專利名稱：大賴草核酸中高活性與穗形相關(guān)成分的確定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大賴草核酸中高活性與穗形相關(guān)成分的確定，尤其是從大賴草中提取總DNA，通過花粉管通道將其轉(zhuǎn)化到小麥中去。
大賴草(Leyaus racemsus)!(am)(zve)是一種生長(zhǎng)在半干旱荒漠邊緣的多年生雜草，為禾本科賴草屬(Leymes Hocbst)植物，它具有抗干旱，耐堿，高度抗病、抗蟲、穗大、粒多、籽粒蛋白質(zhì)含量高等多種優(yōu)良遺傳性狀，因而在分子育種工作中是個(gè)比較理想的優(yōu)良基因供體。本發(fā)明經(jīng)過多年田間試驗(yàn)證明，大賴草基因中含有高活性的與穗形相關(guān)的成分，將該成分通過花粉管通道轉(zhuǎn)化外源基因至培育小麥中去，它能較早的影響小麥的穗形，并最終產(chǎn)生出大穗形小麥。
本發(fā)明目的在于，研究確定大賴草核酸中高活性與穗形相關(guān)的成分，首先將大賴草葉片經(jīng)液氮研磨、抽提、低速離心進(jìn)行兩相分離，沉淀出總DNA，再經(jīng)乙醇洗滌抽干，滅菌，經(jīng)RNase保溫處理后過Sepherose-28柱分離總DNA和RNA，收集總DNA再進(jìn)行純化處理，將純化后的總DNA經(jīng)超聲波破碎成DNA片段，通過花粉管通道將其轉(zhuǎn)化到小麥中去即可。該方法經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)證明，采用該方法確定大賴草核酸中高活性與穗形相關(guān)的成分，是行之有效的，其小麥的穗形均都產(chǎn)生了大穗形變異轉(zhuǎn)化株，經(jīng)過分子雜交檢測(cè)，證實(shí)大穗小麥?zhǔn)怯捎诖筚嚥莼蜣D(zhuǎn)化后產(chǎn)生的結(jié)果。
本發(fā)明所述的大賴草核酸中高活性與穗形相關(guān)成分的確定，首先將大賴草葉片經(jīng)液氮研磨，用三羥基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCL)緩沖液及十二烷基磺酸鈉抽提，60℃熱酚一氯仿處理，低速離心進(jìn)行兩相分離，水相經(jīng)異丙醇沉淀，提出總DNA，再經(jīng)70％乙醇洗滌后抽干，溶于滅菌水中，經(jīng)RNase保溫處理后，過Sepberose-28柱分離總DNA和RNA，收集總DNA，將收集的總DNA峰，經(jīng)乙醇沉淀后抽干，溶于TF緩沖液中，得純化后的總DNA，然后再經(jīng)超聲波及限制性內(nèi)切酶酶切成大小為0.5-10kb的DNA片段，通過花粉管通道將其轉(zhuǎn)化到載培小麥中去即可。
實(shí)施例取1克大賴草葉片，經(jīng)液氮研磨，加入10ml三羥基氨基甲烷鹽酸緩沖液及1/10體積10％的十二烷基磺酸鈉抽提，等體積各50％熱酚一氯仿處理，于60℃保溫10分鐘，低速離心進(jìn)行兩相分離，水相加入0.6倍體積的異丙醇沉淀，提出總DNA，再用70％乙醇洗滌后抽干，溶于滅菌水中，加入RNasp50mg/ml,37℃、0.5小時(shí)保溫，過Sepbernse-28柱，收集第一峰，再經(jīng)乙醇沉淀后抽干，溶于TE緩沖液中，得純化后的總DNA，再經(jīng)超聲波及限制性內(nèi)切酶酶切成大小為0.5-10kb的DNA片段，再通過花粉管通道將其轉(zhuǎn)化到栽培小麥中去即可，可獲得大穗形變異轉(zhuǎn)化株。
權(quán)利要求
1.一種大賴草核酸中高活性與穗形相關(guān)成分的確定，其特征在于，首先將大賴草葉片經(jīng)液氮研磨，用三羥基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)緩沖液及十二烷基磺酸鈉抽提，60℃熱酚一氯仿處理，低速離心進(jìn)行兩相分離，水相經(jīng)異丙醇沉淀，提出總DNA，再經(jīng)70％乙醇洗滌后抽干，溶于滅菌水中，經(jīng)RNase保溫處理后，過Sephernse-28柱分離總DNA和RNA，收集總DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大賴草核酸中高活性與穗形相關(guān)成分的確定，其特征在于，將收集的總DNA峰，經(jīng)乙醇沉淀后抽干，溶于1F緩沖液中，得純化后的總DNA，然后再經(jīng)超聲波及限制性內(nèi)切酶酶切成大小為0.5-10kb的DNA片段，通過花粉管通道將其轉(zhuǎn)化到栽培小麥中去即可。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從大賴草核酸中高活性與穗形相關(guān)成分的確定,首先將大賴草葉片先經(jīng)液氮研磨,抽提,低速離心進(jìn)行兩相分離,沉淀提出總DNA,再經(jīng)乙醇洗滌后抽干、滅菌,經(jīng)RNase保溫后,過Sepherose－28柱,分離器DNA和RNA,再進(jìn)行純化處理,經(jīng)超聲波及限制性內(nèi)切酶酶切成DNA片段,通過花粉管通道將其轉(zhuǎn)化到栽培小麥中去,該方法經(jīng)過多次反復(fù)試驗(yàn)證明,小麥穗形均都產(chǎn)生了大穗形變異轉(zhuǎn)化株,經(jīng)過分子雜交檢測(cè),證實(shí)大穗形小麥?zhǔn)怯捎诖筚嚥莼蜣D(zhuǎn)化后產(chǎn)生的結(jié)果。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1221750SQ9712342
公開日1999年7月7日 申請(qǐng)日期1997年12月27日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月27日
發(fā)明者趙民安, 劉敏, 戚家華, 李維琪 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院新疆化學(xué)研究所