Muc3b基因snp位點的用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了MUC3B基因SNP位點的用途，該SNP位點為rs100389954。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了MUC3B基因的SNP位點rs100389954與顱內(nèi)動脈瘤相關(guān)，因此在此基礎(chǔ)上提出一種通過檢測SNP位點的基因型來診斷顱內(nèi)動脈瘤易感風險性的試劑盒，該試劑盒具有靈敏性、特異性，能夠?qū)φＨ巳哼M行顱內(nèi)動脈瘤易感性的篩查，有效起到風險預(yù)警、早期診斷的作用。
【專利說明】
MUC3B基因 SNP位點的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及MUC3B基因 SNP位點的用途及其相關(guān)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 顱內(nèi)動脈瘤是顱內(nèi)動脈呈囊袋樣的病理性擴張。顱內(nèi)動脈瘤的破裂是至今最為嚴 重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。我國屬顱內(nèi)動脈瘤的高發(fā)地區(qū)，人群發(fā)病率達0.1-4%。盡管在近 十年里，顱內(nèi)動脈瘤的治療有了長足的發(fā)展，但病人的預(yù)后仍然很差，其致死率高達30- 40% 〇
[0003] 研究證實，顱內(nèi)動脈瘤的形成、生長和破裂主要在于其瘤壁的病理生理改變?；?血管壁的形態(tài)學和組織病理學的研究揭示，顱內(nèi)動脈瘤的形成是由不同的外因和內(nèi)因共同 作用的結(jié)果。顱內(nèi)動脈瘤在人體內(nèi)有獨特的組織學特征，它們是由含內(nèi)皮細胞和平滑肌細 胞的內(nèi)膜層、含有內(nèi)彈力膜及平滑肌細胞的中膜層以及含疏松結(jié)締組織的外膜層所組成。 顱內(nèi)動脈瘤通常位于Wills動脈環(huán)的分叉部，在這些分叉處，中膜的延續(xù)性出現(xiàn)間隔，也稱 之為中縫增寬，這被認為是動脈瘤囊袋發(fā)展的易感位置。外彈力膜的缺失，細胞外基質(zhì)的組 織結(jié)構(gòu)紊亂，粥樣斑塊的形成以及補體激活的炎癥浸潤，網(wǎng)狀纖維的減少等，加之中縫增 寬、血壓沖擊和分叉部應(yīng)切力在動脈瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。
[0004] 臨床上檢查顱內(nèi)動脈瘤時常采用血常規(guī)、腰穿、腦脊液生化檢查、CT掃描、MRI掃 描、體感誘發(fā)電位檢查、多普勒超聲檢查、腦血管造影等手段，但是采用上述手段進行確診 時患者常處于顱內(nèi)動脈瘤的中晚期，預(yù)后較差，如何實現(xiàn)顱內(nèi)動脈瘤的早期診斷對患者的 預(yù)后具有重要作用。
[0005] 單核苷酸多態(tài)性（SNP)是指由于單個核苷酸的變異而引起基因組水平上的DNA序 列多態(tài)性，形式包括單堿基的缺失、插入、轉(zhuǎn)換及顛換等。一般而言，上述形式中最少1種等 位基因在群體中的頻率不小于1 %，但在某種特殊情況下（如cDNA中）也可以小于1 %。1個 SNP在基因組某個位點上有單個核苷酸的變化，主要由兩種形式出現(xiàn):一種是單個堿基的轉(zhuǎn) 換所引起，即以一種嘧啶置換另一種嘧啶或一種嘌呤置換另一種嘌呤；另外一種形式就是 顛換，即嘌呤與嘧啶互換。從原理上分析，突變處的堿基可以是C、G、A、T，而實際上SNP多發(fā) 生在T和C之間。人類遺傳基因的多態(tài)性在遺傳信息上的本質(zhì)表現(xiàn)，90%以上是由SNP所引起 的。因為其多肽信息量大，目前已成為繼限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標志和微衛(wèi)星即短 串聯(lián)重復(fù)(STR)標志后的第三代遺傳標志。
[0006] SNP標記作為目前最具發(fā)展?jié)摿Φ姆肿訕擞?，因其在基因組中數(shù)量多、分布廣且在 基因分析過程中不需要根據(jù)片段大小將DNA分帶，即可實現(xiàn)大規(guī)模高自動化，因而更適合于 數(shù)量龐大的檢測分析，已被廣泛應(yīng)用于生物、農(nóng)學、醫(yī)學、生物進化等眾多領(lǐng)域。SNP的研究 為基因診斷，尤其是疾病的早期診斷提供更多的依據(jù)。SNP由于其分布廣、密度高而被期望 在諸如癌癥、糖尿病、高血壓、憂郁癥和哮喘等復(fù)雜疾病中其重要作用，這些復(fù)雜疾病是多 個遺傳變異位點與環(huán)境因子共同作用的結(jié)果，由于發(fā)病原因復(fù)雜，涉及的基因數(shù)量多，已成 為國際上疾病基因組學研究的重點。目前已有實驗將SNP應(yīng)用于腫瘤預(yù)后及易感性的判斷， 例如肺癌致癌物的易感性存在個體差異，即肺癌的基因易感性，研究較多的是代謝酶基因 多態(tài)性，如人細胞色素 P450-CYP450和髓過氧化酶MPO等。通過傳統(tǒng)的候選基因研究法，通過 對與顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生功能相關(guān)的基因進行測定，也發(fā)現(xiàn)了許多易感基因，如內(nèi)皮糖蛋白基 因、基質(zhì)金屬蛋白酶基因、IR型膠原基因、otl-抗胰蛋白酶基因、彈力蛋白基因、血管緊張素 轉(zhuǎn)化酶基因、載脂蛋白基因等，盡管發(fā)現(xiàn)了上述相關(guān)基因，但是對基因的研究目前只停留在 實驗階段，目前臨床上尚沒有有效的易感基因用于顱內(nèi)動脈瘤的診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于診斷顱內(nèi)動脈瘤易 感性的SNP位點。通過檢測SNP基因型來診斷顱內(nèi)動脈瘤具有預(yù)警性。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明提供了檢測MUC3B基因的SNP位點的試劑在制備診斷顱內(nèi)動脈瘤易感性的 試劑盒中的用途。
[0010] 進一步，所述MUC3B基因的SNP位點為rs100 389954。其中，MUC3B的SNP位點 rs100 389954的基因型為T/G時，顱內(nèi)動脈瘤的易感性增加。
[0011]進一步，所述試劑盒包括用于擴增rs100 389954位點在內(nèi)的核苷酸序列的引物對。 [0012]進一步，所述擴增引物序列正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如 SEQIDN0.2**。
[0013] 本領(lǐng)域技術(shù)人員能通過檢測SNP位點的任何方法或技術(shù)來檢測MUC3B基因 SNP位 點。例如，Taqman法、質(zhì)譜法、DNA微陣列法、測序法、微測序、雜交、限制性片段分析、寡核苷 酸連接檢測、等位基因特異性PCR-HRM或聯(lián)合應(yīng)用上述方法。
[0014] 本發(fā)明提供了一種診斷顱內(nèi)動脈瘤易感性的試劑盒，所述試劑盒包括檢測MUC3B 基因 SNP位點rs100 389954的試劑。其中，MUC3B的SNP位點rs100 389954的基因型為T/G時，顱 內(nèi)動脈瘤的易感性增加。本發(fā)明的該試劑盒可以包括采用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)檢測SNP 位點基因型的試劑，只要其能夠檢測樣本中rs3890213位點基因型即可。
[0015] 進一步，所述檢測MUC3B基因 SNP位點rs100 389954的試劑包括擴增rs100 389954位 點在內(nèi)的核苷酸序列的引物對。
[0016] 在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，所述引物對的正向引物序列如SEQ ID NO. 1所 示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的引物不限于這 對引物。
[0017] 進一步，所述試劑盒還包括基因組DNA抽提試劑、PCR反應(yīng)體系試劑和DHPLC相關(guān)試 劑。
[0018] 進一步，所述PCR反應(yīng)體系試劑包括dNTP、MgCl2、Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、 去咼子水。
[0019 ]進一步，所述試劑盒還包括酶切常規(guī)組件，包括反應(yīng)緩沖液、去離子水。
[0020] 本發(fā)明還提供了上面所述的試劑盒在制備診斷顱內(nèi)動脈瘤易感性試的診斷產(chǎn)品 中的應(yīng)用。
[0021] 其中，所述的產(chǎn)品可以是芯片、陣列或試劑盒。所述芯片包括固相載體；以及固定 在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于上面所述的 MUC3B基因的SNP位點。所述芯片可用于檢測包括MUC3B基因的SNP位點在內(nèi)的多個SNP位點 (例如與顱內(nèi)動脈瘤易感性相關(guān)的一個或多個基因的一個或多個SNP位點），通過同時檢測 多個顱內(nèi)動脈瘤的易感性基因，可大大提高顱內(nèi)動脈瘤的準確率。
[0022] 在本發(fā)明中，針對MUC3B基因的SNP位點的寡核苷酸探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA 嵌合體、PNA或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸 序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。 同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不 同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿 基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。 所述探針自身互補序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
[0023] 在本發(fā)明中，所述固相載體包括塑料制品、微顆粒、膜載體等。所述塑料制品可通 過非共價或物理吸附機制與抗體或蛋白抗原相結(jié)合，最常用的塑料制品為聚苯乙烯制成的 小試管、小珠和微量反應(yīng)板;所述微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒，其直徑多為 微米，由于帶有能與蛋白質(zhì)結(jié)合的功能團，易與抗體(抗原）形成化學偶聯(lián)，結(jié)合容量大;所 述膜載體包括硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜及尼龍膜等微孔濾膜。
[0024] 在本發(fā)明中的一些實施例中，所述檢測試劑盒在人類受試者中進行顱內(nèi)動脈瘤的 易感性評價和/或診斷和/或預(yù)測的體外方法中使用，其中所述試劑盒包含用于進行下列步 驟的適當?shù)墓ぞ撸?br>[0025] (1)評價至少一種與所述的人類受試者的基因組DNA樣品中的MUC3B基因 SNP位點 的類型和/或水平；
[0026] (2)將所述的人類受試者的在（1)中評價的生物標記數(shù)據(jù)與健康的和/或患病的人 的生物標記數(shù)據(jù)進行比較，來做出所述的人類受試者的顱內(nèi)動脈瘤的風險評價和/或診斷 和/或預(yù)測。
[0027] 在本發(fā)明中，術(shù)語"基因型"指存在于個體或樣品中的等位基因的同一性。典型地， 其指與感興趣的特定基因相關(guān)的個體的基因型；在多倍體個體中，其指個體攜帶有基因等 位基因的何種組合。
[0028] 在一些實施例中，所述試劑盒在鑒定人類受試者中的與顱內(nèi)動脈瘤易感性相關(guān)的 SNP的體外方法中使用，所述試劑盒包含用于進行下列步驟的適當?shù)墓ぞ撸?br>[0029] (1)檢測所述的人類受試者的核酸樣品中的MUC3B基因的至少一種SNP，其中所述 至少一種SNP預(yù)示著顱內(nèi)動脈瘤的易感性；
[0030] (2)鑒定所述的人類受試者的SNP單倍型，其中所述SNP單倍型包含所述在（1)中檢 測的SNP。
[0031] 在本發(fā)明中，當是指檢測試劑盒時，術(shù)語"適當?shù)墓ぞ?是指任何用于達到所指明 的目的的任何技術(shù)手段。作為這種適當?shù)墓ぞ叩姆窍拗菩岳?，能列舉試劑和/或材料和/ 或流程和/或說明書和/或軟件等。本發(fā)明所述的所有試劑盒可包含適當?shù)陌b和說明書用 于在本文所公開的方法中使用。
[0032]在本發(fā)明中，"核酸"意指DNA和RNA兩者，兩者均以任何可能的構(gòu)型存在，即以雙鏈 (ds)核酸的形式，或以（ss)核酸的形式，或者以其組合形式(部分ds或ss)。這樣的核酸對應(yīng) 于任選地包含至少一種修飾的核苷酸的至少兩個連續(xù)的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
[0033] 核酸也可以在核苷酸件的鍵的水平上被修飾（如硫代磷酸、Η-磷酸酯、烷基磷酸 酯），在主鏈的水平上被修飾(例如α_寡核苷酸)或ΡΝΑ或2' -0-烷基核糖）。這些修飾中的每 一種可以聯(lián)合發(fā)生，只要在核酸中存在至少一種磷酸酯。所述核酸可以是天然的或合成的、 寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖體RNA、信使RNA、轉(zhuǎn)移RNA、通過酶促擴增技術(shù)獲得的核 酸。所述酶促擴增技術(shù)例如是PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))及其RT-PCR衍生形式、PCR(修復(fù)鏈反 應(yīng)）、3SR(自動維持序列擴增）、NASBA(依賴核酸序列的擴增）、TM(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增）。
[0034] 在本發(fā)明中，術(shù)語"引物"指天然存在的寡核苷酸(例如限制性片段)或合成產(chǎn)生的 寡核苷酸，其能夠用作引物延伸產(chǎn)物合成的起始點，當處于適當?shù)臈l件(例如緩沖液、鹽、溫 度和pH)以及存在核苷酸和用于核酸聚合的試劑(例如依賴DNA或依賴RNA的聚合酶)的條件 下，所述引物延伸產(chǎn)物與核酸鏈(模板或靶序列)互補。
[0035] 進一步，所述檢測rs100 389954位點試劑包括針對SNP位點rs100 389954的引物和/ 或探針。所述試劑還包括針對現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報道的診斷顏內(nèi)動脈瘤易感性基因 SNP位點 的引物和/或探針。將一種或多種基因的多個SNP位點的檢測引物和/或探針放置在同一試 劑盒中通過檢測多種SNP位點指標聯(lián)合診斷顱內(nèi)動脈瘤易感性的情況也包含在本發(fā)明的保 護范圍之內(nèi)。
[0036]在本發(fā)明中，"陣列"或"微陣列"是雜交陣列原件有序排列在基質(zhì)上，所述雜交陣 列原件諸如聚核苷酸探針（例如寡核苷酸）或結(jié)合劑（例如抗體）。所述基質(zhì)可以是固體基 質(zhì)，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纖維光學粘結(jié)劑或半固態(tài)基質(zhì)，例如硝酸纖維素膜。核 苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。微陣列可從產(chǎn)生自已知顱內(nèi)動脈瘤易感性的 基因-特異的寡核苷酸探針來制備。陣列可含有每個基因 SNP位點的不同的寡核苷酸探針， 陣列還可含有對照，非特異雜交的一個或多個適當?shù)膶φ找部砂ㄓ谖⑿酒稀?br>[0037]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0038] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 MUC3B基因 SNP位點rs100 389954與顱內(nèi)動脈瘤有關(guān)。因此在此 基礎(chǔ)上提出一種通過檢測顱內(nèi)動脈瘤易感性風險性的試劑盒。本發(fā)明的檢測試劑盒具有良 好靈敏性、穩(wěn)定性和特異性。本發(fā)明的試劑盒對正常人群進行顱內(nèi)動脈瘤易感性的篩查，能 有效起到風險預(yù)警、早期診斷的作用。
【具體實施方式】
[0039]下面結(jié)合具體的實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于解釋本發(fā)明， 并不意味著限制本發(fā)明的保護范圍。
[0040] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0041] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0042 ]實施例1與顱內(nèi)動脈瘤易感性相關(guān)基因 SNPs位點的篩選
[0043] 1、樣本及臨床資料的收集和儲存
[0044]收集顱內(nèi)動脈瘤SAH的患者10例，動脈瘤性的SAH的診斷依據(jù)美國卒中協(xié)會(ASA) 美國心臟協(xié)會(AHA)制定的動脈瘤性SAH治療指南的標準所進行，并且經(jīng)過頭顱CT檢查確 診，排除高血壓腦出血、腦血管畸形患者，并排除因腦顱腦外傷、顱內(nèi)感染、瘤卒中或顱內(nèi)轉(zhuǎn) 移瘤等其它原因所致SAH。顱內(nèi)動脈瘤均經(jīng)臨床癥狀及全腦數(shù)字減影血管成像和/或CT血管 成像確診為顱內(nèi)動脈瘤。
[0045] 詳細記錄入組患者的病因、發(fā)病過程及治療經(jīng)過，并對其一般臨床資料如年齡、性 另IJ，高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、吸煙史及家族史等數(shù)據(jù)資料進行登記，并建立該研究項 目的疾病資料數(shù)據(jù)庫。
[0046] 2、DNA 的提取
[0047]全部入組患者采集2ml的抗凝外周血標本，采用酚-氯仿法提取基因組DNAANA標 本分離自外周血白細胞。
[0048] (1)將收集的抗凝血標本從-80°C取出后置于室溫，待溶化后將血轉(zhuǎn)入另一干凈的 離心管，蓋嚴后于5000g離心15min;
[0049] (2)將離心后的血上層棄去，留血細胞，加入適量裂解緩沖液(含10mM pH為8.0的 Tris-HC1、0.1M EDTA、20g/ml胰RNA酶、0.5%SDS)，混勻，于37°C溫浴lh，加蛋白酶K(100g/ ml)混勻后37°C溫浴過夜；
[0050] (3)溫浴結(jié)束后加入等體積經(jīng)Tris-HCl飽和過的平衡酚（pH7.4)充分混勻后于 8000g離心 15min;
[0051] (4)將上層水相移至另一離心管并加入等體積酚:氯仿（1:1)，充分混勻后8000g離 心15min;
[0052] (5)將上層水相移入另一離心管中，加入10%體積的乙酸銨溶液（10M)，混勻后加 入2倍體積的無水乙醇，混勻后放入-20°C。沉淀出的DNA經(jīng)75%乙醇洗滌兩次后，溶于適量 TE緩沖液。使用分光光度計測定DNA濃度。
[0053] 3、基因組DNA電泳鑒定
[0054]回收得到的DNA片段使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定是否降解。
[0055] 4、DNA濃度的測定
[0056]提取出的DNA通過紫外分光光度法來測定其濃度與純度。DNA應(yīng)達到以下標準：濃 度在10ng/ul以上;0D260/280 = 1.8~2. (LDNA樣品置于1.5ml EP管中儲存于-80°C超低溫 冰箱內(nèi)。進行SNP分型檢測時，樣品被編碼后分裝于96孔板內(nèi)。
[0057] 5、顱內(nèi)動脈瘤全基因組的測定
[0058]將得到的核酸樣品送到華大基因進行全基因組測序。
[0059] 6、數(shù)據(jù)分析
[ΟΟ?Ο] (1)對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，去除帶接頭(adapter)的reads對;去除單端測序read中 N(N表示無法確定堿基信息）的比例大于10 %時的reads對;去除單端測序read中含有的低 質(zhì)量(低于5)堿基數(shù)超過該條read長度比例的50 %時的reads對。
[0061] (2)將質(zhì)控數(shù)據(jù)比對到人類參考基因，組序列hgl8上，通過算法預(yù)測出SNP位點。
[0062] (3)對染色體位置，ref堿基，alt堿基的突變結(jié)果進行注釋和解讀以及篩選，去掉 dbsnp的位點，保留missense和splicesite的位點；通過染色體堿基的改變得到氨基酸的變 化，并且將突變位點定位到基因上，進行SIFT預(yù)測和打分，得到定位基因的描述信息等。
[0063] (4)根據(jù)基因重復(fù)數(shù)排序，選取至少有3個基因重復(fù)數(shù)的基因，統(tǒng)計各個基因在不 同樣本中出現(xiàn)的次數(shù)，構(gòu)建熱圖，尋找與疾病相關(guān)的位點。
[0064] 7、結(jié)果
[0065]通過數(shù)據(jù)分析，篩選出了與顱內(nèi)動脈瘤的易感性相關(guān)的位點，MUC3B的SNP位點，發(fā) 現(xiàn)rs 100389954位點由T突變?yōu)镚。
[0066]實施例2與顱內(nèi)動脈瘤易感性相關(guān)基因 SNPs位點的鑒定 [0067] 1、臨床資料
[0068] 1.1研究對象
[0069] 顱內(nèi)動脈瘤組:所選取的研究對象為神經(jīng)外科收集的顱內(nèi)動脈瘤SAH的患者。動脈 瘤性的SAH的診斷依據(jù)美國卒中協(xié)會(ASA)美國心臟協(xié)會(AHA)制定的動脈瘤性SAH治療指 南的標準所進行，并且經(jīng)過頭顱CT檢查確診，排除高血壓腦出血、腦血管畸形患者，并排除 因腦顏腦外傷、顏內(nèi)感染、瘤卒中或顏內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤等其它原因所致SAH。顏內(nèi)動脈瘤均經(jīng)臨床 癥狀及全腦數(shù)字減影血管成像和/或CT血管成像確診為顱內(nèi)動脈瘤。
[0070] 對照組:對照組受試者為本院體檢科體檢的無顱內(nèi)動脈瘤病史的人群。所有研究 對象均有可提供的血液標本。
[0071] 1.2病理及臨床資料
[0072] 詳細記錄入組患者的病因、發(fā)病過程及治療經(jīng)過，并對其一般臨床資料如年齡、性 另IJ，高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、吸煙史及家族史等數(shù)據(jù)資料進行登記，并建立該研究項 目的疾病資料數(shù)據(jù)庫。
[0073] 兩組均為無親緣關(guān)系、地區(qū)及性別匹配的中國人群。本過程遵循程序符合人體試 驗委員會制定的倫理學標準，并取得受試者的知情同意。受試者均經(jīng)過肘靜脈取l〇ml全血 或收集臨床檢查后剩余的血樣，檸檬酸鈉抗凝，用于全基因組DNA提取和血清學指標的檢 測 。
[0074] 入組標準：
[0075] (1)顱內(nèi)動脈瘤患者；（2)有完整的臨床病歷資料，包括顱內(nèi)動脈瘤確診年齡、性 另IJ、種族、動脈瘤大小、是否破裂、Hunt-Hess分級、GCS分級、以及既往藥物治療情況；（3)所 有患者均可獲得完整的隨訪資料。
[0076] 最后共148例顱內(nèi)動脈瘤患者納入顱內(nèi)動脈瘤組，126例非顱內(nèi)動脈瘤人群納入對 照組。其中，病例組男70例，女78例，年齡為20~78歲，平均48歲。對照組中男60例，女66例， 年齡11~79歲，平均43.5歲。
[0077] 2、DNA提取步驟同實施例1
[0078] 3、SNP目的區(qū)域內(nèi)的PCR反應(yīng)
[0079] 3.1引物設(shè)計及合成
[0080] 根據(jù)確定MUC3B的SNP位點，以SNP位點為中心截取100bp以上長度的基因序列，利 用Primer Premier5.0軟件設(shè)計合成引物，引物序列如下：
[0081] 正向引物：5，-TCTTCTGCCAGCATAACT-3，（SEQ ID N0.1)
[0082] 反向引物：5，-GGACAGGTGACCATTTCG_3，（SEQ ID NO·2)
[0083] 3.2PCR 反應(yīng)
[0084] 配置25μ1 PCR反應(yīng)體系，分別含有l(wèi).OmM MgCl2,4種dNTP各120μΜ，各種引物分別 為0 · 12μΜ，TaqDNA polymerase 1 · 6U，模板DNA20ng 1CR條件為：預(yù)變性94°C，5min，（95°C 3〇8,54-55Γ458,72Γ458) X35個循環(huán)，72°C，5min。
[0085] 擴增的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳(GelRed)檢測后用凝膠成像系統(tǒng)進行初 步驗證。
[0086] 4、統(tǒng)計學處理與分析
[0087]病例-對照分析中，各位點多態(tài)性與顱內(nèi)動脈瘤易患風險相關(guān)性有無顯著性差異 經(jīng)由X2檢測進行判定。P<〇.05認為有顯著性差異。
[0088] 5、實驗結(jié)果
[0089] 結(jié)果如表1所示，對照組中rs100 389954位點基因型頻率在顱內(nèi)動脈瘤病例組和對 照組之間具有顯著性差異(P〈〇.〇5)，進而分析得出rs100 389954位點基因型T/G與顱內(nèi)動脈 瘤的易感性相關(guān)，當該SNP位點由T突變?yōu)镚時，患者有患顱內(nèi)動脈瘤的風險。
[0090] 表lrs100 389954位點基因型的卡方檢驗
[0092]實施例3顱內(nèi)動脈瘤易感性診斷試劑盒
[0093] 根據(jù)MUCB3基因 SNP位點rs100 389954與顱內(nèi)動脈瘤易感性的相關(guān)性，可以通過檢 測該SNP位點的基因型來診斷顱內(nèi)動脈瘤的易感性，據(jù)此本發(fā)明提供了一種基于診斷骨肉 瘤易感性的試劑盒，該診斷試劑盒中還包括DNA抽提試劑和PCR反應(yīng)體系試劑，其中PCR反應(yīng) 體系中擴增MUCB3基因 SNP位點rs100 389954的引物序列如SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所 示，進行PCR反應(yīng)的試劑還包括如dNTP、MgC12、Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。 [0094] 上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當指出，對于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進 和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 檢測MUC3B基因的SNP位點的試劑在制備診斷顱內(nèi)動脈瘤易感性的試劑盒中的用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述MUC3B基因的SNP位點為rs100 389954。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述試劑盒包括用于擴增rs100 389954位 點在內(nèi)的核苷酸序列的引物對。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于，所述擴增引物序列正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。5. -種診斷顱內(nèi)動脈瘤易感性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測MUC3B基因 SNP位點rs100 389954的試劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測MUC3B基因 SNP位點 rs100 389954的試劑包括擴增rs100 389954位點在內(nèi)的核苷酸序列的引物對。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述引物對的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括基因組DNA抽提試劑、 PCR反應(yīng)體系試劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)體系試劑包括dNTP、MgCl2、 Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。10. 權(quán)利要求5-9任一項所述的試劑盒在制備診斷顱內(nèi)動脈瘤易感性試的診斷產(chǎn)品中 的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105969889SQ201610527752
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月6日
【發(fā)明人】李志立, 魯芳, 黃光富, 譚海斌, 王振宇, 石毅, 陳隆益, 劉泠, 王奇, 殷成
【申請人】四川省人民醫(yī)院