:CGCAATCCAGGGAAATGTCA
外引物 B3:CCCAGTGACGTTGCCTTC
內(nèi)引物 FIP:ACGCCTCCGAACCGCTACCTTTTCCTCCTTGACGAGGGGAAG
內(nèi)引物 BIP:AATGGGACGCCACGGCTACCTTTTCATTGCCTGACCGGCTTo
7.權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒應(yīng)用于痰液或拭子樣本中結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)。
8.使用權(quán)利要求1所述試劑盒檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法，其特征在于該試劑盒的檢測(cè)方法包括如下步驟: (1)樣本處理，估計(jì)痰液樣本的量，加入2-4倍體積的4%的NaOH溶液，充分混勻，室溫靜置液化10min-20min,使其充分液化；拭子樣本直接保存于拭子保存液中； (2)樣本洗滌，取液化的痰液或拭子沖洗液樣本轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，離心去除上清液收集沉淀，用樣本洗滌液洗滌沉淀，離心收集沉淀； (3)核酸提取，用樣本裂解液重懸上述沉淀，混勻，100°C溫浴裂解5-15min，立即置于冰上，然后離心，上清液即為樣本模板DNA ； (4)加樣反應(yīng)，取出檢測(cè)管，分別標(biāo)記陰性對(duì)照管、檢測(cè)管和陽(yáng)性對(duì)照管，依次分別加入陰性溶液、步驟(3)上清液和陽(yáng)性溶液，60-65°C條件下保溫30-60min ; (5)染料混合，上述步驟完成后，將上述陰性對(duì)照管、檢測(cè)管和陽(yáng)性對(duì)照管向下甩動(dòng)，使管中的擴(kuò)增反應(yīng)液與染料充分混合，離心使混合后的液體聚集于管底部； (6)結(jié)果判讀，肉眼觀察擴(kuò)增反應(yīng)液顏色，如果擴(kuò)增反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色則該表示樣本的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，如果擴(kuò)增反應(yīng)液呈現(xiàn)橙黃色則表示該樣本的檢測(cè)結(jié)果為陰性。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于陽(yáng)性對(duì)照管擴(kuò)增反應(yīng)液應(yīng)顯示為綠色，陰性對(duì)照管擴(kuò)增反應(yīng)液應(yīng)顯示為橙黃色，否則應(yīng)判定該實(shí)驗(yàn)無效 。
【文檔編號(hào)】C12M1/34GK103937666SQ201410185161
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月4日
【發(fā)明者】楊帆, 鄧旭, 王明儒, 王佳麗, 石中強(qiáng), 劉萬建, 楊致亭, 侯繼勝 申請(qǐng)人:青島漢唐生物科技有限公司