本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種吡唑類雜環(huán)化合物。本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法、其藥物組合物及其用于制備預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松的藥物的用途。

背景技術(shù)：

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是一種以骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性骨量顯著減少的病癥，其導(dǎo)致骨骼脆性增加及病理性骨折。骨量受各種因素影響，例如遺傳、營(yíng)養(yǎng)、激素水平的改變、運(yùn)動(dòng)和生活方式的差異等，并且已知骨質(zhì)疏松的主要原因是老化、運(yùn)動(dòng)不足、體重過(guò)輕、吸煙、低鈣飲食攝入、絕經(jīng)、卵巢切除術(shù)等。對(duì)于大多數(shù)人，骨量在14-18歲達(dá)到峰值，并且在老年時(shí)每年減少約1％。目前，我國(guó)50歲以上人群中骨質(zhì)疏松癥總患病率為15.7％，隨著人口壽命的延長(zhǎng)，這一比例在逐步增加。特別地，在女性的情況下，骨流失在30歲后持續(xù)發(fā)生，并且在絕經(jīng)期間由于激素平衡的改變而快速發(fā)展。即在女性到達(dá)絕經(jīng)期時(shí)，雌激素水平迅速降低。這時(shí)，形成大量B-淋巴細(xì)胞，看起來(lái)通過(guò)白介素＝7(IL-7)發(fā)生，并且前B細(xì)胞在骨髓中積累，結(jié)果引起IL-6水平升高，因此導(dǎo)致破骨細(xì)胞的活性增加且最終骨量水平降低。因此，骨質(zhì)疏松對(duì)于老年人特別是絕經(jīng)期后的婦女是不可避免的疾病狀況。

骨質(zhì)疏松癥治療藥物的研究雖取得了很大進(jìn)展，但目前臨床上使用的治療藥物缺乏特異性，普遍存在較嚴(yán)重的副作用。例如，最常用作骨質(zhì)疏松的治療劑但尚未證實(shí)其實(shí)際效力的雌激素不利地需要終生給藥，并且其長(zhǎng)期給藥可能導(dǎo)致不良副作用，例如乳腺癌或子宮癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。阿侖膦酸鹽則是胃腸道吸收緩慢，并且是胃腸道和食道粘膜炎癥的發(fā)病機(jī)理。已知鈣制品具有較少的副作用和極好的效力，但是它是預(yù)防劑而不是治療劑。此外，已知維生素D制品如降鈣素，但是尚未充分研究它們的效力和副作用。因此，需要開(kāi)發(fā)新的骨質(zhì)疏松治療劑，其具有較少的副作用和極好的效力。

作為解決上述問(wèn)題和研制抗骨質(zhì)疏松癥的有效的治療藥物的深入研究和實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人成功地合成了新型吡唑類雜環(huán)化合物，并且發(fā)現(xiàn)這些化合物對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療和預(yù)防具有優(yōu)異的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)于骨質(zhì)疏松具有優(yōu)異預(yù)防和治療作用的吡唑類雜環(huán)化合物。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的目的是提供制備所述吡唑類雜環(huán)化合物的方法。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的目的是提供用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松的、包含有吡唑類雜環(huán)化合物的藥物組合物。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的目的是提供用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松的方法，其包括向有需要的個(gè)體給予有效量的吡唑類雜環(huán)化合物，并且提供本發(fā)明的吡唑類雜環(huán)化合物在制備用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松的藥物的用途。

本發(fā)明提供由如式I表示的吡唑類雜環(huán)化合物，及其藥學(xué)上可接受的鹽：

其中：

X₁選自O(shè)、S或NH；

各個(gè)X₂可以相同或不同，各自獨(dú)立地選自N或CR₁；

各個(gè)X₃可以相同或不同，各自獨(dú)立地選自N或CR₂，并且所述X₃中至少有一個(gè)是N；

R₁、R₂各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、烷基、烷氧基、烷硫基、氰基、羥基、硝基、NR₃R₄、CONR₃R₄、取代或非取代的芳基、取代或非取代的芳烷基、取代或非取代的雜芳基、取代或非取代的雜芳烷基；

各個(gè)R_a可以相同或不同，各個(gè)R_b可以相同或不同，并且R_a、R_b各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、烷基、烷氧基、烷硫基、氰基、羥基、硝基、NR_aR₄、CONR_aR₄、取代或非取代的芳基、取代或非取代的芳烷基、取代或非取代的雜芳基、取代或非取代的雜芳烷基；

其中，R₃、R₄各自獨(dú)立地選自氫或烷基，或者R₃和R₄共同形成取代或非取代的雜環(huán)基。

本發(fā)明的優(yōu)選方案中，所述取代的芳基、取代的芳烷基、取代的雜芳基、取代的雜芳烷基、取代的雜環(huán)基中的取代基選自鹵素、烷基、羥基、氰基、硝基或NR₅R₆，其中所述R₅、R₆各自獨(dú)立地選自氫或烷基。

本發(fā)明的優(yōu)選方案中，所述鹵素包括氟、氯、溴、碘，優(yōu)選為氯或溴。

本發(fā)明的優(yōu)選方案中，所述烷基包括C1-C6的直鏈或支鏈烷基，優(yōu)選C1-C4的直鏈或支鏈烷基，更優(yōu)選為甲基、乙基、異丙基、正丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、正己基、異己基的任一種。

本發(fā)明的優(yōu)選方案中，所述芳基包括C6-C10芳基，優(yōu)選為苯基、萘基、四氫萘基的任一種。

本發(fā)明的優(yōu)選方案中，所述雜芳基包括含有一至三個(gè)選自N、O、S的雜原子的5-、6-或7-元芳香基團(tuán)，優(yōu)選為噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、吡嗪基、噻唑基的任一種。

本發(fā)明的優(yōu)選方案中，所述雜環(huán)基包括飽和的或未飽和的5-、6-或7一元環(huán)狀基團(tuán)，所述雜環(huán)基除了所連接的N原子外，還包含有1或2個(gè)選自N、O和S的雜原子；所述雜環(huán)基優(yōu)選為四氫吡咯基、哌啶基、高哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、二噻烷基、噠嗪基、吡嗪基或三嗪基的任一種。

本發(fā)明的優(yōu)選方案中，所述化合物選自：

1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基苯并呋喃-2-羧酸酯(化合物1)；

3-甲基-4-苯基-1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基苯并呋喃-2-羧酸酯(化合物2)；

3-(哌啶-1-基)-1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基苯并噻吩-2-羧酸酯(化合物3)；

4-乙基-(嘧啶-2-基)-1H-吡唑-5-基噻吩[2，3-b]吡啶-2-羧酸酯(化合物4)；

4-嗎啉基-1-(嘧啶-2-基)-1H-吡唑-5-基苯并噻吩-2-羧酸酯(化合物5)；

1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基5-苯基-苯并噻吩-2-羧酸酯(化合物6)；

1-(吡嗪-2-基)-1H-吡唑-5-基5-二甲氨基-苯并噻吩-2-羧酸酯(化合物7)；

1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基6-氯-1H吲哚-2-羧酸酯(化合物8)；

3-甲基-1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基7-氟-3(1H-吡咯-1-基)-苯并呋喃-2-羧酸酯(化合物9)。

就本發(fā)明的式I化合物而言，所述藥學(xué)上可接受的鹽是指具有藥學(xué)上可接受的游離酸的鹽。所述游離酸可以是無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸。無(wú)機(jī)酸的實(shí)例包括鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸。有機(jī)酸的實(shí)例包括檸檬酸、醋酸、乳酸、酒石酸、富馬酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、甲磺酸、苯磺酸、馬來(lái)酸、苯甲酸、葡萄糖酸、乙醇酸、琥珀酸、4-嗎啉乙磺酸、樟腦磺酸、4-硝基苯磺酸、羥基-O-磺酸、對(duì)甲苯磺酸、半乳糖醛酸、雙羥萘酸、谷氨酸和天冬氨酸。優(yōu)選地，所述無(wú)機(jī)酸為鹽酸，而有機(jī)酸為甲磺酸。

本發(fā)明提供一種制備所述式I所示的吡唑類雜環(huán)化合物或其藥學(xué)可接受的鹽的方法，所述方法包括：

步驟1)將式II所示的化合物和式III所示的化合物滴加入極性有機(jī)溶劑中；以及加熱包含式II所示的化合物和式III所示的化合物的極性有機(jī)溶劑，以獲得式IV所示的化合物：

步驟2)將式V所示的化合物、式VI所示的化合物置于非質(zhì)子溶劑中，加入無(wú)機(jī)堿，攪拌反應(yīng)后，制得式VII所示的化合物：

步驟3)將式VII所示的化合物在堿性水溶液中水解后，在二氯亞砜作用下，加熱回流形成酰氯，再在低溫下，加入縛酸劑得到混合液；常溫下將該混合液與式IV所示的化合物反應(yīng)得到目標(biāo)化合物I；

步驟4)必要的時(shí)候，將式I所示的化合物轉(zhuǎn)化為其藥學(xué)上可接受的鹽。

其中，X₁、X₂、X₃、R_a、R_b的定義如上所述，R為C1-C4烷基，M為OH或NO₂，R_x為C1-C4烷氧基，X為鹵素或巰基，優(yōu)選氯或溴。

本發(fā)明的優(yōu)選方案中，所述極性有機(jī)溶劑選自C1-C4醇如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇或叔丁醇，乙酸或者它們的混合物，并且優(yōu)選乙醇或乙酸。

本發(fā)明的優(yōu)選方案中，所述非質(zhì)子溶劑為DMF或DMSO。

本發(fā)明的優(yōu)選方案中，所述無(wú)機(jī)堿包括氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽，優(yōu)選為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀。

本發(fā)明的優(yōu)選方案中，所述堿性水溶液為氫氧化鈉水溶液、或者氫氧化鉀水溶液。

本發(fā)明的優(yōu)選方案中，所述縛酸劑為叔胺如三乙胺。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松的藥物組合物，其含有治療有效量的本發(fā)明所述的吡唑類雜環(huán)化合物或其藥用鹽與藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述吡唑類雜環(huán)化合物或其藥用鹽在藥物組合物中的含量為0.1wt.％-99.5wt.％，優(yōu)選為0.5wt.％-95wt.％。

本發(fā)明組合物可為本領(lǐng)域熟知的各種劑型，適合于本發(fā)明的劑型選自口服制劑、外用制劑或注射劑，優(yōu)選為口服制劑?？诜苿┻x自片劑、顆粒劑、膠囊劑、散劑、丸劑、滴丸、糖漿劑、露劑、泡騰劑、口服液、懸浮劑等；外用制劑選自凝膠劑、膏劑、搽劑、洗劑、涂抹劑、霜?jiǎng)?、軟膏劑等；注射劑選自針劑、輸液或凍干粉針等。可采用本領(lǐng)域熟知的制劑技術(shù)手段制備得到本發(fā)明的組合物。

本發(fā)明所述藥學(xué)上可接受的載體為本領(lǐng)域熟知的用于制備上述制劑的常用賦形劑或輔料。口服制劑或外用制劑常用的賦形劑或輔料包括但不僅限于填充劑、稀釋劑、潤(rùn)滑劑、分散劑、濕潤(rùn)劑、粘合劑、調(diào)節(jié)劑、增溶劑、抗氧劑、抑菌劑、乳化劑、崩解劑等，例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、乳糖、糖粉、糊精、微粉硅膠、硬脂酸鎂、滑石粉、氫氧化鋁、淀粉及其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、十二烷基硫酸鈉、水或醇等。

本發(fā)明所述注射劑常用的賦形劑或輔料包括但不僅限于：抗氧劑、抑菌劑、調(diào)節(jié)劑、乳化劑、增溶劑等，例如亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、0.5％苯酚、0.3％甲酚、鹽酸、枸櫞酸、聚山梨酯-80、卵磷酯、豆磷脂、吐溫-80、膽汁、甘油等。

有益效果

本發(fā)明通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所述吡唑類雜環(huán)化合物能夠抑制去卵巢引起的骨轉(zhuǎn)化率增強(qiáng)和骨質(zhì)破壞，同時(shí)可以提高血鈣濃度，有利于骨的沉積，因此具有顯著的預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的作用。

具體實(shí)施方式

在下文中更詳細(xì)地描述了本發(fā)明以有助于對(duì)本發(fā)明的理解。

應(yīng)當(dāng)理解的是，在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)或詞語(yǔ)不應(yīng)當(dāng)理解為具有在字典中限定的含義，而應(yīng)理解為在以下原則的基礎(chǔ)上具有與其在本發(fā)明上下文中的含義一致的含義：術(shù)語(yǔ)的概念可以適當(dāng)?shù)赜砂l(fā)明人為了對(duì)本發(fā)明的最佳說(shuō)明而限定。

實(shí)施例1：1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基苯并呋喃-2-羧酸酯(化合物1)

步驟1)將3-氧代-丙酸乙酯(2.32g，20.0mmol)和乙醇(20mL)置于圓底燒瓶中，并且在0℃下緩慢地滴加入用乙醇(20mL)稀釋的2-肼基吡啶(2.58g，23.6mmol)。將所得的溶液在回流下于100℃下加熱3天。通過(guò)在減壓下蒸餾來(lái)去除溶劑，將所得的固體用己烷和乙酸乙酯洗滌并真空干燥，得到白色固體1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-醇2.91g，收率90％。

ESI-MS：162.06[M+H]⁺

步驟2)冰浴條件下，將2-羥基-苯甲醛(2.68g，22.0mmol)和無(wú)水K₂CO₃(4.4g，31.2mmol)溶解于DMF(40ml)中，緩慢滴加溴代乙酸乙酯(4.1g，26.0mmol)。滴加完畢，-5℃攪拌30分鐘，然后在50℃油浴中反應(yīng)12小時(shí)。把反應(yīng)液倒入冰水中，過(guò)濾，氯仿溶解固體，無(wú)水Na₂SO₄干燥，過(guò)濾，旋干溶劑后，經(jīng)硅膠柱層析分離，得到黃色固體苯并呋喃-2-羧酸乙酯3.52g，收率為84％。

ESI-MS：191.06[M+H]⁺

步驟3)將苯并呋喃-2-羧酸乙酯(1.90g，10.0mmol)溶于二氧六環(huán)(20ml)中，加入1N的氫氧化鈉溶液(12ml)，常溫?cái)嚢?小時(shí)溶解，將二氧六環(huán)蒸干，剩余液體傾入冰水中，用二氯甲烷洗滌，調(diào)pH值至2，過(guò)濾，收集固體，將其溶于二氯亞砜(30ml)中，加入三乙胺0.5ml，攪拌后，加入1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-醇(1.93g，12.0mmol)，加熱回流1小時(shí)，減壓蒸除多余二氯亞砜，將其降溫至0℃，加入含有N，N-二甲基乙二胺(0.77g)和三乙胺(0.5ml)的二氯甲烷溶液(20ml)中，常溫?cái)嚢?h，得到化合物1：1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基苯并呋喃-2-羧酸酯2.61g，產(chǎn)率86％。

ESI-MS：305.10[M+H]⁺

元素分析：理論值/實(shí)測(cè)值，C(67.10/67.02)，H(3.97/4.03)，N(18.41/18.34)，0(10.52/10.61)

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.40(d，1H)，8.05(m，1H)，7.32-7.86(m，8H)，6.35(m，1H)。

實(shí)施例2：3-甲基-4-苯基-1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基苯并呋喃-2-羧酸酯(化合物2)

步驟1)將3-氧代-2-苯基-丙酸乙酯(4.12g，20.0mmol)和乙醇(20mL)置于圓底燒瓶中，并且在0℃下緩慢地滴加入用乙醇(20mL)稀釋的2-肼基吡啶(2.58g，23.6mmol)。將所得的溶液在回流下于100℃下加熱3天。通過(guò)在減壓下蒸餾來(lái)去除溶劑，將所得的固體用己烷和乙酸乙酯洗滌并真空干燥，得到白色固體3-甲基-4-苯基-1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-醇4.42g，收率88％。

ESI-MS：252.11[M+H]⁺

步驟2)冰浴條件下，將2-羥基-苯甲醛(2.68g，22.0mmol)和無(wú)水K₂CO₃(4.4g，31.2mmol)溶解于DMF(40ml)中，緩慢滴加溴代乙酸乙酯(4.1g，26.0mmol)。滴加完畢，-5℃攪拌30分鐘，然后在50℃油浴中反應(yīng)12小時(shí)。把反應(yīng)液倒入冰水中，過(guò)濾，氯仿溶解固體，無(wú)水Na₂SO₄干燥，過(guò)濾，旋干溶劑后，經(jīng)硅膠柱層析分離，得到黃色固體苯并呋喃-2-羧酸乙酯3.52g，收率為84％。

ESI-MS：191.06[M+H]⁺

步驟3)將苯并呋喃-2-羧酸乙酯(1.90g，10.0mmol)溶于二氧六環(huán)(20ml)中，加入1N的氫氧化鈉溶液(12ml)，常溫?cái)嚢?小時(shí)溶解，將二氧六環(huán)蒸干，剩余液體傾入冰水中，用二氯甲烷洗滌，調(diào)pH值至2，過(guò)濾，收集固體，將其溶于二氯亞砜(30ml)中，加入三乙胺0.5ml，攪拌后，加入3-甲基-4-苯基-1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-醇(3.01g，12.0mmol)，加熱回流1小時(shí)，減壓蒸除多余二氯亞砜，將其降溫至0℃，加入含有N，N-二甲基乙二胺(0.77g)和三乙胺(0.5ml)的二氯甲烷溶液(20ml)中，常溫?cái)嚢?h，得到化合物1：3-甲基-4-苯基-1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基苯并呋喃-2-羧酸酯3.16g，產(chǎn)率80％。

ESI-MS：396.13[M+H]⁺

元素分析：理論值/實(shí)測(cè)值，C(72.90/72.79)，H(4.33/4.41)，N(10.63/10.58)，0(12.14/12.22)

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.40(d，1H)，8.05(m，1H)，7.32-7.86(m，12H)，2.05(s，3H)。

實(shí)施例3：3-(哌啶-1-基)-1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基苯并噻吩-2-羧酸酯(化合物3)

步驟1)將3-氧代-3-(哌啶-1-基)-丙酸乙酯(4.02g，20.0mmol)和乙醇(20mL)置于圓底燒瓶中，并且在0℃下緩慢地滴加入用乙醇(20mL)稀釋的2-肼基吡啶(2.58g，23.6mmol)。將所得的溶液在回流下于100℃下加熱3天。通過(guò)在減壓下蒸餾來(lái)去除溶劑，將所得的固體用己烷和乙酸乙酯洗滌并真空干燥，得到白色固體3-(哌啶-1-基)-1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-醇3.91g，收率81％。

ESI-MS：245.13[M+H]⁺

步驟2)冰浴條件下，將2-硝基-苯甲醛(3.02g，20mmol)和無(wú)水K₂CO₃(4.4g，31.2mmol)溶解于DMF(40ml)中，緩慢滴加巰基乙酸乙酯(2.40g，20mmol)。滴加完畢，0℃攪拌30分鐘，然后在50℃油浴中反應(yīng)8小時(shí)。把反應(yīng)液倒入冰水中，過(guò)濾，氯仿溶解固體，無(wú)水Na₂SO₄干燥，過(guò)濾，旋干溶劑后，經(jīng)硅膠柱層析分離，得到黃色固體苯并噻吩-2-羧酸乙酯2.67g，收率為75％。

ESI-MS：179.01[M+H]⁺

步驟3)將苯并噻吩-2-羧酸乙酯(1.78g，10.0mmol)溶于二氧六環(huán)(20ml)中，加入1N的氫氧化鈉溶液(12ml)，常溫?cái)嚢?小時(shí)溶解，將二氧六環(huán)蒸干，剩余液體傾入冰水中，用二氯甲烷洗滌，調(diào)pH值至2，過(guò)濾，收集固體，將其溶于二氯亞砜(30ml)中，加入三乙胺0.5ml，攪拌后，加入3-(哌啶-1-基)-1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-醇(2.93g，12.0mmol)，加熱回流1小時(shí)，減壓蒸除多余二氯亞砜，將其降溫至0℃，加入含有N，N-二甲基乙二胺(0.77g)和三乙胺(0.5ml)的二氯甲烷溶液(20ml)中，常溫?cái)嚢?h，得到化合物1：3-(哌啶-1-基)-1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基苯并噻吩-2-羧酸酯3.16g，產(chǎn)率80％。

ESI-MS：305.13[M+H]⁺

元素分析：理論值/實(shí)測(cè)值，C(65.33/65.18)，H(4.98/4.91)，N(13.85/13.96)，0(7.91/7.90)，S(7.93/8.05)

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.42(d，1H)，8.32(s，1H)，8.02(m，1H)，7.32-7.86(m，6H)，6.35(m，1H)，3.70(t，4H)，1.50(m，6H)。

實(shí)施例4：4-乙基-(嘧啶-2-基)-1H-吡唑-5-基噻吩[2，3-b]吡啶-2-羧酸酯(化合物4)

步驟1)將3-氧代-2-乙基-丙酸乙酯(2.90g，20.0mmol)和乙醇(20mL)置于圓底燒瓶中，并且在0℃下緩慢地滴加入用乙醇(20mL)稀釋的2-肼基嘧啶(2.50g，24mmol)。將所得的溶液在回流下于100℃下加熱2天。通過(guò)在減壓下蒸餾來(lái)去除溶劑，將所得的固體用己烷和乙酸乙酯洗滌并真空干燥，得到白色固體2-乙基-1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-醇2.85g，收率75％。

ESI-MS：190.09[M+H]⁺

步驟2)冰浴條件下，將2-硝基-煙堿(3.02g，20mmol)和無(wú)水K₂CO₃(4.4g，31.2mmol)溶解于DMF(40ml)中，緩慢滴加巰基乙酸乙酯(2.40g，20mmol)。滴加完畢，0℃攪拌30分鐘，然后在50℃油浴中反應(yīng)8小時(shí)。把反應(yīng)液倒入冰水中，過(guò)濾，氯仿溶解固體，無(wú)水Na₂SO₄干燥，過(guò)濾，旋干溶劑后，經(jīng)硅膠柱層析分離，得到黃色固體噻吩[2，3-b]吡啶-2-羧酸乙酯2.51g，收率為70％。

ESI-MS：180.01[M+H]⁺

步驟3)將噻吩[2，3-b]吡啶-2-羧酸乙酯(1.79g，10.0mmol)溶于二氧六環(huán)(20ml)中，加入1N的氫氧化鈉溶液(12ml)，常溫?cái)嚢?小時(shí)溶解，將二氧六環(huán)蒸干，剩余液體傾入冰水中，用二氯甲烷洗滌，調(diào)pH值至2，過(guò)濾，收集固體，將其溶于二氯亞砜(30ml)中，加入三乙胺0.5ml，攪拌后，加入2-乙基-1-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-醇(2.30g，12.0mmol)，加熱回流1小時(shí)，減壓蒸除多余二氯亞砜，將其降溫至0℃，加入含有N，N-二甲基乙二胺(0.77g)和三乙胺(0.5ml)的二氯甲烷溶液(20ml)中，常溫?cái)嚢?h，得到化合物1：4-乙基-(嘧啶-2-基)-1H-吡唑-5-基噻吩[2，3-b]吡啶-2-羧酸酯2.91g，產(chǎn)率83％。

ESI-MS：352.18[M+H]⁺

元素分析：理論值/實(shí)測(cè)值，C(58.11/58.21)，H(3.73/3.68)，N(19.93/19.85)，0(9.11/9.04)，S(9.13/9.32)

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.85-8.31(m，5H)，7.71(S，1H)，7.36(S，1H)，7.40(S，1H)，2.52(m，2H)，1.25(t，3H)。

實(shí)施例5-9：按照類似的方法合成以下化合物5-9，區(qū)別在于用相應(yīng)的原料化合物進(jìn)行替換。

表1

生物活性測(cè)定實(shí)施例：本發(fā)明化合物的抗骨質(zhì)疏松作用的檢測(cè)

1、材料與方法

將十周齡健康SD雌鼠隨機(jī)分成11組，每組10只：實(shí)施例化合物1-9組、假手術(shù)組(Sham)、卵巢切除模型組(OVX)。飼養(yǎng)條件：溫度為(23±2)℃，光照∶黑暗為12∶12。讓各組大鼠適應(yīng)環(huán)境2周后開(kāi)始骨質(zhì)疏松造模手術(shù)：各組大鼠均經(jīng)腹腔注射20％烏拉坦麻醉(6ml/kg體重)，Sham組開(kāi)腹后關(guān)腹，其余各組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。術(shù)后第4周起，Sham組和OVX組每天進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料和去離子水，化合物1-9組每天進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料和去離子水，同時(shí)分別灌胃給與化合物1-9各10mg/kg，連續(xù)3個(gè)月，每周稱一次體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用烏拉坦麻醉，摘取眼球采血，2000r/min離心，吸取上清(即血清)。摘除大鼠子宮，迅速稱重。取出大鼠雙側(cè)股骨和雙側(cè)脛骨，剔除軟組織。兩脛骨經(jīng)800℃高溫爐中灰化8h，冷卻后稱灰重。用研缽碾碎成灰狀，取0.1g骨灰溶于1ml，6mol/l鹽酸中，測(cè)骨鈣和骨磷時(shí)取0.2ml用超純水稀釋至1ml，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)骨鈣和骨磷含量。左股骨用骨密度儀測(cè)量骨密度(BMD)。血清生化指標(biāo)測(cè)定：取血清0.5ml，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清堿性磷酸酶(ALP)、鈣(Ca)和磷(P)。

2、結(jié)果

1)血清ALP、血清Ca和血清P

表2本發(fā)明化合物對(duì)雙側(cè)卵巢切除大鼠血清ALP、血清Ca和血清P的影響

*P＜0.05，**P＜0.01，VS OVX組

從表2的結(jié)果可以看出，當(dāng)大鼠的卵巢被去除后，OVX組大鼠血清堿性磷酸酶活性增加。這是由于當(dāng)去卵巢后，大鼠體內(nèi)雌激素缺乏，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)化率增加，其與絕經(jīng)后婦女的高轉(zhuǎn)化型骨質(zhì)疏松癥一致。與之相反，化合物1-9組的試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)給予本發(fā)明化合物3個(gè)月后，堿性磷酸酶活性顯著下降，意味著本發(fā)明化合物可以抑制去卵巢引起的骨轉(zhuǎn)化率的增加，減少骨質(zhì)的破壞。表中數(shù)據(jù)還顯示與Sham組相比，OVX組大鼠血清鈣明顯下降，而化合物1-9組則顯示出顯著提升的血清鈣濃度，表明本發(fā)明化合物具有提升血清鈣濃度的作用。而血清鈣是骨形成的重要標(biāo)記物，這說(shuō)明本發(fā)明可以有效逆轉(zhuǎn)由于卵巢切除導(dǎo)致的血清鈣的降低，有利于骨的形成。

2)骨密度(BMD)

表3本發(fā)明化合物對(duì)雙側(cè)卵巢切除大鼠左股骨BMD的影響

*P＜0.05，**P＜0.01，VS OVX組

表3的結(jié)果顯示，去卵巢后OVX組大鼠左股骨骨密度較Sham組顯著下降，給予本發(fā)明化合物3個(gè)月后，大鼠骨密度顯著增加。

3)雙側(cè)脛骨參數(shù)

表4本發(fā)明化合物對(duì)雙側(cè)卵巢切除大鼠雙側(cè)脛骨參數(shù)的影響

*P＜0.05，**P＜0.01，VS OVX組

表4的結(jié)果顯示，與Sham組相比，OVX組大鼠雙脛骨灰重顯著降低，而化合物1-9組較OVX組顯著升高。此外，化合物1-9也能顯著升高骨鈣和骨磷含量。

綜上，本發(fā)明的吡唑類雜環(huán)化合物能夠抑制去卵巢引起的骨轉(zhuǎn)化率增強(qiáng)和骨質(zhì)破壞，同時(shí)可以提高血鈣濃度，有利于骨的沉積。對(duì)于由于雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松具有防治作用，并且無(wú)雌激素樣副作用。因此可以用于骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療。

以上描述了本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式，然其并非用以限定本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)在此公開(kāi)的實(shí)施方案可進(jìn)行并不偏離本發(fā)明范疇和精神的改進(jìn)和變化。