專利名稱：應(yīng)用單鏈dna適體檢測單核增生李斯特氏菌的方法
應(yīng)用單鏈DNA適體檢測單核增生李斯特氏菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病原菌的檢測方法，尤其涉及一種應(yīng)用單鏈DNA適體檢測單核增 生李斯特氏菌的方法。
背景技術(shù)：
單核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是一種人畜共患病的病原菌， 人感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。它在自然界中廣泛存在，不易被凍 融，能耐受較高的滲透壓，在4°C的環(huán)境中仍可生長繁殖，食品中存在的單核增生李斯特氏 菌對人類的健康安全具有危險(xiǎn)，我國將其列為21世紀(jì)對中國人衛(wèi)生健康具有重大影響的 12種病原微生物之一。傳統(tǒng)的檢測方法需要反復(fù)增菌、菌落分離及生化和血清學(xué)鑒別實(shí) 驗(yàn)，成本高、步驟復(fù)雜，耗時(shí)長。隨著指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligandsby exponential enrichment, SELEX)技術(shù)的興起，一種新的能特異性檢測靶分子 的技術(shù)手段已成為可能。適體(aptamer) —詞源于拉丁語aptus即to fit,意為“適合”，又稱為適配子，它 是從一個(gè)體外合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫中通過SELEX過程篩選到的與靶分子特異性結(jié)合 的小分子DNA或RNA片段。它具有庫容量大、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。目 前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于許多靶分子的篩選，如蛋白質(zhì)、核苷酸、氨基酸、有機(jī)物，甚至金屬 離子。但將病原微生物作為靶分子篩選的相關(guān)報(bào)道甚少?；谏鲜鲈颍旧暾埲嗽凇妒称房茖W(xué)》上刊登了名為“單核增生李斯特氏菌適體 的篩選與結(jié)構(gòu)分析”的文章，其揭露了采用SELEX技術(shù)對體外合成的78個(gè)堿基的隨機(jī)DNA 文庫進(jìn)行篩選而獲得與單核增生李斯特氏菌具有高親和力特異性結(jié)合的單鏈DNA適體群 的方法，并公開了組成該適體群其中32個(gè)單鏈DNA適體的堿基序列，為適體的后續(xù)研究奠 定一定的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種應(yīng)用單鏈DNA適體檢測單核增生李斯 特氏菌的方法，不僅步驟簡單、判定標(biāo)準(zhǔn)明確，而且耗時(shí)短、效率高、成本相對較低。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的一種應(yīng)用單鏈DNA適體檢測單 核增生李斯特氏菌的方法，一種應(yīng)用單鏈DNA適體檢測單核增生李斯特氏菌的方法，其特 征在于同時(shí)設(shè)定實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組和陽性對照組，具體操作如下步驟100 實(shí)驗(yàn)組A.在含有單鏈DNA適體的第一試管中加入500 μ L選擇緩沖液后置于95°C溫度 下加熱變性，加熱變性5min后于冰塊中進(jìn)行冰浴lOmin，且其中單鏈DNA適體的量限定為 20-35 μ L ；B.取待檢增菌液于第一離心管中，并將其置于離心設(shè)備上進(jìn)行離心分層，且該待檢增菌液的量限定為500-1000 μ L ；
C.將經(jīng)過B步驟處理的第二離心管中的沉淀層與經(jīng)過A步驟處理的第一試管中的 溶液進(jìn)行均勻混合，并將該混合液置于室溫下放置30min ；空白對照組重復(fù)實(shí)驗(yàn)組A步驟后將第一試管于室溫下放置30min ；陰性對照組重復(fù)實(shí)驗(yàn)組的A、B、C步驟，且在B步驟中，將待檢增菌液換成非目的 菌的菌液；陽性對照組重復(fù)實(shí)驗(yàn)組的A、B、C步驟，且在B步驟中，將待檢增菌液換成目的菌 的菌液，即單核增生李斯特氏菌菌液；步驟200 將所述的實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組和陽性對照組分別進(jìn)行如下 操作把步驟100中所得的混合液移入第二離心管中，并將第二離心管置于離心設(shè)備上 進(jìn)行高速離心使混合液分層；再加入100 μ L用抗地高辛抗體標(biāo)記的堿性磷酸酶進(jìn)行反應(yīng)， 且該用抗地高辛抗體標(biāo)記的堿性磷酸酶是經(jīng)過選擇緩沖液稀釋的，稀釋倍數(shù)為15000倍；步驟300 將所述的實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組和陽性對照組分別進(jìn)行如下 操作待步驟200的反應(yīng)進(jìn)行IOmin后，將第二離心管再次進(jìn)行高速離心分層；離心結(jié)束 棄上清液后再加入500 μ L選擇緩沖液，通過震蕩攪拌使第二離心管內(nèi)混合液懸?。徊襟E400 將所述的實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組和陽性對照組分別進(jìn)行如下 操作將步驟300所得的懸浮夜進(jìn)行高速離心分層；離心結(jié)束后棄上清液，并將沉淀移 入第二試管，重復(fù)洗滌第二離心管三次，且每次的洗滌液移入第二試管；接著往第二試管中 加入100 μ L對硝基苯磷酸鹽溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色反應(yīng)30min后加入100 μ L 2mol/L NaOH使該反應(yīng)終止；步驟500 將各組顯色反應(yīng)終止后的溶液分別采用酶標(biāo)儀于405nm波長下進(jìn)行吸 光度測定若實(shí)驗(yàn)組測定所得的吸光度值介于空白對照組和陰性對照組測定所得的吸光度 值之間，則實(shí)驗(yàn)組的待檢增菌液中不含單核增生李斯特氏菌；若實(shí)驗(yàn)組測定所得的吸光度 值介于陰性對照組和陽性對照組測定所得的吸光度值之間、或大于陽性對照組測定所得的 吸光度值，則實(shí)驗(yàn)組的待檢增菌液中含單核增生李斯特氏菌。進(jìn)一步地，所述選擇緩沖液的配方為在ImL Tween-20的溶液中加入IOOOmL已滅 菌的PBS，且該P(yáng)BS的pH值是7. 4。進(jìn)一步地，所述非目的菌為沙門氏菌。本發(fā)明應(yīng)用單鏈DNA適體檢測單核增生李斯特氏菌的方法的有益效果在于不僅 步驟簡單、判定標(biāo)準(zhǔn)明確，而且耗時(shí)短、效率高，是一種快速方便的檢測方法

下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。圖1是本發(fā)明應(yīng)用單鏈DNA適體檢測單核增生李斯特氏菌的方法中實(shí)驗(yàn)組的流程 圖。
具體實(shí)施方式請參閱圖1，本發(fā)明應(yīng)用單鏈DNA適體檢測單核增生李斯特氏菌的方法同時(shí)設(shè)定 實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組和陽性對照組，其具體操作如下步驟100 實(shí)驗(yàn)組 A.在含有單鏈DNA適體的第一試管中加入500 μ L選擇緩沖液后置于95°C溫度 下加熱變性，加熱變性5min后于冰塊中進(jìn)行冰浴lOmin，且其中單鏈DNA適體的量限定為 20-35 μ L ；B.取待檢增菌液于第一離心管中，并將其置于離心設(shè)備上進(jìn)行離心分層， 其離心速度可設(shè)為12000r/min，離心時(shí)間設(shè)為lOmin，且所述待檢增菌液的量限定為 500-1000 μ L；C.將經(jīng)過B步驟處理的第二離心管中的沉淀層與經(jīng)過A步驟處理的第一試管中的 溶液進(jìn)行均勻混合，并將該混合液置于室溫下放置30min ；空白對照組重復(fù)實(shí)驗(yàn)組A步驟后將第一試管于室溫下放置30min ；陰性對照組重復(fù)實(shí)驗(yàn)組的A、B、C步驟，且在B步驟中，將待檢增菌液換成非目的 菌的菌液，在本實(shí)施例中采用沙門氏菌作為非目的菌；陽性對照組重復(fù)實(shí)驗(yàn)組的A、B、C步驟，且在B步驟中，將待檢增菌液換成目的菌 的菌液，即單核增生李斯特氏菌菌液；步驟200 將所述的實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組和陽性對照組分別進(jìn)行如下 操作把步驟100中所得的混合液移入第二離心管中，并將第二離心管置于離心設(shè)備上 進(jìn)行高速離心使混合液分層；再加入100 μ L用抗地高辛抗體標(biāo)記的堿性磷酸酶進(jìn)行反應(yīng)， 且該用抗地高辛抗體標(biāo)記的堿性磷酸酶是經(jīng)過選擇緩沖液稀釋的，稀釋倍數(shù)為15000倍；步驟300 將所述的實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組和陽性對照組分別進(jìn)行如下 操作待步驟200的反應(yīng)進(jìn)行IOmin后，將第二離心管再次進(jìn)行高速離心分層；離心結(jié)束 棄上清液后再加入500 μ L選擇緩沖液，通過震蕩攪拌使第二離心管內(nèi)混合液懸??；步驟400 將所述的實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組和陽性對照組分別進(jìn)行如下 操作將步驟300所得的懸浮夜進(jìn)行高速離心分層；離心結(jié)束后棄上清液，并將沉淀移 入第二試管，重復(fù)洗滌第二離心管三次，且每次的洗滌液移入第二試管；接著往第二試管中 加入100 μ L對硝基苯磷酸鹽溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色反應(yīng)30min后加入100 μ L 2mol/L NaOH使該反應(yīng)終止；步驟500 將各組顯色反應(yīng)終止后的溶液分別采用酶標(biāo)儀于405nm波長下進(jìn)行吸 光度測定若實(shí)驗(yàn)組測定所得的吸光度值介于空白對照組和陰性對照組測定所得的吸光度 值之間，則實(shí)驗(yàn)組的待檢增菌液中不含單核增生李斯特氏菌；若實(shí)驗(yàn)組測定所得的吸光度 值介于陰性對照組和陽性對照組測定所得的吸光度值之間、或大于陽性對照組測定所得的 吸光度值，則實(shí)驗(yàn)組的待檢增菌液中含單核增生李斯特氏菌。其中，步驟200、步驟300、步驟400中所涉及的高速離心，其離心速度均可設(shè)為13000r/min，離心時(shí)間均可設(shè)為IOmin ；本方法中的選擇緩沖液的配方為在ImL Tween-20的溶液中加入IOOOmL已滅菌的PBS，且該P(yáng)BS的pH值是7. 4。 本發(fā)明應(yīng)用單鏈DNA適體檢測單核增生李斯特氏菌的方法與傳統(tǒng)的檢測方法相 比，不僅步驟簡單、判定標(biāo)準(zhǔn)明確，而且耗時(shí)短、效率高、成本相對低，是一種快速方便的檢 測方法。
權(quán)利要求
一種應(yīng)用單鏈DNA適體檢測單核增生李斯特氏菌的方法，其特征在于同時(shí)設(shè)定實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組和陽性對照組，具體操作如下步驟100實(shí)驗(yàn)組A.在含有單鏈DNA適體的第一試管中加入500μL選擇緩沖液后置于95℃溫度下加熱變性，加熱變性5min后于冰塊中進(jìn)行冰浴10min，且其中單鏈DNA適體的量限定為20 35μL；B.取待檢增菌液于第一離心管中，并將其置于離心設(shè)備上進(jìn)行離心分層，且該待檢增菌液的量限定為500 1000μL；C.將經(jīng)過B步驟處理的第二離心管中的沉淀層與經(jīng)過A步驟處理的第一試管中的溶液進(jìn)行均勻混合，并將該混合液置于室溫下放置30min；空白對照組重復(fù)實(shí)驗(yàn)組A步驟后將第一試管于室溫下放置30min；陰性對照組重復(fù)實(shí)驗(yàn)組的A、B、C步驟，且在B步驟中，將待檢增菌液換成非目的菌的菌液；陽性對照組重復(fù)實(shí)驗(yàn)組的A、B、C步驟，且在B步驟中，將待檢增菌液換成目的菌的菌液，即單核增生李斯特氏菌菌液；步驟200將所述的實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組和陽性對照組分別進(jìn)行如下操作把步驟100中所得的混合液移入第二離心管中，并將第二離心管置于離心設(shè)備上進(jìn)行高速離心使混合液分層；再加入100μL用抗地高辛抗體標(biāo)記的堿性磷酸酶進(jìn)行反應(yīng)，且該用抗地高辛抗體標(biāo)記的堿性磷酸酶是經(jīng)過選擇緩沖液稀釋的，稀釋倍數(shù)為15000倍；步驟300將所述的實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組和陽性對照組分別進(jìn)行如下操作待步驟200的反應(yīng)進(jìn)行10min后，將第二離心管再次進(jìn)行高速離心分層；離心結(jié)束棄上清液后再加入500μL選擇緩沖液，通過震蕩攪拌使第二離心管內(nèi)混合液懸??；步驟400將所述的實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組和陽性對照組分別進(jìn)行如下操作將步驟300所得的懸浮夜進(jìn)行高速離心分層；離心結(jié)束后棄上清液，并將沉淀移入第二試管，重復(fù)洗滌第二離心管三次，且每次的洗滌液移入第二試管；接著往第二試管中加入100μL對硝基苯磷酸鹽溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色反應(yīng)30min后加入100μL 2mol/L NaOH使該反應(yīng)終止；步驟500將各組顯色反應(yīng)終止后的溶液分別采用酶標(biāo)儀于405nm波長下進(jìn)行吸光度測定若實(shí)驗(yàn)組測定所得的吸光度值介于空白對照組和陰性對照組測定所得的吸光度值之間，則實(shí)驗(yàn)組的待檢增菌液中不含單核增生李斯特氏菌；若實(shí)驗(yàn)組測定所得的吸光度值介于陰性對照組和陽性對照組測定所得的吸光度值之間、或大于陽性對照組測定所得的吸光度值，則實(shí)驗(yàn)組的待檢增菌液中含單核增生李斯特氏菌。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用單鏈DNA適體檢測單核增生李斯特氏菌的方法，其特征在 于所述選擇緩沖液的配方為在ImL Tween-20的溶液中加入IOOOmL已滅菌的PBS，且該 PBS的pH值是7. 4。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用單鏈DNA適體檢測單核增生李斯特氏菌的方法，其特征在 于所述非目的菌為沙門氏菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用單鏈DNA適體檢測單核增生李斯特氏菌的方法，同時(shí)設(shè)定實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組和陽性對照組，各組經(jīng)過變性、離心分層、顯色及吸光度測后，對實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果進(jìn)行判定獲得最終檢測結(jié)果。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于不僅步驟簡單、判定標(biāo)準(zhǔn)明確，而且耗時(shí)短、效率高、成本相對較低。
文檔編號C12Q1/68GK101949929SQ20101027481
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日 公開號201010274816.發(fā)明者江樹勛, 繆亭玉, 邵碧英, 陳彬, 陳文炳 申請人:福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 被以下專利引用 (1),