大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541、引物及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541，該分子標(biāo)記TCR541與CRb基因共分離，可用于蕓薹種包括結(jié)球白菜和青梗菜抗根腫病基因的分子標(biāo)記輔助選擇。在輔助選擇過程中同時(shí)使用這些標(biāo)記，選擇理論準(zhǔn)確度可達(dá)到100％，并且該標(biāo)記重復(fù)性好，可靠性高，檢測(cè)成本低，省時(shí)省力。
【專利說明】
大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541、引物及 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子 標(biāo)記TCR541、引物及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 2002年，本課題組獲得了 1份抗蕓薹根腫病的大白菜雙單倍體系'CR Shinki DH' 系，研究表明該抗病材料抗蕓薹根腫菌生理小種2、4和8(Piao等，Conversion of AFLP marker linked to clubroot resistance gene into SCAR marker·2002，J Kor Soc Hort Sci 43:653-665)。進(jìn)一步研究證明抗根腫病基因?yàn)轱@性單基因，并命名為CRb(Piao 等，SCAR and CAPS mapping ofCRb,a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis)，TheorAppl Genet， 2004，108:1458-1465)。
[0003] 在蕓薹種抗根腫病品種轉(zhuǎn)育過程中，每代都需要采用田間接種根腫病菌的方法鑒 定中間材料的基因型，而且環(huán)境條件會(huì)影響到正確中間材料的選擇，這樣勢(shì)必影響轉(zhuǎn)育進(jìn) 程，因此抗病品種轉(zhuǎn)育難的問題還沒有徹底解決。分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)(MAS)可能是最終 解決這一問題的有效途徑。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)樸鐘云課題組獲得了與蕓薹種抗根腫病基因 CRb連鎖的 標(biāo)記（2004,2014)，包括TCR01，TCR05和TCR09,見（Piao等，SCAR and CAPS mapping of CRb,a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis)，以及TCR108、TCR30、TCR74、TCR79，M(Zhang 等，F(xiàn)ine genetic and physical mapping ofthe CRb gene conferring resistance to clubroot disease in Brassica rapa.，Mol Breeding，34:1173-1183)。但這些標(biāo)記并不 是與CRb共分離的標(biāo)記，利用這些標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選育時(shí)容易造成連鎖累贅。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541、弓丨 物及應(yīng)用，利用該分子標(biāo)記可對(duì)待測(cè)植株進(jìn)行苗期鑒定，從而減少連鎖累贅，簡(jiǎn)化大白菜抗 根腫病品種的轉(zhuǎn)育程序。
[0006] 本發(fā)明提供了一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541，所述大白 菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541的核苷酸序列為：
[0008]本發(fā)明還提供了一種上述大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541的 PCR特異性擴(kuò)增引物，包括：
[0009] F TCR541:5-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3 '
[0010] R TCR541:5 '-TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3 '。
[0011 ]本發(fā)明還提供了 一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541，在分子 標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明還提供了 一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541，在大白 菜抗根腫病分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種上述大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541的應(yīng) 用方法，具體包括：
[0014] (1)用CTAB方法提取待測(cè)材料的基因組DNA
[0015] ⑵PCR擴(kuò)增
[0016] a.反應(yīng)體系：10yL體系，各組分物質(zhì)的含量分別為15ng模板DNA;5pmol · I/1引物； l.Ommol.L-MNTPd.OuL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；ddH20補(bǔ)齊 10yL，混勻，離 心，
[0017] 其中引物的序列為F TCR541:5'-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3'，
[0018] R TCR541:5 '-TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3 '；
[0019]匕擴(kuò)增程序：94°(：預(yù)變性51^11;94°(：變性3〇8;60°(：退火458 ;72°(：延伸3〇8;35個(gè)循 環(huán)后;72°C延伸lOmin;最后4°C保存；
[0020] C.電泳:將擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液混合，94°C變性6min，之后在DNA測(cè)序 電泳儀上進(jìn)行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，70W條件下電泳2小時(shí)，電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染， 并觀察擴(kuò)增結(jié)果；
[0021] d.判斷:擴(kuò)增結(jié)果中如果能夠檢測(cè)到252bp和大于252bp兩條帶，則待測(cè)材料中含 有大白菜抗根腫病基因 CRb的概率為100%。
[0022]本發(fā)明提供的一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541，與蕓薹種 抗根腫病基因 CRb共分離，可廣泛應(yīng)用于蕓薹種抗根腫病基因 CRb的分子標(biāo)記輔助選擇育 種。本發(fā)明通過特異引物PCR擴(kuò)增可對(duì)待測(cè)植株進(jìn)行苗期鑒定，大大提高育種效率，縮短育 種進(jìn)程。
【附圖說明】
[0023] 圖1為TCR540和TCR541在抗病材料'CRBJN3-2'、感病材料'BJN3-2'以及重組體中 的擴(kuò)增結(jié)果；
[0024] 圖2為大白菜抗根腫病CRb基因的遺傳連鎖圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù) 范圍并不受【具體實(shí)施方式】的限制。
[0026] -、大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541和TCR540的獲得
[0027] 1、分離群體的構(gòu)建
[0028]以含抗根腫病基因 CRb的大白菜品系'CRBJN3-2'為父本，易感染根腫病的大白菜 品系' B JN3-2 '為母本雜交獲得?:，所獲FHf植株全部表現(xiàn)為抗病。以上兩個(gè)親本' CRBJN3-2 ' 和'BJN3-2'均保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)。選擇單株Fi自交構(gòu)建內(nèi)代作圖群體，群體數(shù)為4783個(gè)。 播種的全部4783個(gè)F 2群體，種植10天后接種根腫菌。40天后進(jìn)行抗病性鑒定，4783個(gè)F2群體 中3641個(gè)抗病，1142個(gè)感病，經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合3:1的分離比（X2 =3.16 =3.84)。
[0029] 2、CTAB 法提取 DNA
[0030] 1)、在1.5ml離心管中加入498uL 1 X CTAB提取液以及2uLf3-巰基乙醇，搖勻，其中1 X CTAB提取液包含2% 的CTAB，100mmol/L的Tris-HCl，20mmol/L的EDTA和 1 · 4mol/L的NaCl， 其中2%的CTAB指的質(zhì)量濃度為2%(w/v);
[0031] 2)、取0.2g幼嫩葉片，在液氮條件下研磨至粉末，加入到含有CTAB提取液和β-巰基 乙醇的離心管中，搖勻；
[0032] 3)、隨后將離心管放入65°C水浴中，每隔5分鐘搖一次，水浴30min;
[0033] 4)、取出離心管，加入等體積的氯仿:異戊醇混合物(24:1，v/v)，搖晃lOmin后，常 溫下 12000r/min 離心 lOmin;
[0034] 5)、將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1，v/v)，搖晃 lOmin后，常溫下 12000r/min離心 lOmin;
[0035] 6)、將上清液移至另一離心管當(dāng)中，加入2倍體積事先預(yù)冷的無水乙醇，混勻后，將 抱團(tuán)的DNA挑入到裝有400uL TE緩沖液的離心管中溶解；
[0036] 7)、加入 1.5uL RNaseA(10ug/uL)，混勻后37Γ保存30min;
[0037] 8)、重復(fù)步驟5);
[0038] 9)、將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，向離心管中加入50uL 3mol/L NaAC溶液和預(yù) 冷的等體積的異丙醇，-20 °C沉淀20min;
[0039] 10)、4°C條件下12000r/m離心10min，棄掉上清液，加入75%的乙醇清洗2次；
[0040] 11)、在超凈工作臺(tái)上風(fēng)干DNA，加入50yL TE (Tri s-EDTA)溶解DNA，-20 °C冰箱中保 存。
[0041 ]二、大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541和TCR540的獲得和鑒定 [0042] 1、多態(tài)性引物的篩選
[0043] 根據(jù)樸鐘云課題組2014年發(fā)表的抗根腫病CRb基因的2個(gè)側(cè)翼標(biāo)記TCR79和TCR108 序列（Zhang等，F(xiàn)ine genetic and physical mapping of the CRb gene conferring resistance to clubroot disease in Brassica rapa.，Mol Breeding,34:1173-1183), 將該基因錨定在大白菜A3連鎖群83.5kb區(qū)間內(nèi)。分析Brassica Database數(shù)據(jù)庫(http:// brassicadb.org)序列信息，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)區(qū)域存在15個(gè)基因。根據(jù)這15個(gè)基因的基因功能，對(duì) 其中5個(gè)抗病相關(guān)基因在抗病材料' CRBJN3-2 '上進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)抗病 材料中有3個(gè)基因的序列與Brassica Database數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org)中參考基 因組序列存在差異。因此，根據(jù)抗病材料的測(cè)序結(jié)果，利用Primer5.0軟件，共設(shè)計(jì)3對(duì)引物。 [0044]利用設(shè)計(jì)的3對(duì)引物擴(kuò)增親本' CRBJN3-2 '和' BJN3-2 '的DNA，其中有2對(duì)引物在親 本間具有多態(tài)性，并分別命名為TCR540和TCR541，TCR540和TCR541對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記的序列 分別為：
[0045] (l)TCR540(148bp)的核苷酸序列如SEQ ID N0.1 所示，為：

[0047] (2)TCR541(252bp)的核苷酸序列如SEQIDN0.4所示，為：
[0049] 根據(jù)上述序列分別設(shè)計(jì)并合成了針對(duì)TCR540的一對(duì)引物F TCR540/R TCR540,以 及針對(duì)TCR541的一對(duì)引物F TCR541/R TCR541，具體序列如下：
[0050] (1)TCR540的引物：
[0053] (2)TCR541 的引物：
[0056] 2、分子標(biāo)記的鑒定
[0057] 為了驗(yàn)證這些分子標(biāo)記的可靠性，首先，利用CRb兩翼連鎖標(biāo)記TCR79和TCR74見 (Zhang等，F(xiàn)ine genetic and physical mapping of the CRb gene conferring resistance to clubroot disease in Brassica rapa·，Mol Breeding，34:1173-1183)篩 選1142株F2代感病個(gè)體中的重組體；然后，利用TCR540的引物（F TCR540/R TCR540)和 TCR541的引物(F TCR541/R TCR541)分別對(duì)含抗根腫病基因 CRb的大白菜'CR BJN3-2'和易 感根腫病的大白菜自交系'BJN3-2 '及其44fF2代感病重組體進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果表 明如圖1所示，圖1A為TCR540在抗病材料' CRBJN3-2 '（R泳道）、感病材料' BJN3-2 '（S泳道）以 及重組體（1-44號(hào)泳道）中的擴(kuò)增結(jié)果，使用TCR540的引物進(jìn)行擴(kuò)增，在抗病親本'CRBJN3-2 '上能擴(kuò)增出一條148bp的條帶，在感病親本' BJN3-2 '和44株?2代感病重組體上均能擴(kuò)增 出一條大于148bp的條帶；圖1B為TCR541在抗病材料' CR BJN3-2 '（R泳道）、感病材料' BJN3-2'（S泳道）以及重組體(1-44號(hào)泳道)中的擴(kuò)增結(jié)果，使用TCR541的引物進(jìn)行擴(kuò)增，在抗病親 本' CRBJN3-2 '上能擴(kuò)增出一條252bp的條帶，在感病親本' BJN3-2 '和44株?2代感病重組體 上均能擴(kuò)增出一條大于252bp的條帶。
[0058] 3、遺傳圖譜的構(gòu)建
[0059] 根據(jù)F2群體的篩選鑒定結(jié)果，計(jì)算各標(biāo)記與CRb基因間的重組率，Mapchart2.1繪 制CRb基因的遺傳連鎖圖譜（圖2)，圖右側(cè)標(biāo)記之間的數(shù)字表示標(biāo)記間的重組體數(shù)，圖左側(cè) 的數(shù)字表示兩標(biāo)記之間的遺傳距離，由圖可知!'0?79、1'0?108、1'0?30、1'0?37、1'0?74，分別定 位于距離CRb基因0.03cM、0.04cM、0.36cM、0.43cM、0.49cM處。而新開發(fā)的分子標(biāo)記TCR540、 TCR541與CRb基因存在共分離關(guān)系。因此，確定這2個(gè)標(biāo)記可以運(yùn)用到今后大白菜抗根腫病 CRb基因的分子標(biāo)記輔助選育過程當(dāng)中，并且由于這2個(gè)分子標(biāo)記為共分離標(biāo)記，與之前的 連鎖標(biāo)記相比，在分子標(biāo)記輔助育種的應(yīng)用中能夠消除連鎖累贅現(xiàn)象，大大提高轉(zhuǎn)育效率。
[0060] 三、大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541和TCR540在輔助選擇大白 菜抗根腫病植株中的應(yīng)用方法，具體包括：
[0061 ] 1、用CTAB方法提取待測(cè)材料的基因組DNA
[0062] 用CTAB方法提取待測(cè)大白菜材料的基因組DNA，具體步驟參照上文中"一、大白菜 抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541和TCR540的獲得"中"2、CTAB法提取DNA"部分記 載的內(nèi)容。
[0063] 2、PCR 擴(kuò)增
[0064] a.反應(yīng)體系：10yL體系，各組分物質(zhì)的含量分別為15ng模板DNA;5pmol · L-1引物； l.Ommol.L-MNTPd.OuL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；ddH20補(bǔ)齊 10yL，混勻，離 心，
[0065]其中，TCR540使用的引物的序列為：
[0066] F TCR540:5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3 '，
[0067] R TCR540:5 '-AAATATGCCTTCAATTGCTTC-3 '，
[0068] TCR541使用的引物的序列為：
[0069] F TCR541:5 '-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3 '，
[0070] R TCR541:5 '-TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3 '；
[0071] 匕擴(kuò)增程序：94°(：預(yù)變性51^11;94°(：變性3〇8;60°(：退火458 ;72°(：延伸3〇8;35個(gè)循 環(huán)后;72°C延伸lOmin;最后4°C保存。
[0072] 3、電泳：
[0073] TCR540:將擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液混合，94°C變性6min，之后在DNA測(cè)序 電泳儀上進(jìn)行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，70W條件下電泳1.5小時(shí)，電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀 染；
[0074] TCR541:將擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液混合，94°C變性6min，之后在DNA測(cè)序 電泳儀上進(jìn)行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，70W條件下電泳2小時(shí)，電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染。
[0075] 需要說明的是，上樣緩沖液采用聚丙烯酰胺凝膠電泳常用的緩沖液，其中包含 98%(w/v)的formamide，10mM的EDTA，0·001 %(w/v)的xylene cyanol和0·001 %(w/v)的 bromphenol blue。
[0076] 4、結(jié)果分析
[0077] ①在使用TCR540的引物的擴(kuò)增結(jié)果中如果能夠檢測(cè)到148bp和大于148bp兩條帶， 則待測(cè)材料中含有大白菜抗根腫病基因 CRb的概率為100 %。
[0078]②在使用TCR541的引物的擴(kuò)增結(jié)果中如果能夠檢測(cè)到252bp和大于252bp兩條帶， 則待測(cè)材料中含有大白菜抗根腫病基因 CRb的概率為100 %。
[0079] 如果①、②2項(xiàng)中的擴(kuò)增結(jié)果均可獲得，則待測(cè)材料具有大白菜抗根腫病基因 CRb 的概率為100 %。
[0080] 盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造 性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu) 選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。
[0081] 顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精 神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍 之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541，其特征在于，所述大白菜抗 根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541的核苷酸序列為： 5'-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAAAAATCTACCTGGAAGCATCAAGAAACTTCATCATCTCAAATCTCTTT ACTTGCATTGTCAACAGCTCGTTTCTCTTCCACTGCTTCCATCAAATCTGCAGTATCTGGATGCTCATGGCTGTATC TCACTCGAAACAGTGGCTAAACCCATGACGCTTCTTGTGGTAGCTGAAAGGAACCAGTCTACTTTCGTCTTCACTGA TTGTTTCAAGCTAAACAGAGATGCGCAA-3'〇2. -種權(quán)利要求1所述的大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541的PCR特異 性擴(kuò)增引物，包括： F TCR541:5 '-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3 ' R TCR541:5 '-TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3 '。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541，在分子標(biāo) 記輔助選擇中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541，在大白菜 抗根腫病分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。5. -種權(quán)利要求1所述的大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標(biāo)記TCR541的應(yīng)用方 法，具體包括： (1) 用CTAB方法提取待測(cè)材料的基因組DNA (2) PCR擴(kuò)增 a. 反應(yīng)體系：10yL體系，各組分物質(zhì)的含量分別為15ng模板DNA;5pmol · I/1引物； l.Ommol.L-MNTPd.OuL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；ddH20補(bǔ)齊 10yL，混勻，離 心， 其中引物的序列為F TCR541:5'-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3'，R TCR541:5'_ TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3'； b. 擴(kuò)增程序：94°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s; 60°C退火45s; 72°C延伸30s; 35個(gè)循環(huán)后； 72°(：延伸1〇11^11;最后4°(：保存； c .電泳:將擴(kuò)增產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液混合，94°C變性6min，之后在DNA測(cè)序電泳 儀上進(jìn)行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，70W條件下電泳2小時(shí)，電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染，并觀 察擴(kuò)增結(jié)果； d.判斷:擴(kuò)增結(jié)果中如果能夠檢測(cè)到252bp和大于252bp兩條帶，則待測(cè)材料中含有大 白菜抗根腫病基因 CRb的概率為100 %。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105969881SQ201610457997
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】樸鐘云, 張騰, 龐文星, 李曉楠, 樸英蘭, 張椿雨
【申請(qǐng)人】沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)