背景技術(shù)：
假病毒顆粒(Pseudovirus particle)也稱模擬病毒，對靶細胞只有一次感染能力，由于不能進行病毒復(fù)制而無法產(chǎn)生新的病毒顆粒，具有很高的安全性；此外，由于假病毒表面表達病毒包膜蛋白可以模擬病毒進入感染細胞，攜帶的報告基因還能實現(xiàn)可視化高通量快速檢測的特點，在高致病性病原微生物的分子生物學(xué)研究、疫苗和藥物效果評價研究中具有重要意義。

目前假病毒包裝系統(tǒng)主要包括兩大類，分別是基于鼠類白血病病毒的反轉(zhuǎn)錄病毒載體的假病毒包裝系統(tǒng)與基于慢病毒載體的假病毒包裝體系。基于慢病毒載體的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)由包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒及轉(zhuǎn)移質(zhì)粒組成。其中，包裝質(zhì)粒表達病毒復(fù)制所需的反式激活蛋白；轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄及整合所需的順式序列，可以在其中插入靶基因或報告基因；包膜質(zhì)粒則可表達異源病毒包膜蛋白。將上述三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細胞，可以獲得僅有一次感染能力且復(fù)制缺陷的模擬病毒或假病毒。

在傳統(tǒng)的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過改造慢病毒載體系統(tǒng)中包裝質(zhì)粒中的病毒復(fù)制元件可實現(xiàn)其安全性；通過修飾轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中的報告基因可以實現(xiàn)模擬病毒的可視化；通過更換包膜質(zhì)?？蓪崿F(xiàn)不同靶標病原的模擬，如：將表達水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)作為包膜質(zhì)粒可以包裝產(chǎn)生VSVG模擬病毒、將表達高致病性流感病毒的血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)作為包膜質(zhì)粒則可以包裝產(chǎn)生高致病性流感模擬病毒、將表達中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus)的棘突蛋白(Spick Protein)S作為包膜質(zhì)?？梢园b產(chǎn)生MERS-CoV模擬病毒。

常見的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒通常只含有一種報告基因，如綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)、紅色熒光蛋白(Red Fluorescent Protein，GFP)、β-半乳糖苷酶(LacZ)或熒光素酶(Luciferase)等。GFP在長波紫外或藍光波長照射下可以發(fā)出綠色熒光，由于檢測時無需抗體、輔因子、酶底物等其它成分，不影響宿主細胞，可視化特點有利于識別活細胞中的蛋白表達，已成為生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的報告蛋白，但由于其激發(fā)后發(fā)射的熒光特異性不夠而難以應(yīng)用于活體成像示蹤監(jiān)測。螢光素酶是自然界中能夠催化底物產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的包括螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase，F(xiàn)luc)和來源于海洋橈腳類動物(Gaussia princeps)的分泌型螢光素酶(Gaussia luciferase，Gluc)。Gluc可以高效分泌至細胞外，不須裂解細胞即可實時檢測，具有高靈敏度，可達到自動化高通量檢測的要求，在細胞內(nèi)感染檢測、藥物篩選、細胞標記和示蹤以及動物活體成像等方面都得到了廣泛的應(yīng)用。

通過構(gòu)建同時表達綠色熒光蛋白和熒光素酶雙報告基因的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，將其與包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細胞，可以獲得攜帶雙報告基因模擬病毒。該研究技術(shù)將GFP和Gluc兩種報告基因優(yōu)勢互補，既能實現(xiàn)熒光顯微鏡下的感染細胞的體外可視化分析，又能實現(xiàn)對感染細胞上清進行熒光強度的實時監(jiān)測和定量分析，將為模擬病毒的可視化追蹤和定量分析提供有力保障。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
構(gòu)建可同時表達綠色熒光蛋白和熒光素酶雙報告基因的慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，并在此基礎(chǔ)上獲得高滴度的雙報告基因模擬病毒，為基于雙報告基因的模擬病毒的可視化追蹤和定量分析提供了有力保障。

附圖說明

圖1為表達雙報告基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝體系的包裝質(zhì)粒pCMV HR’ΔR8.2；轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP以及包膜質(zhì)粒pCMV-VSVG的酶切鑒定結(jié)果。其中，M為λ-EcoT14I digest核酸分子標準；1為經(jīng)過Bam HI和Sal I雙酶切包裝質(zhì)粒pCMV HR’ΔR8.2；2為經(jīng)過Hind III酶切的切轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP；3為使用BamHI酶切包膜質(zhì)粒pVSV-G；4為未經(jīng)過酶切的包裝質(zhì)粒pCMV HR’ΔR8.2；5為未經(jīng)過酶切的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP；6為未經(jīng)過酶切的包膜質(zhì)粒pCMV-VSVG。

圖3為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP轉(zhuǎn)染Huh7-CD81和Huh7細胞后的GFP蛋白表達結(jié)果。其中，圖A為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP轉(zhuǎn)染Huh7-CD81細胞748h后熒光顯微鏡下觀察到的GFP表達即結(jié)果；圖B為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP轉(zhuǎn)染Huh7細胞和48h后熒光顯微鏡下觀察到的GFP表達結(jié)果。結(jié)果顯示，攜帶雙報告基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)?？蓪崿F(xiàn)其在轉(zhuǎn)染細胞中的可視化。

圖4為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP轉(zhuǎn)染Huh7-CD81和Huh7細胞后的Gluc熒光強度分析結(jié)果。其中，圖A為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP轉(zhuǎn)染Huh7-CD81細胞48h后上清檢測到的Gluc熒光素酶活性檢測結(jié)果；圖B為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP轉(zhuǎn)染Huh7細胞48h后上清檢測到的Gluc熒光素酶活性檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，攜帶雙報告基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒可實現(xiàn)其在轉(zhuǎn)染細胞上清中的追蹤檢測和定量分析。

圖5為高滴度雙報告基因模擬病毒包裝流程圖。將包裝質(zhì)粒pCMV HR’ΔR8.2、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP以及包膜質(zhì)粒pCMV-VSVG共轉(zhuǎn)染293FT，48h后收獲上清，獲得雙報告基因可視化模擬病毒VSVpp。

圖6為雙報告基因模擬病毒VSVpp的P24定量分析結(jié)果。通過標準曲線計算雙報告基因可視化模擬病毒VSVpp的P24含量為300ng/ml。

圖7為雙報告基因可視化模擬病毒VSVpp感染A549細胞和Huh7細胞后GFP示蹤分析結(jié)果。其中，圖A為雙報告基因模擬病毒VSVpp感染A549細胞后48h的GFP示蹤分析情況，圖B為雙報告基因模擬病毒VSVpp感染Huh7細胞48h后的GFP示蹤分析情況。模擬病毒VSVpp感染兩種細胞后均能在熒光顯微鏡下直接觀察到GFP的表達。

圖8為雙報告基因可視化模擬病毒VSVpp感染A549細胞與Huh7細胞后Gluc實時監(jiān)測結(jié)果。模擬病毒VSVpp感染兩種細胞后的上清實時監(jiān)測結(jié)果表明分泌型Gluc持續(xù)高水平表達。

具體實施方式：

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。以下實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如《分子克隆實驗指南》(第三版，科學(xué)出版社，2005)等本領(lǐng)域常用工具書中所述的條件，或按試劑生產(chǎn)廠家所建議的條件進行。

實施例1：攜帶GFP和Gluc雙報告基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP的構(gòu)建

1.1gluc-2A-eGFP目的基因的擴增

根據(jù)模板質(zhì)粒pAAVneo-gluc-2A-eGFP序列設(shè)計引物G2GF(ATCACCGGTATGGGAGTCAAAGTTCTG)和G2GR(CGTCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCC)，上下游引物分別引入AgeI和XhoI酶切位點。將引物用無菌水稀釋至10umol/L。PCR反應(yīng)體系：pyrobest DNA聚合酶0.25uL，dNTP(10umol/L)4uL，10X緩沖液5uL，模板5ng，引物各2uL，無菌水補至50uL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性15min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測大小，片段大小預(yù)期為1360bp。

1.2轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA片段純化試劑盒純化后，與載體質(zhì)粒pCS-CG分別經(jīng)AgeI和XhoI雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳后，分別回收片段和載體，4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單克隆進行菌落PCR，PCR陽性克隆經(jīng)HidIII單酶切鑒定，理論上可以得到5031bp、2901bp、584bp和553bp條帶。酶切正確的克隆進行測序分析，獲得表達雙報告基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，命名為pCS-gluc-2A-eGFP，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。

1.3包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大量制備

使用康為世紀質(zhì)粒DNA超級金牌無內(nèi)毒素大提試劑盒操作說明進行三種質(zhì)粒的大量制備：將驗證正確的菌液按照1∶1000比例轉(zhuǎn)接至300ml含有氨芐抗生素的細菌培養(yǎng)基LB中，4℃條件下5000rpm離心15min，收集菌體；加入P1溶液12ml充分重懸，裂解菌體；加入P2溶液12ml溫和混勻，室溫放置3-5min進行堿裂解；加入P3溶液12ml上下混勻，室溫放置5min進行中和；5000rpm離心20min，將上清轉(zhuǎn)移至內(nèi)毒素過濾器進行內(nèi)毒素的去除；于濾過液中加入11ml異丙醇沉淀DNA；并將液體按照15ml/次的量，分三次轉(zhuǎn)移至平衡好的吸附柱中，5000rpm離心5min，富集DNA；向吸附柱中加入PW溶液10ml，5000rpm離心5min進行雜蛋白的洗滌，共洗滌2遍；將吸附柱放回收集管中5000rpm離心10min，倒掉廢液，將吸附柱置于室溫干燥10min，去除殘余的乙醇；最后，將吸附柱放置于新的收集管中，向膜中間位置加入1ml去內(nèi)毒素的洗脫液EB，室溫放置2～5min，5000rpm離心10min，收集質(zhì)粒溶液，-20℃保存。

1.4包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的酶切鑒定

分別使用BamHI和SalI雙酶切包裝質(zhì)粒pCMV HR’ΔR8.2，理論上可獲得6000bp、2000bp、1900bp左右的片段；使用HindIII切轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP，理論上可獲得5031bp、2901bp、584bp和553bp條帶；使用BamHI酶切包膜質(zhì)粒pVSV-G，理論上可獲得6000bp和1553bp條帶。將大提質(zhì)粒和酶切質(zhì)粒進行1％瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖2所示，三個質(zhì)粒均能在預(yù)期大小片段處有明顯條帶，結(jié)果與預(yù)期一致。

1.5轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP轉(zhuǎn)染細胞后的可視化分析

按5×10⁵細胞/孔將Huh7-CD81細胞Huh7細胞接種于六孔板中，次日細胞換液為2ml的Optim-DMEM無血清，將2ug大提的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP與HD轉(zhuǎn)染試劑按照1∶3質(zhì)量-體積比例混勻，室溫避光反應(yīng)15min后慢慢滴加至Huh7-CD81細胞或Huh7細胞中；轉(zhuǎn)染后4～6h換成含2％FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48h后觀察結(jié)果。將Huh7-CD81細胞Huh7細胞在熒光倒置顯微鏡下觀察自發(fā)綠色熒光細胞情況；將細胞培養(yǎng)上清1∶20稀釋，取20uL加入50uLGluc分析底物，使用發(fā)光檢測儀測定其相對熒光強度(Relative Luciferase Unit，RLU)。細胞體外GFP示蹤結(jié)果如圖3所示，Gluc實時監(jiān)測結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，雙報告轉(zhuǎn)移質(zhì)粒可利用GFP和Gluc雙報告基因?qū)崿F(xiàn)其轉(zhuǎn)染細胞后的可視化定量分析。

實施例2：攜帶GFP和Gluc雙報告基因的模擬病毒VSVpp的包裝與生物特性分析

2.1模擬病毒VSVGpp的包裝

將293FT細胞按照5X10⁵cell/孔的量接種6孔板，24h后吸棄細胞培養(yǎng)液，換成1ml無血清無抗生素的Optim-MEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO₂孵箱培養(yǎng)；將包裝質(zhì)粒pCMV HR’ΔR8.2、包膜質(zhì)粒pVSV-G和含雙報告基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-gluc-2A-eGFP按照2∶2∶1質(zhì)量比例3ug與9ul轉(zhuǎn)染試劑HD室溫避光孵育15min后，逐滴加入至293FT細胞進行共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后4～6h換成含2％FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48-72h收上清獲得表達VSV包膜G蛋白的雙報告基因模擬病毒，命名為VSVpp，1000rpm離心5min，用0.45μm濾器過濾，可直接進行后續(xù)實驗或-70℃保存。模擬病毒構(gòu)建流程如圖5所示。

2.2模擬病毒VSVpp的滴定

用BIOMERIEUX的Vironostika HIV-1抗原微量ELISA檢測試劑盒進行P24測定。計算試驗所需的檢測孔數(shù)，每次試驗設(shè)陰性對照3孔，陽性對照5孔，將標準樣品倍比稀釋5個稀釋度。取出包被條5min內(nèi)，每孔加入25ul裂解液，然后依次加入100μl待測樣品及對照，用膠紙封好。37℃孵育60min。洗滌4次，每次浸泡30秒。加入100μl酶標抗體，37℃孵育60min。洗滌4次，每次浸泡30秒。加入100ul底物液，室溫放置30min后加入100ul 1M硫酸終止反應(yīng)，置于酶標儀測定OD₄₅₀或OD_450/630。利用標準樣品制作標準曲線，根據(jù)上清OD值及稀釋度計算p24含量。P24定量標準曲線如圖6所示，測得雙報告基因模擬病毒VSVpp的P24含量為300ng/ml。

2.3模擬病毒VSVpp感染細胞

按1×10⁴細胞/孔將Huh7細胞或A549細胞接種于96孔板，同時設(shè)置對照。24h后，每孔加入50ul模擬病毒；37℃吸附3～4h，每0.5h～1h輕輕搖動3～5次。陰性對照使用無血清培養(yǎng)基替代VSVpp。PBS洗滌3次后換成100uL新鮮的2％FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4模擬病毒VSVpp的示蹤分析

將VSVpp感染的Huh7細胞和A549細胞在熒光倒置顯微鏡下觀察自發(fā)綠色熒光細胞；在感染后3h、6h、9h、12h、20h、26h、32h、48h、60h、72h、84h、86h及120h等不同時間點取細胞培養(yǎng)上清進行1∶20稀釋，然后取20uL加入50uLGluc分析底物，使用發(fā)光檢測儀測定其相對熒光強度RLU。細胞體外GFP示蹤結(jié)果如圖7所示，模擬病毒感染Huh7細胞和A549細胞后48h即可觀察到GFP蛋白的表達，感染陽性率可達80％以上。Gluc實時監(jiān)測結(jié)果如圖8所示，Gluc的表達水平從感染后6h開始檢測到，并在感染后第5天還能檢測到，靈敏度高達10⁶RLU/20ul以上。結(jié)果表明，模擬病毒可利用GFP和Gluc雙報告基因?qū)崿F(xiàn)可視化高靈敏度定量分析。