本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種調控玉米雄穗分枝數(shù)主效QTL的分子標記及其應用。

技術背景

雄穗作為玉米重要的生殖器官，其不僅直接影響玉米種子生產(chǎn)質量，而且與玉米產(chǎn)量形成密切相關。大量研究表明具有較小雄穗的玉米植株，群體下部的透光性強，雄穗生長對養(yǎng)分的消耗少，進而提高玉米產(chǎn)量。此外，學者研究還發(fā)現(xiàn)玉米雄穗與抗旱性緊密相關，干旱脅迫下玉米雄穗相關指標如雄穗主軸長和雄穗穗柄長等明顯縮短、雄穗分枝數(shù)明顯減少、抽雄吐絲時間間隔(anthesis-silking interval,ASI)明顯延長，最終導致玉米嚴重減產(chǎn)。雄穗分枝數(shù)是雄穗大小的重要評價指標，因此深入剖析玉米雄穗分枝性狀的遺傳機理及揭示其與抗旱性的內在關系，對玉米高產(chǎn)育種具有重要意義。

雄穗分枝數(shù)差異是玉米雄穗的一個重要特征，不同遺傳背景材料間的雄穗分枝數(shù)差異較大。有的自交系材料雄穗分枝數(shù)很多，但有的自交系材料雄穗分枝數(shù)很少，甚至無分枝。就遺傳表現(xiàn)來說，雄穗分枝數(shù)是由多基因控制的復雜數(shù)量性狀，機理極其復雜，且易受環(huán)境影響，因此這給玉米雄穗機理研究帶來了諸多困難。近年來，隨著分子生物學的深入研究和分子標記技術的不斷完善，利用數(shù)量性狀基因位點(quantitative trait locus,QTL)定位可以大致確定相關數(shù)量性狀的基因位點和位置，估算各位點的遺傳效應，進而為將來分子育種提供理論基礎和技術支撐。目前，玉米雄穗分枝數(shù)QTL定位研究已成為學者和育種家關注的熱點課題，但具有應用價值的雄穗分枝數(shù)QTL位點較少，因此，挖掘不同遺傳背景下及不同環(huán)境下都穩(wěn)定表達的雄穗分枝數(shù)主效QTL對玉米高產(chǎn)育種具有巨大的潛在應用價值。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種調控玉米雄穗分枝數(shù)主效QTL的分子標記，本發(fā)明還提供輔助選擇雄穗分枝較少玉米的方法，本發(fā)明還提供調控玉米雄穗分枝數(shù)主效QTL的分子標記在玉米育種中的應用。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下三項技術方案：

第一、一種調控玉米雄穗分枝數(shù)主效QTL的分子標記，其特征在于：由umc2177和umc1378兩對引物組成，所述引物umc2177的序列為：

Forward:5’-ACCATGCATGTCTCACGTCACT-3’

Reverse:5’-GGGTACGTGCTGTGGAGGAC-3’

所述引物umc1378的序列為：

Forward:5’-GAAGTCGCTGATGAGAACGTAACC-3’

Reverse:5’-GCTAGCTAGTGTGAGTTCTTCCGC-3’。

第二、一種輔助選擇雄穗分枝較少玉米的方法，步驟如下：提取待測玉米的基因組DNA；用引物umc2177和umc1378進行PCR擴增；當?shù)玫介L度為234bp和331bp的擴增產(chǎn)物，則待測玉米為雄穗分枝較少的玉米。

第三、調控玉米雄穗分枝數(shù)主效QTL的分子標記在玉米育種中的應用，其特征在于：用本發(fā)明提供的輔助選擇雄穗分枝較少玉米的方法鑒定出候選雄穗分枝較少的玉米，再將候選雄穗分枝較小的玉米應用于玉米育種。

本發(fā)明通過對兩套F_2:3家系的雄穗分枝數(shù)QTL進行分析，在多水分環(huán)境處理下發(fā)現(xiàn)在玉米第七染色體Bin7.00區(qū)域的umc2177和umc1378標記之間存在一個調控玉米雄穗分枝數(shù)的主效QTL，發(fā)明人將該主效QTL命名為qTBN-Ch.7-1。在多個水分環(huán)境處理下，該qTBN-Ch.7-1在兩套F_2:3家系的累積表型貢獻率分別為46.01％和34.09％。分析表明利用這兩對SSR標記對待測玉米進行PCR擴增，可以對待測玉米的雄穗大小進行預測。

本發(fā)明的有益效果在于：通過本發(fā)明公布的分子標記進行分子標記輔助選擇，只需檢測分子標記的特征擴增條帶，即可預測玉米雄穗大小，此鑒定方法易于操作、簡單可行、選擇效率高?？稍谟衩咨缙阼b定出雄穗較小的玉米單株，淘汰其它單株，選擇目標明確，且不受環(huán)境影響，有效提高候選玉米的育種利用價值。

附圖說明

圖1 LTpop雄穗分枝數(shù)的頻率分布圖；

圖2 CTpop雄穗分枝數(shù)的頻率分布圖；

圖3 LTpop遺傳連鎖圖譜及雄穗分枝數(shù)主效QTL定位示意圖；

圖4 CTpop遺傳連鎖圖譜及雄穗分枝數(shù)主效QTL定位示意圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，下述實施例中試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)試驗方法，下述實施例中所述的實驗試劑及耗材如無特殊說明，均來自常規(guī)生化試劑公司。

本實施例中，獲得調控玉米雄穗分枝數(shù)主效QTL的分子標記的詳細步驟如下：

1.玉米F_2:3群體構建及不同水分環(huán)境處理下雄穗分枝數(shù)的測定

以本課題組前期篩選獲得的雄穗分枝數(shù)及抗旱性差異較大的3份自交系為親本構建了兩套F₂分離群體，F(xiàn)₂分離群體自交獲得F_2:3家系。其中廊黃/昌7-2為雄穗分枝數(shù)少且強耐旱自交系作為母本，TS141為雄穗分枝數(shù)多且旱敏感自交系作為共同父本。廊黃與TS141構建的F_2:3家系簡稱為LTpop，其包含202個株系；昌7-2與TS141構建的F_2:3家系簡稱為CTpop，其包含218個株系。2014年于武威(37.97°N，102.63°E；1508m)和張掖(38.83°N，106.93°E；1536m)種植LTpop及相應親本。2015年于古浪(36.67°N，102.85°E；1785m)和景泰(37.18°N，104.03°E；1640m)種植CTpop及相應親本。兩套F_2:3家系在四個試驗點都分別進行干旱脅迫處理和正常供水處理，采用平膜滴灌技術，按完全隨機區(qū)組設計，三次重復，雙行區(qū)，行長6.0m，株距0.5m，行距0.6m。干旱脅迫處理是在大喇叭口期前到花期結束進行不灌水，其它時期每隔20d灌水一次。正常供水處理是在玉米生長過程中缺水時及時灌水。

在不同水分環(huán)境處理下，分別選擇兩套F_2:3家系中長勢整體一致單株10株，待花期結束時測定每一單株的雄穗分枝數(shù)(tassel branch number，TBN；TBN為雄穗一級分枝數(shù))，然后取其平均值代表每一株系的雄穗大小。根據(jù)公式：

計算廣義遺傳力(H²)，式中：為基因型方差，為基因型與環(huán)境互作方差，為誤差，n為環(huán)境個數(shù)，r為重復數(shù)。2套F_2:3家系雄穗分枝數(shù)鑒定結果見表1。所得LTpop雄穗分枝數(shù)的頻率分布圖見圖1所示；所得CTpop雄穗分枝數(shù)的頻率分布圖見圖2所示。

表1兩套F_2:3家系雄穗分枝數(shù)測定值

Table 1The value of tassel branch number(TBN)in two F_2:3populations,respectively

表中字符說明：W-W、S-W、W-Z、S-Z、W-G、S-G、W-J、S-J分別為武威正常供水處理、武威干旱脅迫處理、張掖正常供水處理、張掖干旱脅迫處理、古浪正常供水處理、古浪干旱脅迫處理、景泰正常供水處理、景泰干旱脅迫處理；以下同。

由表1可知：同一水分環(huán)境處理下，母本廊黃/昌7-2與父本TS141的雄穗分枝數(shù)差異顯著；干旱脅迫處理下，3份自交系的雄穗分枝數(shù)都呈降低趨勢，但旱敏感自交系TS141的雄穗分枝數(shù)降低程度遠遠高于強耐旱自交系廊黃/昌7-2。

由表1、圖1和圖2可知：不同水分環(huán)境處理下，構建的兩套F_2:3家系的雄穗分枝數(shù)呈典型的正態(tài)分布，且雄穗分枝數(shù)的廣義遺傳力較大為78.69％和84.26％，表明雄穗分枝數(shù)是受多基因控制的數(shù)量性狀，且受遺傳本質影響較大，對其進行QTL分析是可行的。

2.SSR標記設計及其多態(tài)性篩選

在玉米基因組數(shù)據(jù)庫MaizeGDB網(wǎng)站(http://www.maizegdb.org/)選擇均勻分布于玉米10條染色體的SSR標記872對，上海Sangon合成。采用CTAB法提取親本廊黃、昌7-2、TS141基因組DNA，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，用德國IMPLEN微量分光光度儀檢測DNA濃度。PCR反應體系見表2，PCR擴增反應程序見表3，擴增產(chǎn)物用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染。

經(jīng)分析，在親本廊黃與TS141間篩選出213對條帶清晰、多態(tài)性好的SSR標記，在親本昌7-2與TS141間篩選出217對條帶清晰、多態(tài)性好的SSR標記。這些多態(tài)性SSR標記將用于兩套F₂分離群體基因型分析，并進入步驟3構建相應的遺傳連鎖圖譜。

表2PCR反應體系

Table 1The PCR reaction system

表3PCR擴增反應程序

Table 2The PCR amplification reaction process

3.遺傳連鎖圖譜構建

利用步驟1構建的兩套F₂分離群體及步驟2篩選出的相應的多態(tài)性SSR標記，對兩套相應的F₂分離群體進行基因型分析，并采用JoinMap4.0軟件(http://www.kyazma.nl/index.php/mc.JoinMap/sc.Evaluate/)構建遺傳連鎖圖譜，利用Kosambi函數(shù)計算遺傳距離(centimorgan，cM)。所得LTpop的遺傳連鎖圖譜見圖3；所得CTpop的遺傳連鎖圖譜見圖4。

由圖2和圖3可知：構建的兩套遺傳連鎖圖譜分別各包含199和205對SSR標記，覆蓋了玉米的10個連鎖群，總遺傳距離為1542.5cM和1648.8cM，分子標記間平均遺傳距離為7.8cM和8.0cM。兩套遺傳圖譜與IBM2 2008Neighbors(http://www.maizegdb.org/data_center/map)相比，標記在參考圖譜上的相對順序高度一致。

4.雄穗分枝數(shù)主效QTL定位

根據(jù)兩套F_2:3家系在不同水分環(huán)境處理下的雄穗分枝數(shù)表型值，采用Windows QTL Cartographer version 2.5軟件(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLcart.htm)中的復合區(qū)間作圖法(composite interval mapping，CIM)檢測相應的F_2:3家系的雄穗分枝數(shù)QTL。就CIM而言，采用Zmapqtl程序模塊Model 6,窗口大小為10.0cM，每隔0.5cM對雄穗分枝數(shù)進行基因型掃描，通過1000次抽樣確定LOD閾值(LOD>3.0)。根據(jù)顯性效應(D)與加性效應(A)之比的絕對值來估計QTL作用方式(Stuberet al.1987)：|D/A|＝0.00～0.20為加性(A)，|D/A|＝0.21～0.80為部分顯性(PD)，|D/A|＝0.81～1.20為顯性(D)，|D/A|>1.20為超顯性(OD)。QTL命名參照McCouch et al.(1997)的命名方法，即q+性狀名稱縮寫+染色體名稱+QTL在染色體上序號。采用Patentin version 3.5軟件生成主效雄穗分枝數(shù)QTL兩端SSR標記序列表；主效雄穗分枝數(shù)QTL兩端SSR標記序列表在說明書末尾。所得LTpop雄穗分枝數(shù)主效QTL定位示意圖見圖3；所得CTpop雄穗分枝數(shù)主效QTL定位示意圖見圖4。兩套F_2:3家系雄穗分枝數(shù)主效QTL檢測結果見表4。

表4兩套F_2:3家系雄穗分枝數(shù)QTL檢測

Table 4The QTL analysis for tassel branch number(TBN)in two F_2:3populations,respectively

經(jīng)CIM分析表明，由表4、圖3和圖4可知，兩套F_2:3家系在多個水分環(huán)境下同時檢測到了一個調控雄穗分枝數(shù)的主效QTL為命名為qTBN-Ch.7-1，其位于第七染色體Bin 7.00處，介于標記umc2177與umc1378之間，基因的作用方式以超顯性效應為主，減小雄穗分枝數(shù)的等位基因均來源于親本廊黃/昌7-2。在LTpop中該QTL在2個干旱脅迫處理下及1個正常供水處理下被同時檢測到，其累積表型貢獻率為46.01％，遺傳距離為19.7cM。在CTpop中該QTL在2個干旱脅迫處理下及1個正常供水處理下被同時檢測到，其累積表型貢獻率為34.19％，遺傳距離為0.6cM。表明qTBN-Ch.7-1為調控玉米雄穗分枝數(shù)的主效QTL，且與抗旱性密切相關，該QTL減少雄穗分枝數(shù)的等位基因來源于親本廊黃/昌7-2，因此可用于對玉米雄穗大小進行預測，但由于該QTL的基因作用方式為超顯性，因此在組配雜交種時要特別注意雜種優(yōu)勢對雄穗大小的影響。

上述調控玉米雄穗分枝數(shù)主效QTL的分子標記，由umc2177和umc1378兩對SSR標記組成，其中標記umc2177的序列為：

Forward:5’-ACCATGCATGTCTCACGTCACT-3’

Reverse:5’-GGGTACGTGCTGTGGAGGAC-3’

所述引物umc1378的序列為：

Forward:5’-GAAGTCGCTGATGAGAACGTAACC-3’

Reverse:5’-GCTAGCTAGTGTGAGTTCTTCCGC-3’

利用上述調控玉米雄穗分枝數(shù)主效QTL的分子標記輔助選擇雄穗分枝較少玉米的方法包括：提取待測玉米基因組DNA，用標記umc2177和umc1378進行PCR擴增，當?shù)玫介L度為234bp和331bp的擴增產(chǎn)物，則待測玉米為候選雄穗分枝數(shù)較小的玉米單株，淘汰其它單株，有目的的組配雜交組合，選育出雄穗大小適中、高產(chǎn)玉米新品種，進而應用于生產(chǎn)實踐中。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 甘肅農(nóng)業(yè)大學

<120> 調控玉米雄穗分枝數(shù)主效QTL的分子標記及其應用

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 玉米屬玉米（Zea mays L.)

<400> 1

accatgcatg tctcacgtca ct 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 玉米屬玉米（Zea mays L.）

<400> 2

gggtacgtgc tgtggaggac 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 玉米屬玉米（Zea mays L.）

<400> 3

gaagtcgctg atgagaacgt aacc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 玉米屬玉米（Zea mays L.）

<400> 4

gctagctagt gtgagttctt ccgc 24

1