本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，涉及預(yù)測(cè)個(gè)體動(dòng)脈瘤發(fā)生的血液中外泌體miRNA譜，本發(fā)明還涉及預(yù)測(cè)個(gè)體動(dòng)脈瘤發(fā)生的檢測(cè)試劑盒或芯片。
背景技術(shù)：
：動(dòng)脈瘤是由于動(dòng)脈壁的病變或損傷，形成動(dòng)脈壁局限性或彌漫性擴(kuò)張或膨出的表現(xiàn)，以膨脹性、搏動(dòng)性腫塊為主要表現(xiàn)，可以發(fā)生在動(dòng)脈系統(tǒng)的任何部位，而以肢體主干動(dòng)脈、主動(dòng)脈和胸動(dòng)脈較為常見。其主要癥狀體征因動(dòng)脈瘤發(fā)生位置不同而不同，胸主動(dòng)脈瘤主要體現(xiàn)在食管和氣管壓迫癥狀，如吞咽困難、呼吸困難及擴(kuò)張性搏動(dòng)、震顫及雜音。下肢主干動(dòng)脈瘤主要體現(xiàn)在肌肉萎縮、水腫、潰瘍或壞死。當(dāng)前，隨著環(huán)境的惡化，動(dòng)脈瘤發(fā)病率出現(xiàn)了逐年增加的趨勢(shì)，其中發(fā)達(dá)國家腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病率甚至達(dá)到了5％以上。男性發(fā)病率明顯高于女性，隨著年齡的增加，其發(fā)病率也增加，60歲男性發(fā)病率達(dá)到8％，而年輕男性發(fā)病率僅為1.5％，60歲以上女性發(fā)病率為4％，年輕女性發(fā)病率為0.5％。其發(fā)病率不僅較高，而且危害嚴(yán)重，若沒有及時(shí)接受治療或者手術(shù)，其死亡率達(dá)到90％以上，但若及時(shí)發(fā)現(xiàn)并接受手術(shù)，其死亡率可以降為0。在臨床上有70％的動(dòng)脈瘤患者具有典型動(dòng)脈瘤的臨床表征，血管超聲可以檢測(cè)到血管管腔的異常，從而判斷動(dòng)脈瘤的發(fā)生，進(jìn)而采取手術(shù)進(jìn)行干預(yù)和治療。當(dāng)前血管超聲檢測(cè)是最為有效可行的檢測(cè)手段，其界定標(biāo)準(zhǔn)是血管管腔內(nèi)徑增加50％或者內(nèi)徑達(dá)到1.2cm，則為典型血管瘤患者。但是仍有30％的動(dòng)脈瘤患者的血管正常，常規(guī)血管超聲檢測(cè)無法顯示其異常，因此這類患者隨時(shí)具有血管破裂的風(fēng)險(xiǎn)，有較高的猝死概率。正是因?yàn)閯?dòng)脈瘤具有很高的治愈率，因此及時(shí)進(jìn)行手術(shù)治療就顯得尤為重要。因此早期篩查和診斷顯得尤為重要，尤其是60歲以上的男性。目前臨床檢測(cè)中，對(duì)于動(dòng)脈瘤的早期檢測(cè)和診斷，僅以血管超聲和核磁共振檢測(cè)為主要手段，通過這些影像學(xué)檢測(cè)可以診斷出70％的動(dòng)脈瘤患者，但是仍有大量的非典型動(dòng)脈瘤患者不能通過這些常規(guī)檢測(cè)手段被發(fā)現(xiàn)，目前還沒有一種行之有效的非影像學(xué)手段，針對(duì)動(dòng)脈瘤預(yù)警及早期檢測(cè)。微小核糖核酸(microRNA,miRNA),是一類長(zhǎng)約19至23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小核糖核酸分子。它們?cè)谶M(jìn)化上高度保守，并與動(dòng)物的許多正常生理活動(dòng)，如生物個(gè)體發(fā)育、組織分化、細(xì)胞凋亡以及能量代謝等密切相關(guān)，同時(shí)也與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展存在著緊密的聯(lián)系。miRNA主要通過與靶標(biāo)基因3’UTR的完全或不完全配對(duì)，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯，在基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控中起著超乎想象的重要作用，因此它與疾病存在以下的關(guān)聯(lián)性：首先，微小核糖核酸的變化可能是病因，這是因?yàn)榧膊〉囊种埔蜃右约按龠M(jìn)因子都可能是微小核糖核酸的靶位點(diǎn)，當(dāng)微小核糖核酸本身先發(fā)生了紊亂表達(dá)，比如本來抑制疾病促進(jìn)因子的微小核糖核酸表達(dá)量降低了，或者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表達(dá)量升高了，其最終結(jié)果都會(huì)導(dǎo)致下游一系列基因表達(dá)的變化以及某些通路的整體紊亂，進(jìn)而誘發(fā)疾病發(fā)生；其次，微小核糖核酸的變化也可能是疾病的結(jié)果，這是因?yàn)楫?dāng)疾病發(fā)生時(shí)，會(huì)導(dǎo)致染色體片段的丟失、基因的突變或者染色體片段的劇烈擴(kuò)增，若微小核糖核酸正好位于這一變化區(qū)段內(nèi)，那么其表達(dá)量將發(fā)生及其顯著的變化。因此，理論上微小核糖核酸分子完全可以作為一類新的疾病標(biāo)記物，它的特異性變化必然與疾病產(chǎn)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是確定一種能在血液中檢測(cè)的，高準(zhǔn)確度的早期預(yù)測(cè)動(dòng)脈瘤發(fā)生的分子標(biāo)記。近年來研究發(fā)現(xiàn)外泌體包含有miRNA,由于外泌體所提供的良好保護(hù)性，使得外泌體miRNA在人體液中有很好的穩(wěn)定性。本發(fā)明經(jīng)過大量研究，確定了一種預(yù)測(cè)動(dòng)脈瘤發(fā)生的血液中外泌體miRNA譜，該miRNA譜包括miR-214、miR-126和miR-15a；采用熒光定量PCR方法對(duì)個(gè)體外泌體中上述三種miRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，獲得的miRNA表達(dá)水平相對(duì)于(a)非編碼核糖核酸(ncRNAs)U6的表達(dá)水平，或(b)外泌體數(shù)量N進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；每一種miRNA標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)量分別進(jìn)行累加，形成了由上述3種miRNA表達(dá)水平組合而成的累加分?jǐn)?shù)，其中按照(a)標(biāo)準(zhǔn)化方式累加分?jǐn)?shù)在22以上為動(dòng)脈瘤患者，低于22分為正常；按照(b)標(biāo)準(zhǔn)化方式累加分?jǐn)?shù)在6875以上為動(dòng)脈瘤患者，低于6875分為正常。在本發(fā)明中用作標(biāo)記物的微小核糖核酸包括所述前體miRNA及成熟miRNA產(chǎn)物。在確定miRNA表達(dá)水平時(shí)，起始材料量、樣本收集、RNA制備及品質(zhì)及反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)效率的差異會(huì)導(dǎo)致定量誤差。內(nèi)因性控制基因的標(biāo)準(zhǔn)化可用于矯正潛在的RNA輸入或者RT-PCR效率的偏差。因此miRNA的表達(dá)水平可相對(duì)于未編碼RNA(ncRNA)、某些miRNA或者核糖RNA(rRNA)的表達(dá)水平而標(biāo)準(zhǔn)化?？捎糜跇?biāo)準(zhǔn)化的未編碼RNA包括RNU24、RNU66、RNU19、RNU38B、RNU49、RNU48、RNU43、RNU58B、RNU68、RNU44、RNU6B、Z30、U18、RPL21、U54、HY3、U75及U47?？捎糜跇?biāo)準(zhǔn)化目的的miRNA包括has-miR-26b、has-miR-92、has-miR-92N、has-miR-423、has-miR-374及has-miR-16?；蛘弑景l(fā)明另一方面也可使用18SrRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。本發(fā)明還可使用總輸入RNA對(duì)miRNA表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化?；蛘呖苫谒幸逊治龌蚧蚱渲写蟮拇稳?全球標(biāo)準(zhǔn)化方法)的平均值或者中間數(shù)信號(hào)(Ct)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。本發(fā)明的實(shí)施例中，對(duì)感興趣的miRNA已測(cè)量的表達(dá)水平以相對(duì)于一個(gè)ncRNAU6的表達(dá)水平或外泌體數(shù)量N而標(biāo)準(zhǔn)化。所述(a)中，以U6的表達(dá)水平使每一個(gè)miRNA的Ct值標(biāo)準(zhǔn)化，標(biāo)準(zhǔn)化的miRNA表達(dá)水平以ΔCt表示，即各個(gè)生物標(biāo)記物的PCR相對(duì)量使用2-ΔCt公式計(jì)算，其中ΔCt＝Ct生物標(biāo)記物-CtU6，miR-214的表達(dá)水平為2-(CtmiR-214-CtU6)，miR-126的表達(dá)水平為2-(CtmiR-126-CtU6)，miR-15a的表達(dá)水平為2-(CtmiR-15a-CtU6)。所述(b)中，與外泌體數(shù)量N比較使每一個(gè)miRNA的Ct值標(biāo)準(zhǔn)化，標(biāo)準(zhǔn)化后的miR-214的表達(dá)水平為2-CtmiR-214/N，miR-126的表達(dá)水平為2-CtmiR-126/N，miR-15a的表達(dá)水平為2-CtmiR-15a/N。已知的檢測(cè)miRNA表達(dá)水平的方法，例如小分子RNA列陣系統(tǒng)(Illumia,SanDiego,CA,ISA)及/或miRNA分析(AppliedBiosystems,LifeTechologiesCorp.,Carlsbad,CA,USA)可用于本發(fā)明。miRNA分析是使用AppliedBiosystems實(shí)時(shí)PCR儀，此分析方法可檢測(cè)及定量具有超過6個(gè)log對(duì)數(shù)的動(dòng)態(tài)范圍的1至10ng總RNA的小分子RNA。在用于miRNA的分析時(shí)，該分析法可區(qū)別成熟miRNA序列與其前提miRNA?？梢允褂檬惺蹆x器進(jìn)行RT-PCR，例如ABIPRISM7500TM序列檢測(cè)系統(tǒng)TM(Perkin-Elmer-AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)或者Lightcycler(RocheMolecularBiochemicals,Mannheim,Germany)。可利用qRT-PCR的系統(tǒng)有熱循環(huán)器、激光器、電偶合裝置(CCD)、攝影機(jī)及計(jì)算機(jī)組成。此系統(tǒng)可在熱循環(huán)機(jī)內(nèi)以96位和/或384位格式擴(kuò)增樣本。擴(kuò)增期間，多所有的96位和/或384位經(jīng)光纖纜線實(shí)時(shí)收集激光誘導(dǎo)的熒光訊號(hào)，在CCD上檢測(cè)。該系統(tǒng)包括相應(yīng)的操作軟件及數(shù)據(jù)分析軟件。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣獲得的：(1)對(duì)進(jìn)行手術(shù)或其他治療之前的血液進(jìn)行外泌體提取及定量；(2)外泌體RNA提??；(3)外泌體miRNA、ncRNA定量檢測(cè)，獲得標(biāo)準(zhǔn)化的miRNA表達(dá)水平；(4)將訓(xùn)練集的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得用于早期預(yù)測(cè)動(dòng)脈瘤的診斷規(guī)則。所述的統(tǒng)計(jì)方法包括：將懲罰邏輯回歸(PenalizedLogisticRegression，PLR)用作標(biāo)記物組合的數(shù)學(xué)模型，如“懲罰的”R工具箱中應(yīng)用的(http://cran.r-project.org/)。將武漢樣本定義為訓(xùn)練集，同時(shí)將濟(jì)寧樣本定義為試驗(yàn)集。通過在訓(xùn)練集內(nèi)在蒙特卡羅交叉效度分析(MonteCarlo)設(shè)計(jì)中進(jìn)行100次操作來進(jìn)行算法優(yōu)化(及懲罰類型和其懲罰參數(shù)的選擇)。在各蒙特卡羅交叉效度分析操作時(shí)，將訓(xùn)練組的正常對(duì)照和動(dòng)脈瘤患者的三分之二隨機(jī)選擇為亞訓(xùn)練組。將PLR用于亞訓(xùn)練組以產(chǎn)生診斷規(guī)則。對(duì)亞訓(xùn)練組的對(duì)照確定關(guān)于估計(jì)的后驗(yàn)病例概率(posteriorcase-probability)的閾值以獲得95％或98％的多變量診斷規(guī)則的表觀特異性。然后將規(guī)則用于剩下的三分之一的數(shù)據(jù)(另一個(gè)亞試驗(yàn)集)以估計(jì)在給定的閾值下的靈敏度和特異性。將該方法重復(fù)100次。來自交叉效度分析的單個(gè)操作的仔細(xì)分析顯示在100次統(tǒng)計(jì)操作中，miR-214、miR-126和miR-15a分別被選擇94次、91次和78次。因此根據(jù)交叉效度分析，訓(xùn)練集中動(dòng)脈瘤和對(duì)照組集合的所有多變量結(jié)果報(bào)道為中等靈敏度。然后使用所有訓(xùn)練數(shù)據(jù)用最佳算法研究最終診斷規(guī)則和其閾值，并且將其應(yīng)用于試驗(yàn)集，所述試驗(yàn)集用于驗(yàn)證產(chǎn)生的診斷規(guī)則。利用本發(fā)明的miRNA表達(dá)譜分析了濟(jì)寧人群中隨機(jī)呈現(xiàn)的40個(gè)正常人和40名患者的miRNA的表達(dá)情況，其結(jié)果所示靈敏度達(dá)到91.77％，假陽性率僅為7.03％，假陰性率為15.39％。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種預(yù)測(cè)動(dòng)脈瘤發(fā)生的試劑盒，該試劑盒含有針對(duì)檢測(cè)miR-214、miR-126和miR-15a表達(dá)水平的特異性探針和/或核苷酸引物。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種早期預(yù)測(cè)動(dòng)脈瘤發(fā)生的芯片，該芯片含有針對(duì)miR-214、miR-126和miR-15a表達(dá)水平檢測(cè)的特異性探針核苷酸。本文中使用的術(shù)語“樣品”是指獲得用于體外評(píng)估目的的生物樣品。在本發(fā)明的方法中，樣品或者患者樣品優(yōu)選包括任何體液。體液樣品是全血、血清、血漿，血清和血漿是最優(yōu)選的。本發(fā)明提供了一種miRNA表達(dá)譜，能夠比較高準(zhǔn)確度的早期預(yù)測(cè)動(dòng)脈瘤發(fā)生；與其他已知的預(yù)測(cè)動(dòng)脈瘤發(fā)生相關(guān)因素相比，此表達(dá)譜是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因素。由于是基于外周血外泌體的分子標(biāo)記物，屬微創(chuàng)，成本相對(duì)較低，可重復(fù)性高。附圖說明圖1為不同生物標(biāo)記物在武漢正常人群和動(dòng)脈瘤患者的ROC情況圖2為在武漢人群中生物標(biāo)記物的不同組合形成不同的ROC情況圖3為不同生物標(biāo)記物在濟(jì)寧正常人群和動(dòng)脈瘤患者的ROC情況圖4為在濟(jì)寧人群中生物標(biāo)記物的不同組合形成不同的ROC情況具體實(shí)施方式通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容?！緦?shí)施例1】臨床樣本按照預(yù)期在中國兩個(gè)多中心研究中收集血液樣品，臨床信息見表1。在參與中心對(duì)每一個(gè)患者進(jìn)行血管超聲檢測(cè)或者血管造影檢測(cè)。在入院進(jìn)行第一次血液檢測(cè)時(shí)(在進(jìn)行手術(shù)或其他治療治療之前)收集血液樣品。血管外科醫(yī)生或超聲科醫(yī)生等專業(yè)醫(yī)生對(duì)患者的血管造影或者血管超聲結(jié)果進(jìn)行判斷，排除血管異常的患者，血管無異常表型，且在后續(xù)1年中未發(fā)生血管瘤的患者歸為正常對(duì)照組。通過血管造影或者血管超聲檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)血管管腔或者血管內(nèi)徑增加50％的患者，或者接受血管瘤手術(shù)治療患者，歸為動(dòng)脈瘤患者(腹主動(dòng)脈瘤或胸主動(dòng)脈瘤)。在該研究中，在手術(shù)之前或者血管造影檢測(cè)之前收集血液樣品。由2位不同的血管外科醫(yī)生或者超聲科醫(yī)生對(duì)正常對(duì)照和血管瘤患者進(jìn)行鑒定。本研究通過了倫理委員會(huì)評(píng)審和批準(zhǔn)，所有參與者都簽署了知情同意書。表1臨床資料匯整【實(shí)施例2】血液/血清收集將血液樣品一部分抽入血清管中并且讓其在室溫凝固至少1小時(shí)。在離心侯，將上清液(血清)以1ml等分于-20度冷凍，第二日轉(zhuǎn)移至-80度冰箱。在測(cè)量前，將血清樣品解凍，進(jìn)行檢測(cè)。將另外一部分血液樣品直接收集到管中，然后按照相應(yīng)的外泌體試劑盒的使用說明進(jìn)行操作分離純化血液中外泌體。外泌體提取使用市售外泌體分離試劑盒對(duì)血液中的外泌體進(jìn)行分離?；蛘卟捎锰荻入x心的方法分離外泌體?？刹捎肨otalExosomeIsolation(fromplasma)(LifeTechnologiesCorporation,USA)分離血液中外泌體。按照公司提供的試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，分離得到血液中外泌體?；蛘呖刹捎肊xoQuick-TCTMExosomePrecipitationSolution(SystemBiosciences,CA,USA)分離外泌體。同樣按照試劑盒生產(chǎn)商提供的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作，分離血液中外泌體。外泌體定量分離得到血液外泌體后，采用EXOCETExosomeQuantitationAssayKit試劑盒(SystemBiosciences,CA,USA)或ExosomeQuantificationKit試劑盒(BioVision)對(duì)分離得到的外泌體數(shù)量進(jìn)行定量分析。或采用BCA發(fā)對(duì)外泌體的總蛋白進(jìn)行定量。隨后對(duì)分離得到外泌體立即分為2份放入到-80度冰箱，一份用于外泌體內(nèi)蛋白檢測(cè)，一份用于外泌體中miRNA表達(dá)水平檢測(cè)。外泌體miRNA提取使用TRIzol為主的方法從上述提到的分離出的血液外泌體中抽取總RNA?；蛘呤褂胢iRNAIsolationKit(ThermoFisher,USA)、mirVanaTMmiRNAIsolationKit(ThermoFisher,USA)或者miRNeasyMiniKit(QIAGEN,German)提取上述分離出的血液外泌體RNA。隨之采用NanoDrop對(duì)RNA含量進(jìn)行測(cè)定?！緦?shí)施例3】外泌體miRNA檢測(cè)采用熒光定量PCR方法對(duì)外泌體中miRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。采用NCodeVILOmiRNAcDNASynthesisKitandEXPRESSSYBRGreenERmiRNAqRT-PCRKits試劑盒(Invitrogen，USA)對(duì)各種miRNA或者樣本內(nèi)對(duì)照RNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。(各個(gè)檢測(cè)miRNA的相關(guān)信息見表2，各個(gè)檢測(cè)miRNA的熒光定量PCR的引物信息見表3)。分別對(duì)miR-214、miR-126和miR-15a每個(gè)miRNA的表達(dá)水平都以閾值循環(huán)(Ct)值表示。之后以U6的表達(dá)水平使每一個(gè)miRNA的Ct值標(biāo)準(zhǔn)化，此方法常用于miRNA定量分析的內(nèi)在控制。最后，標(biāo)準(zhǔn)化的miRNA表達(dá)水平以ΔCt表示。即各個(gè)生物標(biāo)記物的PCR相對(duì)量使用2-ΔCt公式計(jì)算，其中ΔCt＝Ct生物標(biāo)記物-CtU6。miR-214的表達(dá)水平為2-(CtmiR-214-CtU6)，miR-126的表達(dá)水平為2-(CtmiR-126-CtU6)，miR-15a的表達(dá)水平為2-(CtmiR-15a-CtU6)。表2動(dòng)脈瘤生物標(biāo)記的序列表3動(dòng)脈瘤生物標(biāo)記的熒光定量PCR引物【實(shí)施例4】外泌體miRNA檢測(cè)使用TaqMANRT-PCR對(duì)從外泌體中分離純化的miRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。(各個(gè)檢測(cè)miRNA的定量PCR探針信息見表4)。分別對(duì)miR-214、miR-126和miR-15a每個(gè)miRNA的表達(dá)水平都以閾值循環(huán)(Ct)值表示。之后以U6的表達(dá)水平使每一個(gè)miRNA的Ct值標(biāo)準(zhǔn)化，此方法常用于miRNA定量分析的內(nèi)在控制。最后，標(biāo)準(zhǔn)化的miRNA表達(dá)水平以ΔCt表示。即各個(gè)生物標(biāo)記物的PCR相對(duì)量使用2-ΔCt公式計(jì)算，其中ΔCt＝Ct生物標(biāo)記物-CtU6。miR-214的表達(dá)水平為2-(CtmiR-214-CtU6)，miR-126的表達(dá)水平為2-(CtmiR-126-CtU6)，miR-15a的表達(dá)水平為2-(CtmiR-15a-CtU6)。表4動(dòng)脈瘤生物標(biāo)記的定量PCR探針I(yè)DThermoFisherCat.NO.hsa-miR-214478768_mirhsa-miR-126477888_mirhsa-miR-15a477928_mirU6001973【實(shí)施例5】外泌體miRNA檢測(cè)分別對(duì)miR-214、miR-126和miR-15a每個(gè)miRNA的表達(dá)水平都以閾值循環(huán)(Ct)值表示。之后以其值與外泌體數(shù)量N比較使每一個(gè)miRNA的Ct值標(biāo)準(zhǔn)化，進(jìn)而可對(duì)miRNA表達(dá)進(jìn)行分析。miR-214的表達(dá)水平為2-CtmiR-214/N，miR-126的表達(dá)水平為2-CtmiR-126/N，miR-15a的表達(dá)水平為2-CtmiR-15a/N?！緦?shí)施例6】標(biāo)記物組合/統(tǒng)計(jì)分析和結(jié)果將懲罰邏輯回歸(PenalizedLogisticRegression，PLR)用作標(biāo)記物組合的數(shù)學(xué)模型，如“懲罰的”R工具箱中應(yīng)用的(http://cran.r-project.org/)。將武漢樣本定義為訓(xùn)練集，同時(shí)將濟(jì)寧樣本定義為試驗(yàn)集。通過在訓(xùn)練集內(nèi)在蒙特卡羅交叉效度分析(MonteCarlo)設(shè)計(jì)中進(jìn)行100次操作來進(jìn)行算法優(yōu)化(及懲罰類型和其懲罰參數(shù)的選擇)。在各蒙特卡羅交叉效度分析操作時(shí)，將訓(xùn)練組的正常對(duì)照和動(dòng)脈瘤患者的三分之二隨機(jī)選擇為亞訓(xùn)練組。將PLR用于亞訓(xùn)練組以產(chǎn)生診斷規(guī)則。對(duì)亞訓(xùn)練組的對(duì)照確定關(guān)于估計(jì)的后驗(yàn)病例概率(posteriorcase-probability)的閾值以獲得95％或98％的多變量診斷規(guī)則的表觀特異性。然后將規(guī)則用于剩下的三分之一的數(shù)據(jù)(另一個(gè)亞試驗(yàn)集)以估計(jì)在給定的閾值下的靈敏度和特異性。將該方法重復(fù)100次。來自交叉效度分析的單個(gè)操作的仔細(xì)分析顯示在100次統(tǒng)計(jì)操作中，miR-214、miR-126和miR-15a分別被選擇94次、91次和78次。因此根據(jù)交叉效度分析，訓(xùn)練集中動(dòng)脈瘤和對(duì)照組集合的所有多變量結(jié)果報(bào)道為中等靈敏度。然后使用所有訓(xùn)練數(shù)據(jù)用最佳算法研究最終診斷規(guī)則和其閾值，并且將其應(yīng)用于試驗(yàn)集，所述試驗(yàn)集用于驗(yàn)證產(chǎn)生的診斷規(guī)則。規(guī)則1：按照實(shí)施例3的方法計(jì)算，將miR-214、miR-126和miR-15a的表達(dá)量進(jìn)行累加，累加分?jǐn)?shù)在22以上為動(dòng)脈瘤患者，低于22分為正常。規(guī)則2：按照實(shí)施例5的方法計(jì)算，將miR-214、miR-126和miR-15a的表達(dá)量進(jìn)行累加，累加分?jǐn)?shù)在6875以上為動(dòng)脈瘤患者，低于6875分為正常。由3個(gè)生物標(biāo)記物構(gòu)成的組合獲得的診斷規(guī)則使得動(dòng)脈瘤檢測(cè)的準(zhǔn)確度達(dá)到79.5％，特異性達(dá)到81.4％。附圖1，武漢人群中miR-214、miR-126和miR-15a的ROC值分別是0.57，0.54，0.63。附圖2中，武漢人群中當(dāng)miR-214、miR-126和miR-15a兩兩分別組合，其ROC值為0.60，0.65，0.69。當(dāng)miR-214、miR-126和miR-15a三個(gè)組合，其ROC值達(dá)到了0.73?！緦?shí)施例7】驗(yàn)證人群的分析及預(yù)測(cè)將濟(jì)寧樣本作為試驗(yàn)集，驗(yàn)證根據(jù)武漢樣本作為訓(xùn)練集得到的數(shù)學(xué)模型，其結(jié)果如表5所示，靈敏度達(dá)到91.77％，假陽性率僅為7.03％，假陰性率為15.39％。表5生物標(biāo)記物檢測(cè)結(jié)果正常動(dòng)脈瘤正常6712動(dòng)脈瘤患者27357附圖3，濟(jì)寧人群中miR-214、miR-126和miR-15a的ROC值分別是0.54，0.56，0.58。附圖4中，濟(jì)寧人群中當(dāng)miR-214、miR-126和miR-15a兩兩分別組合，其ROC值為0.58，0.61，0.62。當(dāng)miR-214、miR-126和miR-15a三個(gè)組合，其ROC值達(dá)到了0.75。在濟(jì)寧樣本中隨機(jī)抽取40個(gè)正常人和40名患者的miR的表達(dá)情況，按照實(shí)施例4，進(jìn)行計(jì)算統(tǒng)計(jì)，并按照規(guī)則1進(jìn)行判斷獲得疾病診斷評(píng)分，結(jié)果見表6；按照實(shí)施例5，進(jìn)行計(jì)算統(tǒng)計(jì)，并按照規(guī)則2進(jìn)行判斷獲得疾病診斷評(píng)分，結(jié)果見表7。表6按照規(guī)則1對(duì)濟(jì)寧樣本進(jìn)行分析獲得的疾病診斷評(píng)分表7按照規(guī)則2對(duì)濟(jì)寧樣本進(jìn)行分析獲得的疾病診斷評(píng)分SEQUENCELISTING<110>呂丘侖<120>一種預(yù)測(cè)個(gè)體動(dòng)脈瘤發(fā)生的血液中外泌體miRNA譜及檢測(cè)試劑盒<160>15<170>PatentInversion3.3<210>1<211>110<212>RNA<213>Artificial<220><223>hsa-miR-214<400>1ggccuggcuggacagaguugucaugugucugccugucuacacuugcugugcagaacaucc60gcucaccuguacagcaggcacagacaggcagucacaugacaacccagccu110<210>2<211>85<212>RNA<213>Artificial<220><223>hsa-miR-126<400>2cgcuggcgacgggacauuauuacuuuugguacgcgcugugacacuucaaacucguaccgu60gaguaauaaugcgccguccacggca85<210>3<211>83<212>RNA<213>Artificial<220><223>hsa-miR-15a<400>3ccuuggaguaaaguagcagcacauaaugguuuguggauuuugaaaaggugcaggccauau60ugugcugccucaaaaauacaagg83<210>4<211>107<212>DNA<213>Artificial<220><223>U6<400>4gtgctcgcttcggcagcacatatactaaaattggaacgatacagagaagattagcatggc60ccctgcgcaaggatgacacgcaaattcgtgaagcgttccatattttt107<210>5<211>55<212>DNA<213>Artificial<220><223>hsa-miR-214RT引物<400>5gtcgtatccagtgcgtgtcgtggagtcggcaattgcactggatacgacactgcct55<210>6<211>18<212>DNA<213>Artificial<220><223>hsa-miR-214正向<400>6aggacagcaggcacagac18<210>7<211>18<212>DNA<213>Artificial<220><223>hsa-miR-214反向<400>7cagtgcgtgtcgtggagt18<210>8<211>55<212>DNA<213>Artificial<220><223>hsa-miR-126RT<400>8gtcgtatccagtgcgtgtcgtggaggctcgacctcggaaactatggcattattac55<210>9<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>hsa-miR-126正向<400>9agcatgaatcgtaccgtgagt21<210>10<211>22<212>DNA<213>Artificial<220><223>hsa-miR-126反向<400>10ctgctcgacctcggaaactatg22<210>11<211>43<212>DNA<213>hsa-miR-15aRT<400>11ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagcacaaac43<210>12<211>35<212>DNA<213>Artificial<220><223>hsa-miR-15a正向<400>12acactccagctgggtagcagcacataatggtttgt35<210>13<211>16<212>DNA<213>Artificial<220><223>hsa-miR-15a反向<400>13tggtgtcgtggagtcg16<210>14<211>25<212>DNA<213>Artificial<220><223>U6正向<400>14gcttcggcagcacatatactaaaat25<210>15<211>23<212>DNA<213>Artificial<220><223>U6反向<400>15cgcttcacgaatttgcgtgtcat23當(dāng)前第1頁1 2 3