本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ZFHX4基因體細(xì)胞突變和食管癌患者預(yù)后的相關(guān)性，及其在食管癌患者預(yù)后診斷中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

食管癌是較為常見的惡性腫瘤，食管癌在臨床上是進(jìn)展較為快速的惡性腫瘤，不同的病人在臨床表現(xiàn)和預(yù)后方面有比較大的差異。食管癌的預(yù)后與確診時(shí)的疾病進(jìn)程相關(guān)，如果在發(fā)病早期診斷經(jīng)手術(shù)切除后5年生存率可達(dá)90%以上。在過(guò)去的幾十年中，隨著內(nèi)窺鏡等檢測(cè)技術(shù)的引入，手術(shù)和放化療水平的提升，食管癌的診斷和治療有了很大的改善；然而，依然缺乏有效的早期篩查和預(yù)后診斷方法，病人的生存率沒有顯著提高。一直以來(lái)，尋找早期篩查和預(yù)后診斷相關(guān)的生物標(biāo)志物是食管癌研究的重點(diǎn)。

腫瘤的發(fā)生源自于腫瘤細(xì)胞中基因組的變異的積累，這些變異以體細(xì)胞突變?yōu)橹鳎€包括基因結(jié)構(gòu)的變異、表觀遺傳的改變，以及基因表達(dá)的改變等一系列變化。體細(xì)胞突變產(chǎn)生于細(xì)胞DNA的復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中。在很多腫瘤中，體細(xì)胞的突變和環(huán)境暴露相關(guān)，不同的突變產(chǎn)生過(guò)程最終會(huì)導(dǎo)致腫瘤突變特征的差異。在腫瘤形成和發(fā)展過(guò)程會(huì)有大量的突變參與其中，這些突變很多位于重要的基因功能區(qū)域，但是只有很少的基因突變會(huì)在腫瘤的形成過(guò)程中起至關(guān)重要的驅(qū)動(dòng)作用。體細(xì)胞突變和驅(qū)動(dòng)基因的研究有助于更深入的理解腫瘤的發(fā)生機(jī)制，也有助于尋找腫瘤預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

二代測(cè)序技術(shù)為腫瘤基因組的研究開啟了新的篇章。通過(guò)基因組測(cè)序手段研究食管癌基因組變異，有助于發(fā)現(xiàn)新的診斷手段和治療方法，對(duì)腫瘤組織和正常組織的基因組的測(cè)序，我們可以獲得腫瘤的體細(xì)胞突變信息和結(jié)構(gòu)變異等信息。目前很多腫瘤基因組研究都致力于尋找與腫瘤早期診斷、預(yù)后和治療療效相關(guān)的生物標(biāo)志物。但食管癌與乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等被廣泛研究的癌癥不同，其分子機(jī)制的研究到迄今為止相對(duì)較為薄弱，發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確，沒有明確的分子分型，也沒有明確的藥物治療靶標(biāo)。因此，基于二代測(cè)序技術(shù)研究食管癌闡明食管癌的致病機(jī)理尤為迫切。

目前，針對(duì)于中國(guó)人群食管癌測(cè)序項(xiàng)目已經(jīng)完成了442例腫瘤組織和配對(duì)癌旁組織 (或血液樣本) 的基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了在食管癌中顯著性突變的16個(gè)基因，包括TP53, PIK3CA, NOTHC1, CDKN2A, NFE2L2, KMT2D等。這些基因的突變和食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但由于樣本量的限制，這些研究?jī)H僅發(fā)現(xiàn)了EP300基因的突變和食管癌的預(yù)后相關(guān)。

為了尋找和食管癌預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物，我們根據(jù)整合了442例已經(jīng)發(fā)表的食管癌基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)整合分析，發(fā)現(xiàn)了ZFHX4基因突變和食管癌患者的生存期顯著相關(guān)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供ZFHX4基因體作為食管癌預(yù)后診斷生物標(biāo)志物的用途。

本發(fā)明研究了ZFHX4基因細(xì)胞體突變(Somatic Mutation)和基因表達(dá)在食管癌中的功能和應(yīng)用。

本發(fā)明研究表明，ZFHX4基因突變會(huì)顯著導(dǎo)致食管癌病人的總體生存期縮短。

本發(fā)明提出的用于食管癌預(yù)后診斷的ZFHX4基因突變生物標(biāo)志物，及其在評(píng)估食管癌進(jìn)展及預(yù)后診斷中的應(yīng)用，包括：

（1）檢測(cè)樣品中編碼ZFHX4基因的DNA和mRNA序列；

（2）檢測(cè)樣品中編碼ZFHX4基因的突變位點(diǎn)，去除掉正常組織中攜帶的突變位點(diǎn)，獲得體細(xì)胞突變位點(diǎn)；

（3）檢測(cè)樣品中ZFHX4基因表達(dá)量。

進(jìn)一步，根據(jù)ZFHX4基因進(jìn)行突變檢測(cè)，判斷病人的預(yù)后。

本發(fā)明還提供一種通過(guò)二代測(cè)序方法，檢測(cè)ZFHX4基因突變?cè)谑彻馨╊A(yù)后診斷中的作用。

本發(fā)明提供的檢測(cè)ZFHX4基因體細(xì)胞突變的方法，包括下述步驟：

（1）從食管癌腫瘤組織和癌旁組織(或者外周血)中分別提取腫瘤DNA和正常組織DNA；

（2）對(duì)步驟（1)中提到的兩種DNA分別進(jìn)行全基因組和全外顯子組測(cè)序，或者進(jìn)行ZFHX4靶標(biāo)基因測(cè)序；

（3）對(duì)步驟（2)中的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，序列比對(duì)和體細(xì)胞突變檢測(cè)，獲得ZFHX4基因的體細(xì)胞突變；

（4）對(duì)ZFHX4體細(xì)胞突變對(duì)蛋白功能影響的評(píng)估。

此外，從常規(guī)臨床食管癌腫瘤和癌旁組織樣本中的FFPE或組織切片提取的基因組DNA可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的PCR的雙脫氧鏈終止測(cè)序法 (Sanger) 進(jìn)行突變檢測(cè)。相關(guān)引物包括：

表1. ZFHX4 測(cè)序引物

。

本發(fā)明中，通過(guò)對(duì)17對(duì)食管癌腫瘤組織和配對(duì)的癌旁組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，ZFHX4在腫瘤組織中顯著高表達(dá)。

本發(fā)明中，通過(guò)siRNA抑制ZFHX4基因在食管癌細(xì)胞系KYSE150和TE-1中的表達(dá)，利用Transwell實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)ZFHX4基因沉默后的腫瘤細(xì)胞侵襲能力顯著降低。

本發(fā)明中，通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)ZFHX4基因沉默后的腫瘤細(xì)胞的劃痕愈合能力顯著降低，提示ZFHX4基因表達(dá)抑制會(huì)影響食管癌細(xì)胞的遷移能力。

由上所述，ZFHX4可作為食管癌的治療靶點(diǎn)，包括向患者給予治療有效量的所述的生物標(biāo)志物抗體或其片段，所述抗體或其片段特異性地結(jié)合于所述的生物標(biāo)志物。

本發(fā)明還包括ZFHX4基因突變生物標(biāo)志物的抗體或其片段。

本發(fā)明所述的ZFHX4基因在GeneBank的登記號(hào)為79776，基因位于8q21.13基因組區(qū)域，包含15個(gè)外顯子。ZFHX4基因的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示， ZFHX4蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明提供的ZFHX4基因體細(xì)胞突變作為食管癌輔助判斷的標(biāo)志物優(yōu)越性在于：

（1）本發(fā)明首次闡明了ZFHX4基因和食管癌的關(guān)聯(lián)，即ZFHX4基因體細(xì)胞突變和食管癌病人生存期縮短顯著相關(guān)；

（2）本發(fā)明首次提出了ZFHX4基因表達(dá)和食管癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，可以作為新的食管癌治療的靶點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是生存曲線表示攜帶ZFHX4基因體細(xì)胞突變的食管癌病人，相對(duì)于不攜帶病人的總體生存期顯著縮短，p=0.005。442例病人中，有生存信息的病人總數(shù)為281，其中28個(gè)病人攜帶ZFHX4基因突變。Log-Rank檢驗(yàn)用于計(jì)算生存曲線顯著性差異P值。

圖2是ZFHX4基因在17對(duì)食管癌病人腫瘤組織和癌旁組織的基因表達(dá)變化。ZFHX4基因在腫瘤組織中的表達(dá)水平是正常組織中的1.6倍，分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t檢驗(yàn)p值=0.0001。

圖3是siRNA成功干擾ZFHX4基因在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)。和對(duì)照組相比，ZFHX4基因的表達(dá)水平在siRNA處理組中顯著降低 (p < 0.05)。

圖4是Transwell實(shí)驗(yàn)表明，siRNA抑制ZFHX4基因的表達(dá)水平，會(huì)導(dǎo)致食管癌細(xì)胞的侵襲能力下降 (P < 0.05)。

圖5是劃痕實(shí)驗(yàn)表明，siRNA抑制ZFHX4基因的表達(dá)水平，會(huì)導(dǎo)致食管癌細(xì)胞的遷移能力下降 (P < 0.05)。

圖6是(A) ZFHX4體細(xì)胞突變?cè)诨蛐蛄猩系姆植肌?B) ZFHX4突變和肝癌病人的預(yù)后顯著相關(guān)。

圖7是ZFHX4基因在其他腫瘤中的基因表達(dá)情況。ZFHX4基因在食管癌(ESCC)，肺癌(LUSC)，肺腺癌(LUAD)中，相對(duì)于正常組織顯著高表達(dá)。ZFHX4基因在肝癌(LIHC)，乳腺癌(BRCA)，直腸癌(READ)中相對(duì)于正常組織顯著下調(diào)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。但并不意味著本發(fā)明僅限于此。

實(shí)施例1、 442例食管癌腫瘤基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)ZFHX4基因體細(xì)胞突變和食管癌病人的預(yù)后相關(guān)聯(lián)。

本發(fā)明實(shí)施例中未作特殊說(shuō)明的操作方法均按照儀器說(shuō)明書進(jìn)行操作

1．樣本和數(shù)據(jù)來(lái)源

食管癌樣本均來(lái)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，按照倫理審查委員會(huì)規(guī)定的制度，每個(gè)病人在取樣前均簽署了之前同意書。病人均沒有采取放療和化療，手術(shù)是第一個(gè)治療方案。所有標(biāo)本收集后用液氮迅速凍存在-80℃。蘇木精-伊紅 (HE)染色切片，均由病理醫(yī)生在顯微鏡下進(jìn)行評(píng)估。要求腫瘤組織純度>80%。

本研究包含潮汕食管癌病人的17對(duì)全基因組和71對(duì)外顯子組測(cè)序，以及山西食管癌病人的14對(duì)全基因組和90對(duì)外顯子組測(cè)序。樣本測(cè)序Reads長(zhǎng)度為90 bp，獲得原始文件為fastq格式的文件。

此外，還整合了兩項(xiàng)大規(guī)模食管癌腫瘤基因組測(cè)序數(shù)據(jù)(Lin et al，Gao et al)，共包含442例食管癌病人。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是基于中國(guó)食管癌患者人群，通過(guò)比較癌和血液樣本間體細(xì)胞突變位點(diǎn)，尋找上述中國(guó)食管癌的驅(qū)動(dòng)基因，目的是找到和食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的腫瘤突變基因。

表2.食管癌腫瘤基因組數(shù)據(jù)集

17例食管癌腫瘤和癌旁組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)：

(GSE20347, https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。

2.實(shí)驗(yàn)材料

QIAamp DNA Mini kit (Qiagen)

Bioanalyser (Agilent Technologies)

Covaris E-210 (Covaris)

ABI StepOne plus real-time PCR system

NimbleGenEZ 44M human exome array

HiSeq 2000 (Illumina)。

3.實(shí)驗(yàn)方法

（1）基因組測(cè)序

采用QIAamp試劑盒提取腫瘤組織和癌旁組織(外周血)DNA，采用Covaris E-210將DNA序列碎片化，全基因組測(cè)序約500bp,全外顯子約200-300bp，構(gòu)建DNA文庫(kù)；用PCR系統(tǒng)進(jìn)行序列擴(kuò)增。外顯子測(cè)序采用NimbleGenEZ人外顯子芯片進(jìn)行外顯子區(qū)域序列的富集。測(cè)序采用HiSeq 2000平臺(tái)，測(cè)序長(zhǎng)度為90bp, 采用雙端測(cè)序策略。

（2）測(cè)序數(shù)據(jù)序質(zhì)量控制和基因突變分析流程和軟件如下：

（a）數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估采用FastQC(0.11.2)軟件，該軟件可以統(tǒng)計(jì)測(cè)序片段的每個(gè)堿基的測(cè)序質(zhì)量分布，GC含量分布，以及測(cè)序接頭殘留和建庫(kù)過(guò)程中的duplication等；FastQC(0.11.2)軟件 見http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/；

（b）序列比對(duì)軟件采用BWA(0.5.9)1，使用默認(rèn)參數(shù)，參考基因組為NCBI hg192。SAMtools(0.1.18)3用于去除沒有比對(duì)到人類參考基因組上的Reads，Picard (http://picard.sourceforge.net/)用于標(biāo)記和去除建庫(kù)過(guò)程中產(chǎn)生的PCR duplication；

（c）體細(xì)胞突變(somatic mutation)圖譜構(gòu)建，采用GATK (2.5)4官網(wǎng)提供的標(biāo)準(zhǔn)分析流程(https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices bpm=DNAseq)優(yōu)化比對(duì)結(jié)果，包括在人類已知的indel區(qū)域的重新比對(duì)以及對(duì)測(cè)序質(zhì)量分?jǐn)?shù)的矯正，以獲得更加準(zhǔn)確的基因突變結(jié)果。采用SAMtools mpileup3和VarScan2 somatic5獲得基因組體細(xì)胞變異位點(diǎn)，構(gòu)建DNA體細(xì)胞突變圖譜(參數(shù)：–min-coverage 10 –min-coverage-normal 10 –min-coverage-tumour 10 –min-var-freq 0.1 –min-avg-qual 0)；

（d）種系突變(germline mutation)圖譜構(gòu)建，采用GATK (2.5)4官網(wǎng)提供的標(biāo)準(zhǔn)分析流程優(yōu)化比對(duì)結(jié)果。采用GATK的UnifiedGenotyper模塊，以及VarScan2突變檢測(cè)軟件獲得所有種系突變和體細(xì)胞突變；

（e）突變注釋：利用Oncotator 1.9軟件對(duì)442例病人的體細(xì)胞突變進(jìn)行注釋，獲得體細(xì)胞突變所對(duì)應(yīng)的基因信息，以及體細(xì)胞突變對(duì)于基因序列和蛋白序列影響等信息；

（f）驅(qū)動(dòng)基因分析：采用MutSigCV算法，尋找和食管癌相關(guān)的驅(qū)動(dòng)基因；

（g）利用dbNSFP數(shù)據(jù)庫(kù)和CADD算法，評(píng)估突變位點(diǎn)對(duì)蛋白功能影響；

（h）（生存分析：對(duì)于每一個(gè)基因，按照是否攜帶該基因的突變，將病人分為兩組，比較兩組病人總體生存期的差異。采用Kaplan–Meier生存曲線表示兩組病人生存期的差異；Log-Rank檢驗(yàn)生存差異的顯著性，計(jì)算p值。生存分析采用了R語(yǔ)言的Survival程序包；

（i）差異表達(dá)分析：芯片數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理采用了Robust Multi-array Average (RMA)算法，隨后對(duì)表達(dá)值進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換。根據(jù)倍數(shù)變化 (Fold Change) 和顯著性t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)差異表達(dá)基因。差異表達(dá)基因的判斷標(biāo)準(zhǔn)為基因表達(dá)值倍數(shù)變化大于1.5，顯著性t檢驗(yàn)p值小于0.05。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)論

通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)大約8.5% (38/442) 的食管癌病人攜帶ZFHX4基因的體細(xì)胞突變。攜帶ZFHX4突變病人的生存期顯著縮短 (p = 0.00506)。此外，ZFHX4基因在腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織。

實(shí)施例2、TCGA腫瘤基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)ZFHX4基因體細(xì)胞突變攜帶可以導(dǎo)致肝癌患者的生存期明顯縮短。

1.實(shí)驗(yàn)材料

整合TCGA項(xiàng)目，共包含13種腫瘤類型和4119個(gè)腫瘤病人的腫瘤基因組數(shù)據(jù)。

表3.13種TCGA腫瘤基因組數(shù)據(jù)集。

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2.實(shí)驗(yàn)方法

（a）生存分析：對(duì)于每一個(gè)基因，按照是否攜帶該基因的突變，將每一種類型的腫瘤病人分為兩組，比較兩組病人總體生存期的差異。采用Kaplan–Meier生存曲線表示兩組病人生存期的差異。Log-Rank檢驗(yàn)生存差異的顯著性，計(jì)算p值；

（b）差異表達(dá)分析：數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理采用了FPKM算法，隨后對(duì)表達(dá)值進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換。根據(jù)倍數(shù)變化 (Fold Change) 和顯著性t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)差異表達(dá)基因。差異表達(dá)基因的判斷標(biāo)準(zhǔn)為基因表達(dá)值倍數(shù)變化大于1.5，顯著性t檢驗(yàn)p值小于0.05。

3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

通過(guò)腫瘤基因組測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)大約腫瘤病人廣泛攜帶ZFHX4基因的體細(xì)胞突變。其中，在肝癌患者中，攜帶ZFHX4突變病人的生存期顯著縮短 (p = 0.01)。此外，ZFHX4基因在多個(gè)腫瘤組織中表達(dá)紊亂。

實(shí)施例3、Transwell 實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZFHX4基因和食管癌細(xì)胞的侵襲能力相關(guān)。

1.實(shí)驗(yàn)材料

Kyse150&TE-1細(xì)胞 (中科院，China)

HilyMax轉(zhuǎn)染試劑盒 (Dojindo，Japan)

ZFHX4 siRNA (吉瑪生物，China)

Transwell板 (Corning，USA)。

2.實(shí)驗(yàn)方法

（a）將培養(yǎng)好的Kyse150 & TE-1細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中 (2*10^5/孔)，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；

（b）將先一天接種好的細(xì)胞用PBS清洗2遍，再加入500ul無(wú)血清1640培養(yǎng)基待用；

（c）轉(zhuǎn)染：(1) 加入120ulOpti-MEM培養(yǎng)基 (gibco，USA) 至ep管；(2) 向(1)中培養(yǎng)基中加入ZFHX4 siRNA 80 pmol，用移液器吹打混勻；(3) 加入HilyMax轉(zhuǎn)染試劑 (Dojindo，Japan) 12ul至以上溶液中，并用移液器輕輕吹打混勻；(4) 室溫靜置15min；(5) 將靜置之后的復(fù)合體溶液加入到2中準(zhǔn)備好的Kyse150和TE-1細(xì)胞中并輕輕震蕩培養(yǎng)板混勻；

（d）將細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6h；

（e）去掉培養(yǎng)板中舊的培養(yǎng)基，加入新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；

（f）制備細(xì)胞懸液：消化各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，離心并棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗1遍，再用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5*10^5個(gè)/ml；

（g）接種細(xì)胞：往每孔小室中加入200ul細(xì)胞懸液 (24孔小室)，往下室中加入500ul含10%FBS的培養(yǎng)基；

（h）培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)48h；

（i）計(jì)數(shù)：用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞；24孔板中加入500μl含10% cck-8試劑的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37℃ 3h后取出；吸取100ul溶液至96孔板中，96孔板于酶標(biāo)儀上測(cè)OD值。

3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

選取代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。結(jié)果顯示，對(duì)KYSE150和TE-1細(xì)胞的ZHFX基因進(jìn)行干擾后，期遷移能力明顯降低 (KYSE150 ZFHX4 siRNA: P<0.05；TE-1 ZFHX4 siRNA: P<0.005)。

實(shí)施例4、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZHFX4基因和食管癌細(xì)胞的侵襲能力相關(guān)。

1.實(shí)驗(yàn)材料

Kyse150&TE-1細(xì)胞 (中科院，China)

HilyMax轉(zhuǎn)染試劑盒 (Dojindo，Japan)

ZFHX4 siRNA (吉瑪生物，China)。

2.實(shí)驗(yàn)方法

（a）將培養(yǎng)好的KYSE150和TE-1細(xì)胞 (中科院，China) 接種于24孔培養(yǎng)板中(1*10^5/孔)，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；

（b）將前一天接種好的細(xì)胞去除培養(yǎng)基，用10ul的槍頭在接種好的細(xì)胞表面劃出一道痕跡，并做好標(biāo)記，用PBS清洗2遍，再加入500ul 1640培養(yǎng)基 (gibco，USA) 待用；

（c）轉(zhuǎn)染：(1) 加入30ul Opti-MEM培養(yǎng)基 (gibco，USA) 至ep管；(2) 向a培養(yǎng)基中加入ZHFX4基因的siRNA 20pmol，用移液器吹打混勻；(3) 加入HilyMax轉(zhuǎn)染試劑 (Dojindo，Japan) 3ul至以上溶液中，并用移液器輕輕吹打混勻；(4) 室溫靜置15min；(5) 將靜置之后的復(fù)合體溶液加入到2中準(zhǔn)備好的KYSE150和TE-1細(xì)胞中并輕輕震蕩培養(yǎng)板混勻；

（d）將細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6h；

（e）去掉培養(yǎng)板中舊的培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；

（f）分別在轉(zhuǎn)染后0h，24h對(duì)劃痕處進(jìn)行拍照。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)論

選取代表性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。結(jié)果顯示，對(duì)KYSE150和TE-1細(xì)胞的ZHFX4基因進(jìn)行干擾后，期遷移能力明顯降低 (KYSE150 ZFHX4 siRNA: P<0.001；TE-1 ZFHX4 siRNA: P<0.05)。

SEQUENCE LISTING

<110> 復(fù)旦大學(xué)

<120> ZFHX4作為食管癌預(yù)后診斷的生物標(biāo)志物

<130> 001

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2847

<212> DNA

<213>

<400> 1

atgatgcagt ctgtccagca cccaggtctc cctccacagc tggctttaca gctgcccagt 60

atggactccc tctccacaga ccttacacag ctctgccagc agcagttggg tcttgatcca 120

aacttcctcc gtcagtctca gttcaagcga ccacgcactc gcataactga tgatcagctt 180

aagatactcc gtgcaaactt tgatataaat aattccccta atgaagaaca aattcaagaa 240

atgtcagaga agtctggctt gccacaaaaa gtcataaagc actggttccg taacactttg 300

ttcaaagaaa gacagaggag taaagactct ccctacaact tcaatattcc tccaattact 360

acattagaag atataagaat ggagccccaa gtcagtgcac atgagtacta cagaactgac 420

tcagccatta acaagaggtc ctctaggacc agattcactg attatcaact gagggtgcta 480

caagactttt ttgacactaa tgcatatcca aaggatgatg agattgagca gctctccaca 540

gtactcaacc tgccaacacg agtcattgtg gtgtggttcc aaaatgcccg ccaaaaggct 600

cggaagagtt atgaaaatca ggcagattca aaggacaatg agaaaaaaga gctcaccaat 660

gagagataca ttagaaccag caacatgcag taccagtgca agaaatgcaa tattgtattt 720

ccccgcatct ttgatcttat tactcaccag aaaaagttgt gctacaaaga tgaagatgaa 780

gaggggaatg aggacaacat cagtgaggaa tacacagata atcttgaacc acctctattc 840

aagacaaatc tgacaccatt agagctaccc aaaccatccc agtctgggac tgctaccagt 900

tcaggctcaa gctcacctgt gatggcctca cctcgtggtc ccttggggaa agcatcacca 960

aagccagata tcttccctga aacagaactg aaacaatctg agatcccctc ttcaccagtg 1020

ataaaatcac taccagaacc aagaccatct aaggcttgca cccctcaacc acccccccaa 1080

aaagctcccc agccacagtt gtcaagaccc cattctcagc cacaagcagc aacagtaccg 1140

tcaagtccac tttcgcttgc gctttcctca ctcacaaaca gtatccccca ccagatgctt 1200

cagtaccagt gtgaccagtg taagattgcc tttcctacag tagagctgtg gcaagagcac 1260

cagcacatgc attttctggc agcccagaac caatttctcc attctcagtt tcttgaaaga 1320

cccatcgata tgccgtatat gatatttgat ccaaacaacc ccctaatggc tagccaactg 1380

ttatctgggg ggctctccca aatgccatcc caaagtagct caagtatggc tacagctgta 1440

agctctgggt caatgaagag aaaactggat gacaaagagg aaaatgctaa tgataaagat 1500

ggtggaaaca gtagtgaaga gcaacataga gataaacgtt tgaggaccac cattacacca 1560

gaacaattgg aaatccttta tgacaaatat ctacttgact ctaatccaac aaggaagatg 1620

ttggaccaca ttgcacgaga agttggcttg aagaagagag ttgtgcaagt ctggttccaa 1680

aacactcgtg caagagagag aaagggtcag tttagagcta tagggccctc acagtcccat 1740

aagaaatgtc ccttttgcag agctctcttt aaggctaaat ctgctttaga tagccacata 1800

agatcaagac attggcatga ggctaaacaa gcaggattta gcttgccacc aagcccaatg 1860

atgaatcaag acaacgaaag aggtgaaagc ccaaataagt ataatttctt tgactaccca 1920

cagctgccca acaagacaga gccaaatgac tatgagttgc caactgcatc ctcaactcca 1980

gtcaaaccat ctgaggctca agtaaaaaac ttcttaagcc cttcatcctt aaaagctgaa 2040

aactgtgatg aaactgaagg gcctaataat aattcagcag aagcttcatc ttatgatctc 2100

agtaagatgg acttcgatga gacatcatca attaatacag ccattagtga tgtcacaact 2160

ggagatgagt gtaacaacaa cgaggttgag agcctaactg ctaatggagg agacaagatg 2220

aacgacagta aaaagggcct gttgctaaat tctgatgcga gtaatgaaag gtttcaattc 2280

agcatggtga gccctgccct cagcttctct ggaaaagact gtgactccta ctttagctcc 2340

agagacgacg aaatggatga taataatgac agaagtgaat cgtccagcct tgctgacccc 2400

agttctccca gtccatttgg ggcaggtaac cctttcagca aatctggaaa agtcaacaat 2460

actggagatc gaccaggtca caaacgtttc aggacccaga tgagtaactt gcaactgaaa 2520

gtactcaaag catgttttag tgactatcgc actcctacaa tgcaggagtg tgaaatgctg 2580

ggcaatgaaa ttggacttcc caaacgtgtt gtccaggttt ggttccagaa tgcccgtgct 2640

aaagagaaga agtttaagat taatattggc aagccattta tgataagtca gggttcacca 2700

gaggggccca ggactgagtg tacactgtgt ggtgtaaagt acacagcccg gatgtctgtg 2760

agagaccaca ttttctccaa acagcacatc acaaaagtgc aagaaactct aggaaaccag 2820

gtgcaggagg actaaatcaa caccaag 2847

<210> 2

<211> 944

<212> PRT

<213>

<400> 2

Met Met Gln Ser Val Gln His Pro Gly Leu Pro Pro Gln Leu Ala Leu

1 5 10 15

Gln Leu Pro Ser Met Asp Ser Leu Ser Thr Asp Leu Thr Gln Leu Cys

20 25 30

Gln Gln Gln Leu Gly Leu Asp Pro Asn Phe Leu Arg Gln Ser Gln Phe

35 40 45

Lys Arg Pro Arg Thr Arg Ile Thr Asp Asp Gln Leu Lys Ile Leu Arg

50 55 60

Ala Asn Phe Asp Ile Asn Asn Ser Pro Asn Glu Glu Gln Ile Gln Glu

65 70 75 80

Met Ser Glu Lys Ser Gly Leu Pro Gln Lys Val Ile Lys His Trp Phe

85 90 95

Arg Asn Thr Leu Phe Lys Glu Arg Gln Arg Ser Lys Asp Ser Pro Tyr

100 105 110

Asn Phe Asn Ile Pro Pro Ile Thr Thr Leu Glu Asp Ile Arg Met Glu

115 120 125

Pro Gln Val Ser Ala His Glu Tyr Tyr Arg Thr Asp Ser Ala Ile Asn

130 135 140

Lys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Phe Thr Asp Tyr Gln Leu Arg Val Leu

145 150 155 160

Gln Asp Phe Phe Asp Thr Asn Ala Tyr Pro Lys Asp Asp Glu Ile Glu

165 170 175

Gln Leu Ser Thr Val Leu Asn Leu Pro Thr Arg Val Ile Val Val Trp

180 185 190

Phe Gln Asn Ala Arg Gln Lys Ala Arg Lys Ser Tyr Glu Asn Gln Ala

195 200 205

Asp Ser Lys Asp Asn Glu Lys Lys Glu Leu Thr Asn Glu Arg Tyr Ile

210 215 220

Arg Thr Ser Asn Met Gln Tyr Gln Cys Lys Lys Cys Asn Ile Val Phe

225 230 235 240

Pro Arg Ile Phe Asp Leu Ile Thr His Gln Lys Lys Leu Cys Tyr Lys

245 250 255

Asp Glu Asp Glu Glu Gly Asn Glu Asp Asn Ile Ser Glu Glu Tyr Thr

260 265 270

Asp Asn Leu Glu Pro Pro Leu Phe Lys Thr Asn Leu Thr Pro Leu Glu

275 280 285

Leu Pro Lys Pro Ser Gln Ser Gly Thr Ala Thr Ser Ser Gly Ser Ser

290 295 300

Ser Pro Val Met Ala Ser Pro Arg Gly Pro Leu Gly Lys Ala Ser Pro

305 310 315 320

Lys Pro Asp Ile Phe Pro Glu Thr Glu Leu Lys Gln Ser Glu Ile Pro

325 330 335

Ser Ser Pro Val Ile Lys Ser Leu Pro Glu Pro Arg Pro Ser Lys Ala

340 345 350

Cys Thr Pro Gln Pro Pro Pro Gln Lys Ala Pro Gln Pro Gln Leu Ser

355 360 365

Arg Pro His Ser Gln Pro Gln Ala Ala Thr Val Pro Ser Ser Pro Leu

370 375 380

Ser Leu Ala Leu Ser Ser Leu Thr Asn Ser Ile Pro His Gln Met Leu

385 390 395 400

Gln Tyr Gln Cys Asp Gln Cys Lys Ile Ala Phe Pro Thr Val Glu Leu

405 410 415

Trp Gln Glu His Gln His Met His Phe Leu Ala Ala Gln Asn Gln Phe

420 425 430

Leu His Ser Gln Phe Leu Glu Arg Pro Ile Asp Met Pro Tyr Met Ile

435 440 445

Phe Asp Pro Asn Asn Pro Leu Met Ala Ser Gln Leu Leu Ser Gly Gly

450 455 460

Leu Ser Gln Met Pro Ser Gln Ser Ser Ser Ser Met Ala Thr Ala Val

465 470 475 480

Ser Ser Gly Ser Met Lys Arg Lys Leu Asp Asp Lys Glu Glu Asn Ala

485 490 495

Asn Asp Lys Asp Gly Gly Asn Ser Ser Glu Glu Gln His Arg Asp Lys

500 505 510

Arg Leu Arg Thr Thr Ile Thr Pro Glu Gln Leu Glu Ile Leu Tyr Asp

515 520 525

Lys Tyr Leu Leu Asp Ser Asn Pro Thr Arg Lys Met Leu Asp His Ile

530 535 540

Ala Arg Glu Val Gly Leu Lys Lys Arg Val Val Gln Val Trp Phe Gln

545 550 555 560

Asn Thr Arg Ala Arg Glu Arg Lys Gly Gln Phe Arg Ala Ile Gly Pro

565 570 575

Ser Gln Ser His Lys Lys Cys Pro Phe Cys Arg Ala Leu Phe Lys Ala

580 585 590

Lys Ser Ala Leu Asp Ser His Ile Arg Ser Arg His Trp His Glu Ala

595 600 605

Lys Gln Ala Gly Phe Ser Leu Pro Pro Ser Pro Met Met Asn Gln Asp

610 615 620

Asn Glu Arg Gly Glu Ser Pro Asn Lys Tyr Asn Phe Phe Asp Tyr Pro

625 630 635 640

Gln Leu Pro Asn Lys Thr Glu Pro Asn Asp Tyr Glu Leu Pro Thr Ala

645 650 655

Ser Ser Thr Pro Val Lys Pro Ser Glu Ala Gln Val Lys Asn Phe Leu

660 665 670

Ser Pro Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asn Cys Asp Glu Thr Glu Gly Pro

675 680 685

Asn Asn Asn Ser Ala Glu Ala Ser Ser Tyr Asp Leu Ser Lys Met Asp

690 695 700

Phe Asp Glu Thr Ser Ser Ile Asn Thr Ala Ile Ser Asp Val Thr Thr

705 710 715 720

Gly Asp Glu Cys Asn Asn Asn Glu Val Glu Ser Leu Thr Ala Asn Gly

725 730 735

Gly Asp Lys Met Asn Asp Ser Lys Lys Gly Leu Leu Leu Asn Ser Asp

740 745 750

Ala Ser Asn Glu Arg Phe Gln Phe Ser Met Val Ser Pro Ala Leu Ser

755 760 765

Phe Ser Gly Lys Asp Cys Asp Ser Tyr Phe Ser Ser Arg Asp Asp Glu

770 775 780

Met Asp Asp Asn Asn Asp Arg Ser Glu Ser Ser Ser Leu Ala Asp Pro

785 790 795 800

Ser Ser Pro Ser Pro Phe Gly Ala Gly Asn Pro Phe Ser Lys Ser Gly

805 810 815

Lys Val Asn Asn Thr Gly Asp Arg Pro Gly His Lys Arg Phe Arg Thr

820 825 830

Gln Met Ser Asn Leu Gln Leu Lys Val Leu Lys Ala Cys Phe Ser Asp

835 840 845

Tyr Arg Thr Pro Thr Met Gln Glu Cys Glu Met Leu Gly Asn Glu Ile

850 855 860

Gly Leu Pro Lys Arg Val Val Gln Val Trp Phe Gln Asn Ala Arg Ala

865 870 875 880

Lys Glu Lys Lys Phe Lys Ile Asn Ile Gly Lys Pro Phe Met Ile Ser

885 890 895

Gln Gly Ser Pro Glu Gly Pro Arg Thr Glu Cys Thr Leu Cys Gly Val

900 905 910

Lys Tyr Thr Ala Arg Met Ser Val Arg Asp His Ile Phe Ser Lys Gln

915 920 925

His Ile Thr Lys Val Gln Glu Thr Leu Gly Asn Gln Val Gln Glu Asp

930 935 940

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 3

ggagaactgt gggcagagag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 4

aggtaaggtc cgctttggtt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 5

ggagaactgt gggcagagag 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213>

<400> 6

aaggtaaggt ccgctttgg 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 7

cactcgagga actcatgcaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 8

acaaacctca caacggaagg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 9

acaaacctca caacggaagg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 10

aaggtaaggt ccgctttggt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 11

gggcagagag cgaaactatg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 12

aggtaaggtc cgctttggtt 20