本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單增李斯特氏菌核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。

背景技術(shù)：

20世紀(jì)90年代以來，以核酸擴增為基礎(chǔ)的基因診斷技術(shù)發(fā)展迅速，在食品領(lǐng)域已應(yīng)用到微生物學(xué)、遺傳學(xué)等多個學(xué)科，動植物檢疫也得到廣泛的應(yīng)用。并逐漸成為出入境口岸檢驗檢疫快速檢測方法之一。而單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（單增李斯特菌）是一種人和動物共患病的病原菌。人畜感染后主要表現(xiàn)為單核細(xì)胞增多、敗血癥和腦膜炎。國內(nèi)使用最普遍的是目的基因片段PCR技術(shù)，而且以實時熒光定量PCR檢測技術(shù)為主。但由于國內(nèi)現(xiàn)在沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各試劑盒采用的標(biāo)準(zhǔn)并不一致，同一工作標(biāo)準(zhǔn)也無法將提取效率等因素考慮周全，這樣就造成同一份樣品不同試劑不同人員操作結(jié)果相差很大，給進(jìn)出口產(chǎn)品檢驗檢疫帶來很大的誤差。要解決單增李斯特菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)化問題，以及檢測單增李斯特菌的快速有效性，需要一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，故研制單增李斯特菌基因組DNA（gDNA）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)勢在必行。本發(fā)明提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能夠發(fā)揮包括鑒定、評價、分析、安全監(jiān)控等用途，為生物特性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供參考價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種單增李斯特氏菌核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，解決單增李斯特菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)化問題，以及檢測單增李斯特菌的快速有效性。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種單增李斯特氏菌核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法，通過高濃度gDNA的提取、gDNA的特征性驗證步驟獲得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

高濃度gDNA的提取方法具體為：

（1）吸取20 mL細(xì)胞培養(yǎng)物至50mL置冰上的離心管；13000-16000g離心5s沉淀細(xì)胞，離心1-2次；用移液槍小心棄去上清液；

（2）吸取10 mL TE與沉淀混合均勻后，13000-16000g離心5s沉淀細(xì)胞，重復(fù)離心1-2次；用移液槍小心棄去上清液；

（3）加入20 mL 細(xì)胞懸浮液，上下吹吸；再加入100 μL 酶裂解溶液，并上下顛倒25下；37℃孵育40min；13000-16000g離心1min沉淀細(xì)胞；移棄上清液；

（4）加入20 mL 細(xì)胞溶解液，并用移液槍上下吹吸，80℃孵育5min溶解細(xì)胞；

（5）加入100μL RNase A液，上下顛倒25次混合；36℃孵育60min；在冰上冷卻孵育1min；加入8mL 蛋白沉淀劑，高速充分的渦旋20s；13000-16000g離心3min，沉淀的蛋白質(zhì)必須形成一個緊密的顆粒，如無將樣本放置冰上孵育5min并重新離心；

（6）吸取20mL異丙醇至一個干凈的50mL的離心管中，并小心吸取上步的上清液混合；輕輕的顛倒混合50次，異丙醇保存于-20℃，取出直接使用；13000-16000g離心1min，管底見白色的顆粒沉淀，棄去上清液，輕輕倒置離心管后用無菌吸水紙將吸干剩余液體，獲得白色的顆粒即為gDNA。

gDNA的特征性驗證方法為：對gDNA中的prfA基因片段進(jìn)行擴增、測序、比對，根據(jù)特征標(biāo)志確定獲得gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

所述的gDNA的特征性驗證方法中采用的引物如下：

鑒定單核細(xì)胞增李氏特氏菌是通過prfA基因的序列分析。

LIP1 5'-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC-3'；

LIP2 5'-GTG TAA CTT GAT GCC ATC AGG-3'。

引物是由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

研制單核細(xì)胞增生李斯特氏菌gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)每瓶含有約1μg的gDNA干粉樣。prfA基因序列在線Blast結(jié)果：Score =507 bits (274), Expect = 2e-140，Identities = 274/274 (100%),Gaps = 0/274 (0%)，Strand=Plus/Minus。gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的A280/A260=1.86。gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在8個月的周期內(nèi)-20℃、4℃、25℃ 3個溫度均能保存較好的穩(wěn)定性，濃度仍然保持在1μg/瓶，gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的0.8%瓊脂糖凝膠電泳和prfA基因擴增均有清晰的目標(biāo)條帶。不確定度評估結(jié)果，當(dāng)檢驗結(jié)果以3次測量值的平均值表示時，其值區(qū)間分布于±0.735 μg/mL之間。

附圖說明

圖1 20瓶gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。M：DNA Ladder Marker；圖上方為抽取樣本的編號。

圖2 20瓶gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)prfA基因擴增1.5%瓊脂糖凝膠電結(jié)果。M：100 bp DNA Ladder Marker；圖上方為抽取樣本的編號。

具體實施方式

實施例1

1.1 菌液培養(yǎng)物制備

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（ATCC33090）凍干菌株復(fù)水后，吸取10μL于20mL胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（TSB-YE）中進(jìn)行復(fù)蘇，36±1℃，220r/min搖床培養(yǎng)18-24h。挑取一環(huán)新鮮菌液劃線于血平板 36±1℃ 培養(yǎng)18-24h ，從血平板上挑取單菌落分別接種到100mL TSB-YE中，36±1℃，培養(yǎng)18-24h。

1.2 高濃度大量gDNA提取

利用液體培養(yǎng)基TSB-YE培養(yǎng)新鮮菌液至濃度達(dá)到2.0×10¹¹cells，利用Puregene Yeast/Bact.Kit B for Purification of Archive-quality DNA from Gram-Positive Bacteria Culture Medium提取gDNA，根據(jù)gDNA純度對提取步驟進(jìn)行改進(jìn)：

（1）吸取20 mL細(xì)胞培養(yǎng)物（約含有2.0×10¹¹ cells）至50mL置冰上的離心管（平行2個離心管）。（2）13000-16000g離心5s沉淀細(xì)胞，觀察沉淀是否緊密，否則重復(fù)離心一次。（3）用移液槍小心棄去上清液。（4）吸取10 mL TE 與沉淀混合后，13000-16000g離心5s沉淀細(xì)胞，觀察沉淀是否緊密，否則重復(fù)離心一次。用移液槍小心棄去上清液。（5）加入20 mL 細(xì)胞懸浮液，上下吹吸。（6）加入100 μL酶裂解溶液，并上下顛倒25下。37℃孵育40min。

（7）13000-16000g離心1min沉淀細(xì)胞。移棄上清液。（8）加入20 mL 細(xì)胞溶解液，并用移液槍上下吹吸，溶解細(xì)胞。80℃孵育5min才能溶解細(xì)胞。（9）加入100μL RNase A 液，上下顛倒25次混合。36℃孵育60min。（10）在冰上冷卻孵育1min。（11）加入8mL蛋白沉淀劑，高速充分的渦旋20s。

（12）13000-16000g離心3min沉淀，沉淀的蛋白質(zhì)必須形成一個緊密的顆粒，假如蛋白質(zhì)顆粒不夠緊的話，將樣本放置冰上孵育5min并重新離心。

（13）吸取20mL 異丙醇至一個干凈的50mL的離心管中，并小心吸取上步的上清液混合。輕輕的顛倒混合50次。異丙醇保存于-20℃，取出直接使用。

（15）13000-16000×g離心1min沉淀。管底可見白色的顆粒沉淀（即為DNA）。

（16）棄去上清液，輕輕倒置離心管后用無菌吸水紙將吸干剩余液體，并確保白色的顆粒仍在管底。

（17）加入30mL 70%乙醇并顛倒數(shù)次清洗DNA顆粒。70%乙醇保存于-20℃，取出直接使用。（18）13000-16000g離心1min沉淀。（19）操作同步驟（16）。

（20）在生物安全柜中靜置，干燥5min左右，并避免過度干燥而導(dǎo)致DNA將難以溶解。

（21）加入8mL DNA溶解液并用中速渦旋5s。65℃孵育1h以溶解DNA。在室溫下孵育，輕輕搖動過夜。確保管帽緊閉，以避免泄漏。

1.3 gDNA濃度及純度測定

應(yīng)用The Picofluor?便攜式熒光儀結(jié)合Picogreen染料對提取的DNA進(jìn)行濃度檢測。選用48502 bp，2 μg/mL的λDNA作為標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)的外標(biāo)準(zhǔn)物。

利用TE buffer 稀釋樣品，使其濃度為100μg /mL。利用超微量核苷酸測定儀對稀釋的gDNA進(jìn)行純度的檢測。

1.4 gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

單增李斯特菌gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備工藝主要是采用濃度均勻的gDNA液進(jìn)行等量的分裝、預(yù)凍、凍干、包裝、特征性基因片段驗證、均勻性測定、短效穩(wěn)定性試驗、長效穩(wěn)定性試驗等環(huán)節(jié)。具體步驟如下：

（1）將儲存在-20℃的gDNA（濃度：100μg /mL，合計40mL ）化凍，置于冰上。

（2）同1.3 步驟方法檢測保存的gDNA液濃度及純度。

（3）利用6×loading buffer，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測gDNA的完整性。10×loading buffer，1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證特性基因prfA基因片段。

（4）將檢測完的gDNA溶液分裝于無菌的0.5mL聚丙烯瓶，10μL/瓶，即1μg/瓶。

（5）將步驟（4）的樣品于-70℃冰箱中預(yù)凍4h，取出后迅速放進(jìn)冷凍干燥機中進(jìn)行凍干；

（6）凍干程序結(jié)束后，將氮氣瓶的接口與凍干機的吸氣口相連接。充進(jìn)氮氣，使聚丙烯瓶也充有氮氣。

1.5單增李斯特菌gDNA特征性片段驗證

prfA基因是編碼單核細(xì)胞增生李斯特氏菌主要毒力因子李氏桿菌溶血素的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。對gDNA中的prfA基因片段進(jìn)行擴增、測序、比對等步驟。本實驗是用高保真HotStar HiFidelity Polymerase擴增prfA基因，送至基因公司測序。

PCR擴增反應(yīng)熱力學(xué)循環(huán)參數(shù)為：

PCR反應(yīng)體系如表1所示。

表1 高保真PCR擴增反應(yīng)體系組成

LIP1 5'-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC-3'；

LIP2 5'-GTG TAA CTT GAT GCC ATC AGG-3'。

PCR擴增結(jié)束后，將兩個PCR反應(yīng)管PCR產(chǎn)物混合，取全部PCR產(chǎn)物約100μL和10μL 10×loading buffer混合電泳。將PCR產(chǎn)物蓋口封膜后送至上海生工進(jìn)行測序。將測序獲得的prfA基因序列進(jìn)行在線BLAST。分析比對結(jié)果是否存在差異。以此作為該gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征標(biāo)志。

1.6 均勻性試驗：從完成制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機抽取20個樣本進(jìn)行檢測，每個樣本測試三次。結(jié)果采用F檢驗統(tǒng)計分析。

1.7 穩(wěn)定性試驗

短期穩(wěn)定性則是模擬不同溫度條件下運輸該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時是否能夠保持足夠的穩(wěn)定。溫度設(shè)定為-20℃、4℃、25℃、60℃ 4個溫度梯度。測定的時間為開始（t=0）、一周后（t=1）、2周后（t=2）、3周后（t=3）、4周后（t=4）、8周后（t=8）。每個溫度梯度每次抽3個樣本，每個樣本每次進(jìn)行三次測量求平均值。

長期穩(wěn)定性是為了觀察該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在－20℃、4℃、25℃、60℃保存條件下是否穩(wěn)定。測定的時間為開始（T=0）、1月后（T=1）、4月后（T=2）、8月后（T=3）。每個溫度梯度每次抽3個樣本，每個樣本每次進(jìn)行三次測量求平均值。

1.8 測量不確定度評估

本部分gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測量不確定度主要是由于PicofluorTM熒光計測量樣品的熒光值所帶來，因此本部分主要考查熒光法測量dsDNA帶來的不確定度。這屬于A類不確定度。

A類不確定度的評估是對觀測列進(jìn)行的統(tǒng)計分析所作評估。.

首先對輸入量xI進(jìn)行n次獨立的相同等精度測量，得到的測量結(jié)果為：

x₁、x₂……x_n

為其算術(shù)平均值,即為：；

單次測量結(jié)果實驗的標(biāo)準(zhǔn)差即為：；

觀測列的平均值即估計值標(biāo)準(zhǔn)的不確定度為；

2實施結(jié)果：單增李斯特氏菌核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

2.1 高濃度的gDNA提取

利用液體培養(yǎng)基TSB-YE培養(yǎng)新鮮菌液至濃度達(dá)到2.0×10¹¹cells，利用Puregene Yeast/Bact.Kit B for Purification of Archive-quality DNA from Gram-Positive Bacteria Culture Medium提取gDNA。測定濃度為284μg/mL，A260/280=1.86。將該gDNA按比例用pH8.0 TE buffer稀釋至100μg/mL，保存至-20℃待用?；蚪M完整性通過電泳，確定無雜帶。

2.2 gDNA的分裝與冷凍干燥

將提取的gDNA液用TE稀釋至100μg/mL，10μL分裝于聚丙烯小管中，每瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含有g(shù)DNA的量為1μg左右。-70℃預(yù)凍4h后進(jìn)行冷凍干燥及填充氮氣。

2.3 gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征性片段驗證

對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品進(jìn)行g(shù)DNA完整性檢驗（0.8%瓊脂糖凝膠電泳）及prfA基因片段進(jìn)行擴增。反應(yīng)產(chǎn)物100μL和10μL 10×loading buffer混合電泳。結(jié)果如圖1和2所示。

2.4 prfA基因的測序峰圖

選擇上述能擴增出約274bp條帶的PCR產(chǎn)物送至基因公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用Chromas打開，測序峰圖信號強，沒有干擾的結(jié)果，清晰可見。

用所設(shè)計的引物將該基因的274個堿基從測序的序列中找出，用FASTA格式表示如下：

>Listeria monocytogenes strain ATCC 7644 positive regulatory factor A gene

TGTAATCTTGATGCCATCAGGAGTTTCTTTACCATACACATAGGTCAGGATTAAAAGTTGACTGCAAATAGAGCCAAGCTTCCCGTTAATCGAAAAATCATTAAATTTAGCTAGGCTGTATGAAACTTGTTTTTGTAGGGTTTGGAAAACATAGAAAAAGTGCGTAAGATTTTTGCTCAGTAGTTCTTTTAGTTCGTTTATTTTGATAACGTATGCGGTAGCCTGCTCGCTAATGACTTCTAAATTATAATAGCCAACCGATGTTTCTGTATCA。

2.5 prfA基因的比對實驗結(jié)果

將測序的結(jié)果以FASTA的格式上傳至http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/進(jìn)行nucleotide blast，數(shù)據(jù)庫選擇nucleotide collection（nr/nt）。其與已知單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ATCC 19113的prfA進(jìn)行比對。經(jīng)過比對分析發(fā)現(xiàn)，該274bp與在線單核細(xì)胞增生李斯特氏菌ATCC19113 prfA基因的相似度達(dá)到100%，274bp全部一樣。Score =507, Expect = 2e-140。由此可以推斷，該gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的具備單核細(xì)胞增生李斯特氏菌特征。符合基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求。

2.6均勻性試驗

均勻性試驗采用方差分析評價樣品的均勻性。方法參照CNAS-GL03:2006《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》要求，利用熒光值法對同一個樣品測定3次，并進(jìn)行方差分析。

表2 方差分析結(jié)果

通過上述的方差分析計算結(jié)果，F值為1.522，F(xiàn)臨界值F_{0.05（19，40）}=1.853 計算的，該值＜ F 臨界值，這表明在0.05 顯著性水平時，樣品中的gDNA含量是均勻的。

2.7 穩(wěn)定性試驗

2.7.1 短期穩(wěn)定性

實驗室模擬不同的溫度運輸環(huán)境下該gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性，主要考察4℃、25℃、60℃ 3個溫度梯度。測定的時間為開始（t=0）、一周后（t=1）、2周后（t=2）、3周后（t=3）、4周后（t=4）、8周后（t=8），共持續(xù)8周。每個溫度梯度每次抽3個樣本，每個樣本每次進(jìn)行三次測量求平均值。而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的完整性及特征基因擴增則是將每個時間點的全部溫度下的gDNA一起驗證。將上述測定的gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度繪制成曲線，從曲線上可以直觀的看出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20℃條件下保存條件下8周之內(nèi)均能穩(wěn)定在1.00μg//瓶的水平。

通過數(shù)理統(tǒng)計分析gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性和瓊脂糖凝膠電泳分析該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的完整性，可知，t檢驗分析該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20℃、4℃、25℃ 3個溫度梯度下保存8周均能保持穩(wěn)定性，每瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)gDNA含量在1.00μg左右。0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20℃、4℃、25℃ 3個溫度梯度下保存8周能保持基因組的完整性。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌gDNA特征基因prfA擴增結(jié)果顯示，保存在-20℃、4℃、25℃ 3個溫度梯度下8周能完整擴增出prfA基因。而在60℃高溫下保存該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，經(jīng)過熒光法測定結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在60℃高溫下保存1周后只剩0.1μg左右的dsDNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，該溫度下gDNA基本上已經(jīng)降解成小片段，但是prfA特征基因仍然能夠擴增出來，條帶清晰，說明gDNA在60℃保存條件下斷裂的片段大于274bp，還能保證特征基因的存在。

2.8 長期穩(wěn)定性：

長期穩(wěn)定性是為了觀察該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20℃、4℃、25℃、60℃保存條件下是否穩(wěn)定，保存時間一般持續(xù)2年，但是由于實驗開始至今約9個月，所以長期穩(wěn)定性實驗先做前8月的數(shù)據(jù)。測定的時間點為開始（T=0）、1月后（T=1）、4月后（T=4）、8月后（T=8）。每個溫度梯度每次隨機抽3個樣本，記下抽取的編號，對每個樣本每次進(jìn)行三次測量求平均值，然后進(jìn)行t檢驗。檢驗的結(jié)果。和短期穩(wěn)定性一樣，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的完整性及特征基因擴增則是將每個時間點的全部溫度下的gDNA一起驗證。

gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-20℃、4℃、25℃ 3個溫度梯度下保存8個月能保持基因組的完整性。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌gDNA特征基因prfA擴增結(jié)果顯示，保存在-20℃、4℃、25℃ 3個溫度梯度下8個月均能能完整擴增出prfA基因。而在60℃高溫下保存該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，經(jīng)過熒光法測定結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在60℃高溫下保存1周后只剩0.1μg左右的dsDNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，該溫度下gDNA基本上已經(jīng)降解成小片段，但是經(jīng)過長達(dá)8個月的高溫保存，prfA特征基因仍然能夠擴增出來，條帶清晰，說明gDNA在60℃保存條件下8個月后標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的基因片段仍然有大于274bp的片段，還能保證特征基因的存在。

2.9 不確定度評價結(jié)果

準(zhǔn)備30個含有100μL濃度約為500ng/mL gDNA原液離心管，然后往離心管中加入100μL的水合的PicoGreen工作試劑。充分混合在室溫避光孵育2-5min。然后應(yīng)用The Picofluor?便攜式熒光儀經(jīng)行濃度測定，每次測試讀3次數(shù)，將其平均值作為分析的結(jié)構(gòu)，現(xiàn)將測定平均值結(jié)果列至表3。

表3 The Picofluor?便攜式熒光儀讀數(shù)測定結(jié)果

為其算術(shù)平均值,即為：；

單次測量結(jié)果實驗的標(biāo)準(zhǔn)差即為：；

觀測列的平均值即估計值標(biāo)準(zhǔn)的不確定度為；

當(dāng)檢驗結(jié)果以3次測量值的平均值表示時，其值區(qū)間分布于±0.735 ng/mL之間。這個取值區(qū)間適合于任何一次測量。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心

<120> 一種單增李斯特氏菌核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatacagaaa catcggttgg c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgtaacttg atgccatcag g 21