李斯特氏菌的生物控制方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用來控制李斯特氏菌增殖的方法，其不包括應用于人體或動物體的處理方法，其特征在于其使用Willaertia?magna種的原生動物，并且還涉及含有這種原生動物的消毒劑。
【專利說明】李斯特氏菌的生物控制方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及李斯特氏菌（Listeria)，特別是單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes)的生物控制的新方法，并且還涉及用來控制單核細胞增生李斯特氏菌增殖 的新型組合物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 單核細胞增生李斯特氏菌是一種屬于李斯特氏菌科的革蘭氏陽性細菌。在人體 中，這種細菌造成預后通常致命的李斯特氏菌?。?0)。在幸存者中，經(jīng)常觀察到嚴重的后 作用。病原菌可以跨過腸屏障和胎盤屏障，隨后能夠引起胎兒或新生兒感染，或引起早產(chǎn)。 單核細胞增生李斯特氏菌還是神經(jīng)侵入性感染的主要原因，并且在過去的幾年里愈發(fā)普遍 (5) (10)。因此，監(jiān)測并預防李斯特氏菌病愈加成為重要的當務之急。
[0004] 單核細胞增生李斯特氏菌是具有普遍傳播和分布的細菌：它存在于土壤、水中，作 為植物上的附生菌存在等。它對于清潔消除處理具有很高的抗性，因此它能夠存活于例如 食品加工業(yè)的生產(chǎn)裝置中，或者例如空調(diào)或配水管網(wǎng)中。
[0005] 通常，盡管這種細菌具有醫(yī)學意義，但關(guān)于李斯特氏菌的生態(tài)學的知識仍然相對 有限（1)。然而，已知單核細胞增生李斯特氏菌在環(huán)境中具有普遍的分布（15)，因為這種 細菌已經(jīng)從土壤中、從污水或工業(yè)廢水中分離（4)，這是其與自生生活阿米巴蟲共有的特 性。此外，單核細胞增生李斯特氏菌抵抗人巨噬細胞破壞的能力使得某些科學家能夠通過 與由寄生菌和阿米巴蟲宿主之間的關(guān)系而獲得的知識作類比而提出如下假設：這種致病 性細菌可以抵抗環(huán)境中的自生生活阿米巴蟲（6)。因此，Ly和MUller已經(jīng)提出，李斯特 氏菌可以抵抗自生生活阿米巴蟲（6,9)。當這些作者證實單核細胞增生李斯特氏菌能夠 在屬于棘阿米巴（Acanthamoeba)屬的自生生活阿米巴蟲的存在下增殖時（9)(6)，這些假 設可以得到驗證。此外，已經(jīng)證明了單核細胞增生李斯特氏菌對阿米巴蟲宿主的細胞毒性 作用，因為當阿米巴蟲與病原菌共培養(yǎng)時觀察到了棘阿米巴屬的包囊形成（6,9)。Zhou等 人也已經(jīng)表明，單核細胞增生李斯特氏菌具有抵抗自生生活卡式棘阿米巴（Acanthamoeba castellanii)阿米巴蟲的能力（16)。還已經(jīng)證明，單核細胞增生李斯特氏菌能夠在阿米巴 蟲包囊形成或細胞溶解期間釋放的生物材料存在的情況下生長（1)。這種觀察的作者提出， 這些因素可以對李斯特氏菌提供在環(huán)境中維持和/或增殖的有利條件（1)。由Pushkareva 和Ermolaeva進行的其他觀察已經(jīng)使得能夠證明，在另一種自生生活原生動物（梨形四膜 蟲（Tetrahymena pyriformis))中，單核細胞增生李斯特氏菌實際上被內(nèi)化（11)。單核細 胞增生李斯特氏菌對梨形四膜蟲的侵染誘導該原生動物的包囊形成（11)。由這些研究者獲 得的數(shù)據(jù)還表明，在這些原生動物包囊中內(nèi)化的單核細胞增生李斯特氏菌保持存活，保持 其毒力且能夠在動物模型中引起感染（11)。
[0006] 因此清楚地表明，自生生活原生動物和阿米巴蟲通過促進單核細胞增生李斯特氏 菌在環(huán)境中的維持和生長以及通過促進細菌的毒力性狀的出現(xiàn)而構(gòu)成其重要的生態(tài)學元 素。此外，李斯特氏菌感染原生動物和在其包囊形式中存活的能力（11)有力地表明，原生 動物是促進李斯特氏菌對目前采用的殺生物處理的抗性的因素。事實上，阿米巴蟲包囊事 實上對目前采用的化學和/或物理殺生物處理展現(xiàn)出極強的抗性（7,8，14)。目前用來預 防李斯特菌風險的殺生物處理是不能令人滿意的，因為除了細菌本身固有的抗性發(fā)生（12， 13)外，存在于原生動物內(nèi)和生物膜中的細菌（2)相對受到保護，并且因此繼續(xù)增殖/定植 于其環(huán)境。
[0007] 在這樣的背景下，本發(fā)明人已經(jīng)完全出人意料地證明，阿米巴屬Willaertia magna消滅單核細胞增生李斯特氏菌。該殺生物效果進一步得到已經(jīng)證實的Willaertia magna捕食可以作為單核細胞增生李斯特氏菌載體的其他阿米巴劑的能力而增強。
[0008] 發(fā)明概沭
[0009] 因此，首先，本發(fā)明的一個主題是用來控制李斯特氏菌，特別是單核細胞增生李斯 特氏菌增殖的方法，其使用Willaertia magna屬的原生動物。根據(jù)本發(fā)明的方法不包括應 用于人體或動物體的處理方法。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，最常見的是用Willaertia magna 屬，并且特別是Willaertia magna種的原生動物處理氣體或液體流。
[0010] 為了本發(fā)明的目的，術(shù)語"李斯特氏菌"旨在指代任何李斯特氏菌的種，并且特別 是單核細胞增生李斯特氏菌。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的方法可以特別地用于衛(wèi)生用水或工業(yè)用水配水管網(wǎng)、工業(yè)廠房的冷 卻回路、或空調(diào)網(wǎng)絡的消毒，或者用作表面消毒劑。原生動物可以直接添加到于待處理的管 道或網(wǎng)絡中循環(huán)的水或液體中。還可能將其噴射（例如在水溶液的形式中，作為氣溶膠） 在工業(yè)網(wǎng)絡、煙囪和廠房中以及在待消毒的工業(yè)表面上。
[0012] 有利地，在本發(fā)明的情況中使用的原生動物對應于2006年8月21日以保藏號 PTA7824保藏在ATCC的株系，或?qū)?006年8月21日以保藏號PTA7825保藏在ATCC 的株系，這兩種株系已經(jīng)以法國國家科學研究中心（Centre National de la Recherche Scientifique，CNRS，3rue Michel Ange_75794Paris Cedexl6/France)和里昂 1 克勞德貝 爾納大學（Universit6 LyonlClaude Bernard，43Boulevard dullNovembrel918_69622Vil leurbanne Cedex/France)的名義被保藏。
[0013] 對應于以保藏號PTA7824保藏在ATCC的株系或以保藏號PTA7825保藏在ATCC的 株系的屬于Willaertia屬的原生動物是本發(fā)明的主要部分。所述保藏的株系PTA7824和 PTA7825還被描述在PCT國際申請W02008/043969的公開中。
[0014] 這種原生動物因此可以被用在消毒劑中，特別被用來消除李斯特氏菌，特別是單 核細胞增生李斯特氏菌，以及用來控制李斯特氏菌病的擴散和污染。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的一個主題是含有Willaertia屬，特別是 Willaertia magna種的原生動物的消毒劑。優(yōu)選的是對應于以保藏號PTA7824保藏在ATCC 的株系或以保藏號PTA7825保藏在ATCC的株系的原生動物。有利地，根據(jù)本發(fā)明的消毒劑 為水性溶液或懸浮液（例如在蒸餾水中）的形式。所述消毒劑可以是可噴射的形式（例如 作為氣溶膠）或任何其他的應用方式。
[0016] 本發(fā)明人通過將單核細胞增生李斯特氏菌在用作阿米巴蟲模型的棘阿米巴屬和 哈曼屬（Hartmannella)中的復制與其在Willaertia阿米巴蟲屬中觀察到的復制作比較， 證實了 Wi 11 aert ia屬，特別是Wi 11 aert ia magna種的原生動物抑制單核細胞增生李斯特 氏菌增殖的活性。
[0017] 鑒于阿米巴蟲在李斯特氏菌，特別是單核細胞增生李斯特氏菌在外部環(huán)境下的增 殖和維持中所起的關(guān)鍵作用（由于沒有人際傳播，李斯特氏菌，特別是單核細胞增生李斯 特氏菌在外部環(huán)境下的增殖和維持是作為李斯特氏菌病的流行病學條件的因素），根據(jù)本 發(fā)明的方法和消毒劑在成本、效率以及特別是環(huán)境友好性方面具有許多優(yōu)點。
[0018] 下文中的實施例使得可能對本發(fā)明進行說明而不是對其進行限制。
[0019] 附圖簡要說明
[0020] 圖1顯示哈曼屬、棘阿米巴屬和Willaertia屬阿米巴蟲在以10的阿米巴蟲/細 菌初始比率與單核細胞增生李斯特氏菌共培養(yǎng)后的相應群體的自發(fā)演化。
[0021] 如在材料和方法一節(jié)中描述的，將各種自生生活阿米巴蟲以10的比率（10個細菌 /1個阿米巴蟲）與單核細胞增生李斯特氏菌共培養(yǎng)（時間0小時）。隨后在所述共培養(yǎng)后 的每3小時采集細胞懸浮液的等分試樣，并通過臺盼藍拒染試驗和使用馬氏（Malassez)室 的顯微鏡觀察的方式來確定活阿米巴蟲的百分比。數(shù)據(jù)表示為在臺盼藍拒染試驗陰性的活 細胞的百分數(shù)。
[0022] 圖2顯示在與各種阿米巴蟲屬（包括Willaertia屬）共培養(yǎng)中獲得的單核細胞 增生李斯特氏菌生長的對比動力學。
[0023] 將各種自生生活阿米巴蟲以10的比率（10個細菌/1個阿米巴蟲）單獨與單核細 胞增生李斯特氏菌進行共培養(yǎng)（時間〇小時）。隨后在共培養(yǎng)后的每3小時采集細胞懸浮 液的等分試樣，并如在材料和方法一節(jié)中描述的來確定單核細胞增生李斯特氏菌的濃度。
[0024] 圖3顯示W(wǎng)illaertia magna對由單核細胞增生李斯特氏菌形成的生物膜的殺 生物效果。該圖還顯示出自生生活卡式棘阿米巴蟲（Acanthamoeba castellanii)和 Hartmannella vermiformis阿米巴蟲缺乏效果。
[0025] 將單核細胞增生李斯特氏菌接種到TSA瓊脂上，其在30°C下溫育48小時以確保在 瓊脂上形成致密的細菌生物膜。隨后，將重懸浮于l〇〇yL無菌去離子水中的1X10 5阿米 巴蟲（卡式棘阿米巴蟲，A 圖；Hartmannella vermiformis，B 圖；Willaertia magna，C 和 D 圖）接種在瓊脂的中心。在30°C下24小時后，在顯微鏡下檢查瓊脂以確定阿米巴蟲的外觀 和后者對生物膜的影響。A :白色箭頭顯示由在單核細胞增生李斯特氏菌（L.m.)存在下卡 式棘阿米巴蟲形成的包囊群體的外觀。應該注意到在阿米巴蟲包囊群體周圍不存在細菌層 溶解斑。B :注意到存在Hartmannella vermiformis的多種包囊形式，其中的一些實例由白 色箭頭指示。還注意到Hartmannella vermiformis包囊周圍極高密度的單核細胞增生李 斯特氏菌以及完全不存在細菌生物膜溶解斑。C:Willaertia magna對由單核細胞增生李 斯特氏菌形成的生物膜的效應。白色箭頭指示位于生物膜溶解斑前方的Willaertia magna 營養(yǎng)體的群體。注意到在Willaertia magna群體的上游不存在細菌膜（由顯微照片左下 角的白色圓圈劃定的區(qū)域）以及在阿米巴蟲群體下游的致密細菌膜（以首字母L.m.表示） (顯微照片右上角）。D :另一顯微照片，顯示形成由單核細胞增生李斯特氏菌形成的生物膜 的溶解斑。注意到Willaertia magna的群體和細菌生物膜溶解斑的前部（用白點指示）。
[0026] 發(fā)明詳沭
[0027] 1.材料和方法
[0028] 1. 1 #用的株系:
[0029] 單核細胞增生李斯特氏菌：使用的菌株是CL3970菌株（Oxoid，法國）。
[0030] -將其以每周一次傳代的速率維持在TSA (胰蛋白胨大豆瓊脂）（參考號P05012， Oxoid，法國）上。該菌株以寬劃線在TSA板上接種，并在30°C下溫育2天。
[0031] -阿米巴蟲：使用的株系屬于三種不同的阿米巴蟲種：
[0032] 〇 Hartmannella vermiformis
[0033] 〇卡式棘阿米巴蟲（Acanthamoeba castellanii)，以保藏號30010保藏在ATCC 的株系。
[0034] 〇 Willaertia magna (以保藏號 PTA7824 和 PTA7825 保藏在 ATCC 的株系）。
[0035] 將這三種株系在10%胎牛血清存在下，在SCGYEM培養(yǎng)基（血清酪蛋白葡萄糖酵母 提取物培養(yǎng)基）上進行無菌培養(yǎng)，以每管3ml的比例分配到Falcon_ K管（3033)內(nèi)。在維持 中，每8-9天對營養(yǎng)體形式進行傳代。對于共培養(yǎng)，采用3-4天的傳代培養(yǎng)以使得具有剛好 處于指數(shù)生長期的營養(yǎng)體。
[0036] 如下獲得SCGYEM培養(yǎng)基：
[0037] > 酪蛋白（Merck 1.02244.010) 10 g > Na2HP04 1.325 g > KH2P〇4 0.8 g > 葡萄糖 2.5 g > 酵母提取物（Difco 0127-17-9) 5 g > 蒸餾水 900 ml > 胎牛血清 100 ml
[0038] 將2. 5ml的NaOH(lN)、隨后Na2HP04和KH2P04添加到900ml的蒸餾水中。在熱板 上微微加熱混合物，然后在磁力攪拌下逐步添加酪蛋白。在酪蛋白溶解后，加入葡萄糖和酵 母提取物。
[0039] 在完全溶解后，混合物相繼在玻璃纖維（Sartorius SM6513400)以及ΙμΜ膜 (Whatman7190004)上過濾。隨后將培養(yǎng)基等分到玻璃瓶內(nèi)。所述瓶在高壓釜中在120°C下 滅菌20分鐘。在對培養(yǎng)基進行最后使用和分配之前，在層流凈化罩下將胎牛血清以10%最 終體積的比例無菌地加入。
[0040] 1. 2單核細朐增牛李斯特氐菌的單阿米巴蟲共培養(yǎng)
[0041] 1. 2. 1細菌接種體的制各：
[0042] 單核細胞增生李斯特氏菌在無菌蒸餾水中的懸浮液由在TSA上的2天培養(yǎng)物制 備，從而在550nm下獲得1光密度單位，即濃度為10 9CFU(菌落形成單位）/ml。
[0043] 1.2. 2講行單阿米巴蟲共培養(yǎng)
[0044] 在含有3ml高壓滅菌水的細胞培養(yǎng)管（Falcon? 3033)中進行共培養(yǎng)。由預先傾 斜在馬氏血球計上的無菌阿米巴蟲懸浮液，以1X105阿米巴蟲/ml的比例進行管的接種。 單核細胞增生李斯特氏菌對阿米巴蟲的侵染通過將單核細胞增生李斯特氏菌/阿米巴蟲 比率固定為10 (即1X 1〇6細菌/ml溫育培養(yǎng)基）來進行。緊接在侵染之后，將共培養(yǎng)管低 速（760g，10分鐘）離心，以促進阿米巴蟲和細菌之間的接觸。10分鐘后，將管手動再懸浮， 并以傾斜的體位在培養(yǎng)箱中30°C下溫育。
[0045] 共培養(yǎng)中的阿米巴蟲和單核細胞增生李斯特氏菌的最終結(jié)果通過下述方式確 定：
[0046] 在細菌侵染后監(jiān)測共培養(yǎng)物9小時。在每個時間間隔（每3小時），在渦旋劇烈攪 拌以使得阿米巴蟲從壁上脫落后，對共培養(yǎng)管進行采樣并從阿米巴蟲的方面和細菌的方面 進行檢查。對每個被檢查的管：
[0047] -在馬氏室（Malassez cell)上直接計數(shù)阿米巴蟲。
[0048] -通過在Eppendorf微管中以無菌蒸饋水連續(xù)10倍稀釋后使培養(yǎng)基直接涂布在 TSA上來確定單核細胞增生李斯特氏菌的濃度。各稀釋物以100 μ L每板的比例一式三份涂 布在TSA上。該板隨后在30°C下溫育至少48小時。在涂板后24小時，通過計數(shù)集落來進 行TSA的第一次讀數(shù)；隨后在第二天進行第二次讀數(shù)以確認。單核細胞增生李斯特氏菌的 濃度以CFU/mL溫育培養(yǎng)基來表示，考慮到稀釋因子且假定各個菌落對應于最初存在于稀 釋懸浮液中的一個細菌。
[0049] 對于各個阿米巴蟲屬，單核細胞增生李斯特氏菌生長曲線作為時間的函數(shù)表示。
[0050] 另外，單核細胞增生李斯特氏菌對各種阿米巴蟲的種的可能細胞毒性作用通過下 述方式確定：
[0051] ?對在臺盼藍拒染試驗中陽性的阿米巴蟲的比例進行計算。在顯微鏡下通過在馬 氏室中計數(shù)臺盼藍陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)來完成該試驗；
[0052] ?確定在單核細胞增生李斯特氏菌存在下阿米巴蟲變成包囊化的傾向。
[0053] 1· 3Willaertia magna對單核細胞增牛.李其斤特氏菌牛.物膜的影口向
[0054] 單核細胞增生李斯特氏菌的生物膜通過以下方式形成：將在100yL無菌水中的 預定量的單核細胞增生李斯特氏菌沉積和涂布在TSA上。在30°C下將瓊脂放置48小時，以 允許在所述瓊脂的全部表面上產(chǎn)生致密而均一的細菌膜。然后，使IX 1〇5的阿米巴蟲（卡 式棘阿米巴蟲、Hartmannella vermiformis或Willaertia magna)沉積在瓊脂的中心，其 在30°C下放置24小時。隨后在光學顯微鏡（放大倍率X400)下對瓊脂進行觀察，以便檢 測其中可能的細菌層溶解斑的形成。
[0055] 2.結(jié)果
[0056] 2. lWillaertia magna表現(xiàn)，出對單核細胞曾牛.李其斤特氏菌的抗.件
[0057] 通過臺盼藍拒染試驗確定單核細胞增生李斯特氏菌對各種被測試的阿米巴蟲種 的存活率的影響。在將卡式棘阿米巴蟲與細菌共培養(yǎng)后，很快地在該阿米巴蟲物種中出現(xiàn) 了嚴重的細胞毒性效應，在3小時的共培養(yǎng)后存活力下降了?50% (參見圖1)。相反地， 當將Willaertia magna與單核細胞增生李斯特氏菌共培養(yǎng)時，根本未觀察到這一現(xiàn)象，包 括在長達9小時的溫育下存活力保持接近100% (圖1)。類似于Willaertia magna,自 生生活Hartmannella vermiformis阿米巴蟲未表現(xiàn)出由臺盼藍拒染試驗確定的任何存活 力的下降（圖1)。然而，用顯微檢查阿米巴蟲-單核細胞增生李斯特氏菌的共培養(yǎng)物表明 Hartmannella vermiformis和存活形式的卡式棘阿米巴蟲具有強烈的包囊形成傾向（參 見表1)。當將Willaertia magna與該病原菌共培養(yǎng)時，在Willaertia magna中根本未觀 察到這一包囊形成現(xiàn)象（表1)。
[0058] 表1 :單核細胞增生李斯特氏菌對各種自生生活阿米巴蟲種中誘導包囊形成的影 響
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 用來控制單核細胞增生李斯特氏菌增殖的方法，其不包括應用于人體或動物體的處 理方法，其特征在于其使用Willaertia屬的原生動物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用Willaertia屬，特別是Willaertia magna種的原生動物處理氣體或液體流或者處理固體表面。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述原生動物對應于以保藏號 PTA7824保藏在ATCC的株系，或?qū)谝员２靥朠TA7825保藏在ATCC的株系。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于其被實施用來進行衛(wèi)生用水或 工業(yè)用水配水管網(wǎng)、工業(yè)廠房的冷卻回路、或空調(diào)網(wǎng)絡，或任何工業(yè)表面的消毒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其特征在于其被實施用來控制水管內(nèi)或可 能與人或動物的食品接觸的表面上生物膜的形成。
6. 含有Willaertia屬，特別是Willaertia magna種的原生動物的消毒劑作為李斯特 氏菌殺生物劑的用途，其不包括應用于人體或動物體的處理的用途。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述原生動物對應于以保藏號PTA7824保 藏在ATCC的株系，或?qū)谝员２靥朠TA7825保藏在ATCC的株系。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的用途，其特征在于其為水性溶液或懸浮液的形式。
【文檔編號】A61L9/00GK104093313SQ201280059480
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月2日
【發(fā)明者】F·普拉松, S·博德納克 申請人:阿莫巴