治療骨質(zhì)疏松的α-螺旋多肽及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及治療性多肽領(lǐng)域，具體涉及新型長(zhǎng)效ΡΤΗ(1-34)肽衍生物及其制備方 法，同時(shí)還涉及這些衍生物的醫(yī)療用途。
【背景技術(shù)】
[0002] ΡΤΗ(1-34)是人體甲狀旁腺激素(ΡΤΗΗ-34氨基酸片段，可以作為治療骨質(zhì)疏松癥 促骨形成藥物，能夠直接刺激成骨細(xì)胞，增加骨密度，降低骨折的風(fēng)險(xiǎn)。序列結(jié)構(gòu)為:S-V-S-Ε-Ι-Q-L-M-H-N-L-G-K-H-L-N-S-M-E-R-V-E-W-L-R-K-K-L-Q-D-V-H-N-F-NH2，長(zhǎng)期以來(lái)，人 們花大量精力來(lái)研究抗骨吸收藥物，然而骨吸收一旦被抑制或減弱，則骨重建的機(jī)會(huì)就減 少了，這是因?yàn)楣侵亟ㄖ行鹿堑男纬晌恢谜枪琴|(zhì)吸收的位置，骨吸收部位的減少意味著 骨形成部位的減少。相反，作為骨形成刺激藥物的ΡΤΗ(1-34)主要通過(guò)增加成骨細(xì)胞數(shù)量和 抑制成骨細(xì)胞的凋亡方式，直接刺激骨形成，提高骨密度，增加骨轉(zhuǎn)化和骨重建，從而達(dá)到 治療骨質(zhì)疏松的作用。與其他藥物相比，ΡΤΗ(1-34)組骨轉(zhuǎn)化能力更強(qiáng)，并且可以顯著降低 骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)，并且不良反應(yīng)少見。因此，ΡΤΗ是現(xiàn)今骨質(zhì)疏松癥治療最有前景的 藥物。目前獲得FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)用于骨質(zhì)疏松癥治療的促進(jìn)骨形成藥物是特立帕肽 (Teriparatide)。特立帕肽是甲狀旁腺激素1-34氨基酸片段:ΡΤΗ(1-34)，保留了甲狀旁腺 激素的生物活性，并且避免了 C端對(duì)骨代謝的不良影響。特立帕肽ΡΤΗ(1-34)非常適合治療 原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，不受性別影響。
[0003] 盡管相比于其他治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，ΡΤΗ(1_34)藥效好，副作用少，非常具有 前景。但是ΡΤΗ(1-34)也有不少缺點(diǎn)：由于ΡΤΗ( 1 -34)容易被胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶 在五分鐘內(nèi)降解掉，不能通過(guò)口服，目前主要通過(guò)每日皮下注射給藥，非常麻煩;ΡΤΗ( 1-34) 的半衰期很短，血漿半衰期只有不到30分鐘，相對(duì)于其昂貴的價(jià)格(特立帕肽注射液大約 6000元一支），治療成本非常高。因此，對(duì)ΡΤΗ( 1-34)進(jìn)行修飾改造，克服它原有的缺點(diǎn)是很 有必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是針對(duì)臨床上ΡΤΗ(1_34)在體內(nèi)半衰期短，需要頻繁注射給藥 的缺陷，提供一種作用時(shí)間更長(zhǎng)、療效更好的ΡΤΗ(1_34)衍生物。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該ΡΤΗ( 1-34)衍生物的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供該ΡΤΗ(1-34)衍生物在治療/預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥物 中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及到一種藥物，以所述ΡΤΗ( 1-34)衍生物為活性成分，用于治療/預(yù)防 骨質(zhì)疏松癥。
[0007] 通過(guò)對(duì)ΡΤΗ與其受體蛋白ΡΤΗΙ的結(jié)合方式與結(jié)合位點(diǎn)的研究表明，ΡΤΗ(1-34)與 ΡΤΗ I受體主要通過(guò)疏水相互作用結(jié)合。ΡΤΗ(1-34)的6個(gè)氨基酸殘基(V21、W23、L24、L28、 V31和F34)形成了的α-螺旋的疏水面，緊緊插入由3層PTH IR的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)折疊形成 的疏水槽中。此外，ΡΤΗ(1-34)上的氨基酸殘基V31有穩(wěn)定α-螺旋的作用；氨基酸殘基Ν16與 R20分別與PTH I受體的相應(yīng)氨基酸殘基形成一對(duì)和兩對(duì)氫鍵相互作用，并且R20也是PTH (1-34)與PTH I受體R有特異性結(jié)合能力的關(guān)鍵氨基酸。由此可見，PTH( 1-31)上氨基酸殘 基:附6、1?20、￥21、123、1^4、1^8、￥31和？34為？1'!1(1-34)與？1'!11受體結(jié)合作用的關(guān)鍵氨基酸 殘基位點(diǎn)。同時(shí)這種α_螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)于保持其生物活性極為重要。然而化學(xué)合成的多肽通常 都是一段無(wú)序結(jié)構(gòu)，很難保持其在生理?xiàng)l件下的二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，通過(guò)發(fā)展合適的化學(xué)修飾 方法，來(lái)穩(wěn)定合成多肽的α-螺旋結(jié)構(gòu)，一方面可以增強(qiáng)其與受體的親和力，另一方面，還能 大幅提升多肽的抗蛋白水解能力，這種方法在多肽藥物改造方面具有重要的潛在應(yīng)用價(jià) 值。通?？梢酝ㄟ^(guò)在多肽序列合適的位置側(cè)鏈成環(huán)的方式來(lái)穩(wěn)定多肽的α-螺旋結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈 一般在多肽α_螺旋的同一面上，側(cè)鏈氨基酸的位置一般為i/i+3，i/i+4，i/i+7，i/i+ll等， 其中應(yīng)用較多的是i/i+4和i/i+7。
[0008] 本發(fā)明以ΡΤΗ(1-34)為模板，用Cys替換i/i+4、i/i+7位置上的氨基酸，然后通過(guò)連 接臂側(cè)鏈成環(huán)的策略，來(lái)穩(wěn)定PTH(1_34)的α-螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)這種方法得到的一種PTH(1_ 34)衍生物，在保留良好的體內(nèi)活性的同時(shí)，解決了天然ΡΤΗ(1-34)半衰期短的問(wèn)題，這種 ΡΤΗ(1-34)衍生物在治療骨質(zhì)疏松癥藥物中具有更大的應(yīng)用潛力。由此完成了本發(fā)明。
[0009] 用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：一種ΡΤΗ(1-34)衍生物，所述衍生物為在相對(duì) 應(yīng)序列ΡΤΗ(1-34)第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替換，然后通過(guò)連接臂（linker)成環(huán)后 形成的化合物，其中i的取值為15、17、18、20、22、26、27或29。1八+7的位置上的氨基酸也是 用Cys替代，i的取值為19、22或26。所述連接臂（linker)選自化合物1或化合物2,結(jié)構(gòu)式如 下。當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化合物1時(shí)，對(duì)應(yīng)的PTH( 1-34)衍生物記為2f;當(dāng)連接臂 (linker)的結(jié)構(gòu)為化合物2時(shí)，對(duì)應(yīng)的PTH( 1-34)衍生物記為2b。
[0010]
[0011]
[0012] 當(dāng)i = 15，位置為i /i +4時(shí)，連接臂選用化合物1時(shí)；ΡΤΗα -34)衍生物的結(jié)構(gòu)如式 (PTH082f)所示：
[0013]
[0014] 當(dāng)i = 17，位置為i/i +4時(shí)，連接臂選用化合物1時(shí);PTH(1 -34)衍生物的結(jié)構(gòu)如式 (PTH092f)所示：
[0015]
[0016]當(dāng)i = 18,位置為i/i+4時(shí)，連接臂選用化合物1時(shí);ΡΤΗ(1-34)衍生物的結(jié)構(gòu)如式 (PTH102f)所示：
[0017]
[0018] 當(dāng)i = 20,位置為i/i+4時(shí)，連接臂選用化合物1時(shí)；ΡΤΗ(1-34)衍生物的結(jié)構(gòu)如式 (PTH112f)所示：
[0019]
[0020] 當(dāng)i = 22,位置為i/i+4時(shí)，連接臂選用化合物1時(shí);PTH(1_34)衍生物的結(jié)構(gòu)如式 (PTH132f)所示：
[0021]
[0022]當(dāng)i = 25,位置為i/i+4時(shí)，連接臂選用化合物1時(shí)；PTH(1_34)衍生物的結(jié)構(gòu)如式 (PTH152f)所示：
[0023]
[0024]當(dāng)i = 26,位置為i/i+4時(shí)，連接臂選用化合物1時(shí)；PTH(1_34)衍生物的結(jié)構(gòu)如式 (PTH162f)所示：
[0025]
[0026] 當(dāng)i = 27,位置為i/i+4時(shí)，連接臂選用化合物1時(shí);PTH(1_34)衍生物的結(jié)構(gòu)如式 (PTH172f)所示：
[0027]
[0028]當(dāng)i = 29，位置為i/i +4時(shí)，連接臂選用化合物1時(shí)；ΡΤΗα-34)衍生物的結(jié)構(gòu)如式 (PTH182f)所示：
[0029]
[0030] 當(dāng)i = 19，位置為i/i+7時(shí)，連接臂選用化合物2時(shí)；ΡΤΗ(1-34)衍生物的結(jié)構(gòu)如式 (PTH212b)所示：
[0031]
[0032]當(dāng)i = 22,位置為i/i+7時(shí)，連接臂選用化合物2時(shí);PTH(1_34)衍生物的結(jié)構(gòu)如式 (PTH222b)所示：
[0033]
[0034]當(dāng)i = 25,位置為i/i+7時(shí)，連接臂選用化合物2時(shí)；PTH(1_34)衍生物的結(jié)構(gòu)如式 (PTH232b)所示：
[0035]
[0036]當(dāng)i = 26,位置為i/i+7時(shí)，連接臂選用化合物2時(shí)；PTH(1_34)衍生物的結(jié)構(gòu)如式 (PTH242b)所示：
[0037]
[0038] 我們發(fā)現(xiàn)，與i/i+7位置的釘合相比，i/i+4位置的釘合更能提高多肽ΡΤΗ(1-34)的 螺旋程度，因此是優(yōu)選方案。在i/i+4位置的釘合中，使用半胱氨酸(Cys)替換ΡΤΗ(1-34) 原肽鏈中C端氨基酸殘基Leul5和Glul9后釘合的構(gòu)象限定多肽PTH082f，以及使用半胱氨酸 (Cys)替換ΡΤΗ(1-34)原肽鏈中C端氨基酸殘基Metl8和Glu22后釘合的構(gòu)象限定多肽 PTH102f，對(duì)多肽ΡΤΗ(1-34)的α-螺旋程度有顯著提高作用，生物活性也有明顯提高。在i/i+ 7位置的釘合中，使用半胱氨酸(Cys)替換ΡΤΗ(1-34)原肽鏈中C端氨基酸殘基Glu22和Gln29 后釘合的構(gòu)象限定多肽PTH222b，相比PTH01生物活性得到了提高。因而這些衍生物都是優(yōu) 選的方案。
[0039]本發(fā)明也提出了上述ΡΤΗ(1-34)衍生物的制備方法，包括以下步驟：
[0040] (1)固相合成相對(duì)于序列ΡΤΗ(1-34)第i和i+4或者i和i+7的位置上的氨基酸用Cys 替換的線性多肽；
[0041] (2)步驟(1)得到的Cys替換的線性多肽與連接臂反應(yīng)成環(huán)，經(jīng)HPLC純化、冷凍干燥 得到所述的ΡΤΗ(1-34)衍生物。
[0042] 步驟(1)中，先將用于多肽合成的樹脂置于固相反應(yīng)器，再將帶保護(hù)的氨基酸單體 按照序列，從C端到N端依次偶聯(lián)，合成帶側(cè)鏈保護(hù)基的線性多肽樹脂，再經(jīng)脫除保護(hù)基、切 斷樹脂、HPLC純化，得到第i和i+4或者i和i+7的位置上的氨基酸用Cys替換的ΡΤΗ(1-34)線 性多肽衍生物；所述的帶保護(hù)的氨基酸單體選自于：Fmoc-Ser(tBu)-〇H，F(xiàn)moc-Val-〇H， Fmoc-Glu(OtBu)-〇H，F(xiàn)moc-Ile-〇H，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-〇H，F(xiàn)moc-Leu-〇H，F(xiàn)moc-Met-〇H，F(xiàn)moc-His(Trt)-〇H,Fmoc-Asn(Trt)-〇H,Fmoc-Gly-〇H,Fmoc-Lys(Boc)-〇H,Fmoc-Arg(Pbf)-〇H, Fmoc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Phe-〇H;
[0043] 步驟(2)中，將步驟（1)中得到的第i和i+4或者i和i+7的位置上的氨基酸用Cys替 換的ΡΤΗ(1-34)線性多肽衍生物置于反應(yīng)容器中，加入適量水使其溶解，然后加入化學(xué)連接 臂，攪拌混勻。最后調(diào)節(jié)PH到9左右。如果渾濁，則加入適量乙腈或水使溶液澄清。蓋玻璃塞， 室溫?cái)嚢璺磻?yīng)l_2h，lh左右時(shí)使用HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)完全后使用制備型HPLC純化，將制備 得到的液體冷凍干燥得ΡΤΗ(1-34)環(huán)化多肽衍生物。
【附圖說(shuō)明】
[0044] 圖1是經(jīng)樣品多肽處理過(guò)的BM-MSCs的CFU-f和ALP陽(yáng)性的面積圖；
[0045]圖2是樣品肽的CD測(cè)試譜圖；
[0046]圖3所示的是樣品多肽的半衰期。